Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат)

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. Каразіна

ГІСІНА ІРИНА ЛЕОНІДІВНА

УДК 043:577.214:578.81

Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази
різних штамів віруса грипу Н9N2

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертаціі на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені
В. Н. Каразіна МОН (Харків, Україна).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Перський Євген Ефроїмович,

Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна МОН, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор

Петров Сергій Анатолійович,

Одеський національний університет

ім. І. І. Мечнікова МОН,

професор кафедри біохімії

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН
України, відділ білкової інженерії та біоінформатики

Захист відбудеться 06.03 2007 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д.64.051.17 Харківського національного
університету

ім. В.Н. Каразіна МОН за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.
Ш-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна МОН за
адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи. 4.

Автореферат розісланий 06.02. 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Грип – широко розповсюджене вірусне захворювання
тварин та людини, що призводить до серйозних ускладнень та часто
закінчується смертю хворого. Характерна особливість грипу – періодичне
повторення епідемій, що можуть переростати в пандемії і охоплювати
величезні території.

Такий характер хвороби є результатом високої швидкості эволюції вирусів
грипу. Одна з найважливіших причин цього – сегментованість їхнього
геному, що може спричинити реасортацію генів за умов комбінованної форми
інфекції, коли організм хазяїна інфікований одночасно різними підвидами
вірусу. В такому випадку виникають нові варіанти збудника, проти яких
населення не має імунного захисту [Perrish C.R. et al., 2005; Lewis
D.B., 2006]. Значна мінливість вірусів грипу сприяє їхньому широкому
розповсюдженню, високому епідемічному потенціалу та здібності змінювати
хазяїв, навіть далеких систематично один від одного [Perrish C.R. et.
Al, 2006].

Одним з найактуальніших питань сьогодні є перехід вірусу грипу від
птахів до ссавців і, в першу чергу, до людей. Реальна можливість цього
вперше була описана в 1997 та 1999 роках, коли в Гонконзі спостерігалися
випадки захворювання декількох людей, викликані вірусами пташиного
гриппу двох серотипів – Н5N1 та Н9N2. Таким чином, зараз в природі
циркулюють мінімум два варіанти вірусів пташиного грипу, що здібні до
переходу на людину [ Guo Y. et al., 1999, Guan Y. et al., 2000; Lin Y.
P. et al., 2000].

На сьогодні, в результаті сезонних міграцій диких птахів, а також
завдяки індустріалізації птахівництва та широкому розповсюдженню його
продуктів, небезпечний для людей вірус Н5N1 поширився по величезних
територіях в Азії, Європі, Америці та на Близькому Сході. Його знайдено
і на території України, в Криму. Наразі від вірусу цього серотипу
загинуло вже біля 90 человік з тих 170, що захворіли [Olsen B., Munster
V.J.,Walltnsten A. et al, 2006] Вірус Н9N2 менш патогенний для птахів,
ніж Н5N1. Крім того, відомо лише про 2 випадки захворювання, що
пов’язані з ним, серед людей [Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.V. et al.,
1999: Lin Y. P., Shaw M., Gregory V., 2000]. Але, зважаючи на постійні
еволюційні зміни, що мають місце, цей вірус уособлює сьогодні таку ж
потенційну загрозу, як декілька років тому вірус Н5N1.

Найбільш важливу роль в процесі інфікування відіграють
структурно-функціональні властивості поверхневих білків вірусу грипу –
гемаглютиніну (HА) та нейраміниідази (NА), антигенні властивості яких
покладено в основу класифікації вірусів грипу. Саме за допомогою цих
білків вірус адсорбується на клітинах організму хазяїна і здійснює
проникнення в них. Крім того, саме ці білки є основними мішенями для
системи імунного захисту хазяйського організму від вірусів.

Еволюційні зміни структури поверхневих білків вірусу лежать в основі
цілого спектру змін біологічних властивостей вірусів. Так, зміни їх
первинної будови в області антигенних детермінант, навіть не дуже
суттєві на перший погляд, можуть вплинути на ефективність захисту
організма хазяїна від вірусної інфекції. Структура та властивості цих
білків, а також разні варіанти їхніх сполучень, можуть визначати
вірулентність та патогенність вірусів. Нарешті, сама можливість переходу
віруса грипу від птахів до ссавців, в тому числі й до людини, залежить
від характера структурних змін цих білків в ході еволюції віруса.

Але особливостям молекулярної еволюції NА i НА та їх генів у віруса Н9N2
до останнього часу приділялось мало уваги порівняльно з вірусом Н5N1.
Саме це не дозволяло оцінити належним чином ступінь потенційної
небезпеки вірусу Н9N2 для людей.

В зв’язку з тим, що сказано, актуальним є вивчення молекулярних
механізмів структурно-функціональної мінливості NА, НА та їх генів, що
має місце в процесі еволюції вірусу Н9N2, та спроба пов’язати їх із
здібністю цього вірусу змінювати хазяїна – переходити від птахів до
ссавців, зокрема і до людини.

Ці дослідження важливі як для з’ясування загальних молекулярних
процесів, що лежать в основі еволюції вірусів грипу, так і для
прогнозування та виявлення потенційно найбільш епідемічних і патогенних
різновидів вірусу грипу. Такий прогноз, що стосується, зокрема,
антигенних особливостей білків, які вивчаються, може бути корисним для
розробки стратегії ефективної вакцинації населення, основаної на виборі
найбільш відповідних вірусних штамів, а також методів лікування
захворювання, коли воно вже виникло.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
на кафедрі біохімії Харківського національного університету імені В.Н.
Каразіна в рамках держбюджетних тем “Фізіолого-біохімічні і
структурно-функціональні механізми адаптації біологічних систем до
екстремальних чинників довкілля в онтогенезі” (№ держреєстрації
0100U003268) та “Закономірності фізіолого-біохімічної та
структурно-функціональної адаптації біологічних систем до несприятливих
факторів середовища в онтогенезі” (№ держреєстрації 0103U005734).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи – виявити особливості
молекулярної еволюції вірусу грипу Н9N2, що сприяють можливості його
переходу від птахів до ссавців.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

Визначити нуклеотидні послідовності РНК в ділянках генів HА і NА, а
також первинну структуру відповідних областей цих білків, що
відповідають за їх функціональні власивості, для різних ізолятів вірусу
грипу Н9N2, отриманих в птахівничих господарствах Ізраіля у курей,
індиків, гусей, страусів в період епізоотії 2000 – 2004 років.

Вивчити швидкість, ступінь та константи зв’язування НА у цих штамів
вірусу грипу Н9N2 з клітинами ссавців та птахів in vitro.

Дослідити температурну залежність ферментативної активності NA у цих
штамів вірусу грипу Н9N2 in vitro.

Встановити можливу кореляцію між різницею функціональної активності HА
та NА і особливостями їхніх первинних структур у цих штамів вірусу грипу
Н9N2, а також виявити еволюційні зміни, що можуть в найбільшій мірі
сприяти переходу вірусу від птахів до ссавців.

На основі вивчених первинних структур побудувати еволюційне дерево цих
штамів вірусу грипу Н9N2 та виділити в ньому штами, які потенційно
найбільш здібні переходити до ссавців.

Об’єкт дослідження – зв’язок між еволюційними змінами первинної
структури РНК в генах HА та NА і структурно-функціональними
властивостями цих білків.

Предмет дослідження – нуклеотидні послідовності РНК, амінокислотні
послідовності HА і NА, їхні адсорбційнi, ферментативні та антигенні
властивості, еволюційні зв’язки між штамами вірусу грипу Н9N2.

Методи дослідження – полімеразна ланцюгова реакція – ПЛР, электрофорез в
агарозному гелі, секвенування ДНК і визначення амінокислотних
послідовностей НА та NА, методи виміру функціональних властивостей цих
білків (реакції гальмування гемаглютинаційної та нейрамінідазної
активностей, визначення швидкості адсорбції і коефіцієнту зв’язування
вірусу з моношаровою культурою клітин нирок собаки і курячими
еритроцитами, спектрофотометричне визначення питомої активності вірусної
NА), побудова еволюційного дерева штамів вірусу грипу Н9N2.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначені первинні
структури ділянок генів HА і NА та відповідні їм амінокислотні
послідовності, що обумовлюють функціональні властивості цих білків, які
були вилучені з 61 штаму вірусу грипу птахів H9N2 на протязі
епідемічного спалаху цієї хвороби в 2000 – 2004 р.р. На підставі
отриманих даних проведено систематичне дослідження молекулярних
механізмів еволюції вірусу H9N2 за 4-річний період.

Показано, що еволюція вірусу грипу в ході епізоотії йшла не шляхом
поступових змін від первісного варіанту до кінцевого, а шляхом появи
ряда форм, що відрізняються як одна від одної, так і від початкового
варіанту.

Вперше показано зв’язок між конкретними мутаціями в нуклеотидному складі
генів HА і NА, відповідними амінокислотними змінами та функціональною
активністю цих білків – швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на
клітинах і температурним оптимумом дії NА.

Отримані дані вперше демонструють структурно-функціональні властивості
молекул HА та NА, що відіграють вирішальну роль у взаємодії збудника
хвороби та хазяїна і дозволяють вірусу грипу птахів H9N2 переходити в
резервуар ссавців.

Вперше описано варіанти вірусу H9N2, які є найбільш відповідними
кандидатами для переходу на ссавців, в тому числі і на людей.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. З теоретичної
точки зору, отримані результати доповнюють сучасні уявлення про
молекулярні засади еволюції вірусів грипу та є важливими для розуміння
процесів, що дозволяють вірусам переходити від птахів до ссавців.
Зокрема, вони розкривають зв’язок між мутаційними змінами в генах та
структурно-функціональними властивостями білків, відповідальних за
взаємодію віруса з клітинами хазяїв, що належать до різних систематичних
груп організмів. Отримані дані дозволяють також розробити молекулярні
критерії можливості різних варіантів вірусу пташиного грипу переходити
на ссавців та людей.

Практичне значення результатів дисертаційної роботи полягає насамперед в
тому, що вони можуть бути корисними для передбачення появи нових штамів
вірусу грипу з підвищеною здібністю інфікувати організм людини. Дані про
еволюційні зміни первинної структури та антигенні властивості
поверхневих білків вірусу можуть бути використані для планування і
прискорення створення нових вакцин, а саме, для рекомендації вибору
нових вірусних штамів, що можуть забезпечити максимальну захисну реакцію
організму тварин та людини від грипу. Отримані результати
використовуються в навчальному процесі під час викладання спецкурсів
“Фізіологічні і біохімічні основи адаптації”, “Молекулярні основи
імунології” та “Молекулярні механізми еволюції” на біологічному
факультеті Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Відповідно до поставлених мети та задач
роботи, автором самостійно виконано запланований обсяг експериментальних
досліджень, розрахунки еволюційних відношень досліджених штамів вірусу
грипу, аналіз наукової літератури, зроблена статистична обробка
фактичного матеріалу.

Планування напрямків досліджень та інтерпретацію отриманих результатів
проведено сумісно з науковим керівником. Ізоляцію вірусів та оцінку
їхньої патогенності було проведено сумісно зі співробітниками
Ветеринарного інституту Кимрона (Бейт-Даган, Ізраїль), що відображено в
спільних публікаціях. В дисертації не використані ідеї чи розробки, які
належали б співавторам опублікованих наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та
обговорювались на ХIII Конгресі всесвітньої ветеринарної асоціації
домашніх птахів (Денвер, Колорадо, 2003 р.); щорічному з’їзді
Ізраїльського товариства мікробіологів (Тель-Авів, 2003 р.); ХІІ
Міжнародному конгресі імунологів і ІV щорічній Конференції імунологів
(FOCIS) (Монреаль, Канада, 2004 р.); науковій Конференції, присвяченій
70-річчю кафедри генетики і цитології Харківського національного
університету ім. В. Н. Каразіна (Харків, 2004 р.); V Інтернаціональному
симпозіумі по захворюванням птахів (Берлін, Німеччина, 2004 р.);
IX Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць,
серед яких 6 статей у журналах та 8 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів
результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків та
списку літератури (з 194 джерел). Робота викладена на 144 сторінках
друкованого тексту і містить 18 малюнків та 26 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на 61 штамі вірусу
грипу H9N2, що були виділені у птахівничих господарствах Ізраіля в
період епізоотії 2000 – 2004 р.р. Референтні штами пташиного
{ty/wisconsin-66 – (H9N2)} та людських {Singapore/57 – (H2N2) і Hong
Kong/68 (H3N2)} вірусів грипу були люб’язно надані доктором Скехелом
[Dr. Skehel, World Influenza Center, National Institute for Mеdical
Reserch, Mill Hill, London].

Для ізоляції вірусів 9–10-денні ембріони курей інфікували шляхом
введення культури віруса (1 мл трахеальних та клоакальних змивів в
гліцерофосфатному буфері, рН 7,2) в алантоїсну порожнину. Через 48–96
годин після зараження алантоїсну рідину відбирали, аліквотували,
перевіряли на присутність антигену, заморожували та зберігали при – 800
С.

Патогенність вірусів оцінювали за індексом смертності (IVPI) курчат
віком 6 тижнів після внутрішньовенного введення вірусу методом,
рекомендованим ОІЕ [Office International des Epizootiеs, 2000].

Функціональні властивості HА та NА вивчали у вірусів, що були отримані
на початку, в середині та в кінці епізоотії і порівнювали їх з
властивостями цих білків у референтних вірусів.

Антигенні властивості HА визначали за допомогою реакції гальмування
гемаглютинації (РГГА). Визначення проводили в 1% суспензії курячих
еритроцитів, що містила 4 аглютинаційні одиниці (АО) антигену, за
допомогою набору референтних антисироваток до 15-ти серотипів HА (Н1 –
Н15) и 9-ти серотипів NА (NA1 – NA9) за методом, який рекомендовано ВООЗ
[Douwdal W.A. et al., 1979]. Антисироватки були надані доктором
Вебстером [Dr. Webster, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis,
USA].

Про рецепторні властивості HА робили висновки згідно з реакцією
гемаглютинації, яку проводили в двох варіантах – на моношаровій культурі
клітин нирок собаки (МDCK) та на еритроцитах курей.

Клітини МDCK отримували з клітинного банку АТСС (American Type Culture
Collection) і культивували в середовищі МЕМ (Minimum Essential Medium) з
10% ембріональною сироваткою теляти. В разі еритроцитів використовували
їхню 15% суспензію та алантоїсну рідину з титром не менш, ніж 1:128
[Rivetz R., Lipkind M., 1985].ступінь адсорбції вірусу оцінювали за
зміною титру гемаглютинації в пробах, які відбирали з інтервалами 15
хвилин для клітин МDCK та 2 хвилини -для курячих еритроцитів при 40С.

Розраховували час адсорбції 50% вірусу на клітинах ( t50% ) , константу
ії швидкості (К – тангенс початкового кута нахилу кінетичної кривої
адсорбції) та за методом Скетчарда [Dupuis G., Clairoux-Moreau S., 1980]
– константу зв’язування (Кб=[Сv ? Cc] /[Сv] ? [Cc], де [Сv ? Cc] –
питомий вміст комплексів клітина-вірус, Сv і Cc – питомий вміст вільних
вірусу та клітин відповідно).

Ферментативну активність NА при 150, 250, 370, 420 і 560С оцінювали за
ступенем гідролізу нею субстрата – фетуїна та виражали в одиницях
оптичної густини при ? = 549 нм [ Palmer D.F. et al, 1975]. На підставі
отриманих даних розраховували константу Міхаеліса Km

Реакцію гальмування активності NА (РГNА) проводили за методом,
рекомендованим ОІЕ, в рівних об’ємах вірусовмісних рідин – алантоїсній
рідині та антинейрамінідазній антисироватці.

Вірусну РНК виділяли з алантоїсної рідини за допомогою набору mini kit
Viral RNA фірми QIAGEN, Valencia, Calif. і використовували для
клонування ДНК в ПЛР. В реакціях ПЛР для ділянок нуклеотидних
послідовностей, що дозволяють ідентифікувати підтипи HА та NА вірусів
грипу, було використано 2 набори праймерів: 15 пар (Н1f – Н15f, Н1r –
Н15r) для HА и 9 пар (1Nf – 9Nf, 1Nr – 9Nr) для NА [Lee M.-S. et al,
2001]. Праймери були сконструйовані в лабораторії молекулярної
вірусології (Kimron Veterenary Institute, Beit Dagan, Israel).

Продукти реакції розділяли методом електрофорезу в агарозному гелі,
вирізали відповідні ділянки, очищали за допомогою набору фірми QIAGEN,
Valencia, Calif. і секвенували .

Відтворення амінокислотних послідовностей за відповідними їм
нуклеотидними та статистичний аналіз результатів проводили за допомогою
комп’ютерної програми Bio Edit Package, Version 5
[www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.,1997]. Еволюційні дерева будували за
програмою PHYLIP (Phylogeny Inference Package, Version 3,6) [www.
evolution. genetics. washington. edu/ phylip., 2000]. В цих розрахунках
використовували також взяті з генного банку послідовності NА і HА 23
вірусів грипу птахів, ссавців, в тому числі людини, які були вилучені в
період 1979 – 1999 років.

Статистичну обробку даних біохімічних досліджень проводили
використовуючи критерій Стьюдента та непараметричний критерій
Вілкоксона-Манна-Уітні [Иванов Ю. И., Погорелюк О. Н., 1990].

Результати досліджень та їх обговорення

Еволюція структурно-функціональних властивостей НА. Про функціональні
властивості HА можна судити за швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на
клітинах – мішенях. На рис. 1 зображені часові залежності ступеню
зв’язування 6 штамів вірусу грипу H9N2 (включаючи референтний штам
ty/wisconsin-66) на культурі клітин собаки МDCK та курячих эритроцитах,
а в табл.1 наведені розраховані згідно з цими кривими константи
швидкості, часи адсорбції 50% вірусу на різних клітинах та константи
зв’язування його з різними клітинами.

Як видно, для всіх досліджених штамів швидкість і ступінь адсорбції
вірусів на курячих еритроцитах набагато вищі, ніж на клітинах MCDK. На
16-у хвилину віруси всіх штамів повністю пов’язуються з першими, в той
час як на других ступінь адсорбції навіть за 90 хвилин не досягає 100%.

Але в обох випадках характер адсорбції референтного та інших вивчених
штамів суттєво розрізняються. Швидкість та ступінь адсорбції
референтного віруса на клітинах курки вищі, а на клітинах собаки –
нижчі, ніж всіх інших вірусів. Це свідчить про те, що в процесі еволюції
вірусу Н9N2 в період з 1966 по 2004 р. його спорідненість до клітин
птахів зменшилась, а до клітин ссавців – зросла.

В той же час, як видно, ці зміни спорідненості в період 2000 – 2004 р.р.
за своїм характером не є регулярними. Так, у штама, що був ізольований в
травні 2000 р, адсорбція на клітинах собаки більш інтенсивна, ніж у
штамів, ізольованих в січні та травні 2004 р. Значення констант
адсорбції на цих клітинах у штама, ізольованого в січні 2003 р.,
вірогідно нижча, ніж у штама, ізольованого в липні цього ж року і т.ін.
(Табл. 1). Це свідчить, що єдиний процес – наближення спорідненості
пташиного віруса H9N2 до рецепторів клітин ссавців здійснюється
звичайним шляхом – в результаті диференційної еволюції мутантних форм,
що виникають безперервно.

Цілком природно, що в основі цього процесу лежать мутації в генах HА,
які змінюють його первинну структуру, та, відповідно, функціональні
властивості.

Приєднання вірусу грипу до клітини можливе тільки після активації HА
шляхом розщеплення його молекули тканинними протеазами хазяїна в сайті
розщеплення – між 326 і 330 амінокислотними залишками, і взаємодією
клітинного рецептора з рецептор-зв’язуваючою ділянкою HА – поміж
амінокислотними залишками у позиціях 98 – 228.

Різна кінетика адсорбції, що знайдена у досліджених штамів, може
вказувати на те, що в процесі еволюції вірусу виникли структурні
відмінності – або в сайтах розщеплення, або в рецептор-зв’язуваючих
сайтах, або в тих та інших

Для підтвердження існування таких замін і з’ясування їх характеру для
всіх штамів, ізольованих на протязі епізоотії 2000 – 2004 р.р., а також
референтного штаму вірусу птахів, на основі вивчення відповідних
нуклеотидних послідовностей порівнювали поміж собою первинну структуру
обох ділянок.

Таблиця 1

Константи швидкості (К), часи 50% – ної адсорбції (t50%) та константи
зв’язування (Кб)

штамів вірусу пташиного грипу H9N2 на клітинах МDCK та курячих
еритроцитах

Штам вірусу,

дата ізоляції Клітини MDCK Еритроцити курки

К, % /хв. t50%, хв. Кб К, %/хв t50%, хв. Кб

ty/wisconsin-66, 1966 1,33+

0,15 43,5+

3,8 0,024±

0,006 39,57+

4,22 1,2+

0,08 2,70±

0,33

ty/90710/, 30.05.2000 3,68*+

0,32 15,0*+

1,7 0,090*±

0,010 26,31*+

1,98 1,8+

0,20 1,18*±

0,21

ty/615/, 30.01.2002 2,02*+

0,18 35,5*+

2,9 0,037±

0,008 30,82+

3,12 2,2*+

0,24 0,48*±

0,05

ty/965/, 17.03.2002 2,02*+

0,22 35,5*+

3,2 0,037±

0,007 21,18*+

2,32 2,4*+

0,22 0,55*±

0,06

сh/1373/, 14.07.2003 4,12*+

0,46 11,5*+

0,9 0,530*±

0,060 21,18*+

1,95 2,8*+

0,21 0,15*±

0,02

ty/1562/, 28.12.2003 2,97*+

0,25 17,0*+

1,5 0,060*±

0,009 21,18*+

2,23 2,8*+

0,19 0,15*±

0,02

ty/1747/, 15.05.2004 2,97*+

0,25 17,0*+

1,6 0,060*±

0,009 21,18*+

1,95 2,8*+

0,30 0,15*±

0,02

Примітка* – вірогідно відносно референтного штаму (р < 0,05). В кожній з них на протязі епізоотії відбулося по дві амінокислотні заміни – в рецептор-зв’язуваючому сайті в позиціях 190 і 226, а в сайті розщеплення – в позиціях 326 і 329. В таблиці 2, згідно з хронологичним порядком, наведені амінокислотні заміни, що були знайдені. Як бачимо, хоча в рецептор-зв’язуваючому сайті частоти зустрічальності Ала в позиції 190 і Лей в позиції 226 вищі частот зустрічальності Глу і Глн в цих позиціях, обидві заміни досить рівномірно розсіяні по дослідженим штамам вірусу і не мають регулярного характеру на протязі епізоотії. В сайті розщеплення, навпаки, заміни амінокіслот в позиціях 327 і 329 мають відверто регулярний, спрямований характер (Табл. 3). Для з’ясування зв’язку між цими замінами і функціональними властивостями HА проведено співставлення первинних структур сайтів розщеплення та відповідних усереднених показників кінетики адсорбції. Таблиця 2 Амінокислотні залишки в позиціях 190 і 226 рецептор-зв’язуючого сайту HA штамів вірусу пташиного грипу H9N2 Позиція Амінокис-лотний залишок Число штамів % штамів Дата ізоляції 190 Глу 18 30 30.05.2000р., 20.01.2002 р., 30.01.2002р., 10.02.2002р., 14.02.2002р, 05.03.2002 –19.04.2002 р., 22.12.2002 – 21.01.2003 р., 02.04.2003 р., 30.10.2003 р., 09.01.2004 р. – 190 Ала 43 70 23.05.2000 р. –25.12.2001 р., 30.01.2002 р., 03.02.2002 р., 17.02.2002 р., 11.12.2002 р., 24.02.2003 р., 02.04.2003 р., 06.04.2003 р. – 14.07.2003р., 21.11.2003р. – 06.01.2004 р., 13.01.2004 р. – 15.05. 2004 р. 226 Глн 23 38 30.05.2000р., 20.01.2002р., 14.02.2002р, 05.03.2002 – 19.04.2002р., 22.12.2002 – 24.02.2003 р., 02.04.2003 р., 06.04.2003 р., 13.04.2003 р., 10.07.2003 р., 22.12.2003 р., 28.12.2003 р., 09.01.2004 р., 15.05.2004 р. 226 Лей 38 62 23.05.2000 р. -25.12.2001 р., 30.01.2002 р. – 10.02.2002 р., 17.02.2002 р., 11.12.2002 р., 02.04.2003 р., 06.04.2003 р., 20.04.2003 р.- 26.05.2003 р., 14.07.2003 р. – 08.12.2003 р., 24.12.2003 р., 28.12.2003 р.. 31.12.2003 р. – 06.01.2004 р., 13.01.2004 р., 14.01.2004 р., 15.05.2004 р. В позиції 327 знаходиться єдина заміна – Вал ? Арг, за якою референтний штам відрізняється від усіх інших штамів H9N2. В результаті цієї заміни спорідненість вірусів до клітин ссавців, порівняльно з референтним вірусом, суттєво зросла, а до клітин птахів знизилась (Табл. 4). Усі інші заміни у штамів, ізольованих на протязі епізоотії, відбулись в позиції 329, причому в хронологічному порядку вони мають практично регулярний характер: Сер ? Асн ? Ліз ? Сер. В період 05.2000 – 12.2001 р. штами, що мали в позиції 329 Сер та Асн, становили відповідно 3,3% та 4,9% від усіх штамів. З 12.2001 по 04.2003 р. відбулась заміна Сер на Ліз, і штами з Ліз становили 37,7%; з 02.2003 р. їх почали виштовхувати штами з Сер в цій позиції (54,1%). З 11.2003 р. і до кінця епізоотії виявляються лише ці штами. Таблиця 3. Амінокислотні залишки в позиціях 327 і 329 сайту розщеплення HA у штамів вірусу грипу H9N2 Позиція Амінокислот- ний залишок Число штамів % штамів Дата ізоляції 327 Вал 1 100 1966 г., референтний вірус 327 Арг 61 100 30.05.2000-15.05.20004 р., усі штами 329 Сер 1 100 1966 р., референтний вірус 329 Сер 2 3,3 23.05.2000-30.05.2000 р., епізоотія 329 Асн 3 4,9 07.12.2001 р., епізоотиія 329 Ліз 23 37,7 19.12.2001.-21.01.2003 р., 02.04., 30.10.2003 р., епізоотія 329 Сер 33 54,1 24.02.03- 15.05.04 р., епізоотія Таким чином, усі штами, що вивчались, можемо розділити на дві групи – “ранні”, з різними амінокислотами в позиції 329, та “пізні”, у яких в цій позиції відбулось повернення до Сер. При цьому, як видно, у всіх “пізніх” штамів спорідненість до клітин МDCK вища, ніж до курячих еритроцитів. Така зміна функціональних властивостей HА пояснюється характером амінокислотних замін, що відбулись. Більшість вірусів грипу, для яких характерна мала патогенність, мають в сайті розщеплення Арг, і саме він є місцем дії активуючих серинових протеіназ. В той же час штами, що мають більшу вірулентність та здібні переходити з птахів на ссавців, зазвичай мають в цьому сайті поліосновну послідовність [Lewis D.B., 2006]. Таким чином зміна Вал?Арг, що сталась після 1966 р. і зберігається у всіх вивчених пташиних штамів, принципово важлива, бо може забезпечити протеолітичну активацію HА в цій ділянці та розширити коло активуючих протеіназ. Поява в позиції 329 ще одного основного залишку, Ліз, однак, не зберіглась – еволюційний процес надав перевагу серину (можливо, в данному разі важливим було збереження амінокислотного залишку малого розміру). Таблиця 4. Первинна структура сайту розщеплення HA та середні значення показників кінетики адсорбції штамів вірусу пташиного грипу H9N2 на клітинах МDCK та курячих еритроцитах Штам вірусу, дата ізоляції Номер позиції, амінокислотий залишок Клітини МDCK Еритроцити курки 325 326 327 328 329 330 К, % /хв. t50%, хв. Кб К, % /хв. t50%, хв. Кб ty/wis-consin-66, 1966 Про Ала Вал Сер Сер Арг 1,33+ 0,15 43,5+ 3,8 0,024±0,02 39,6+ 4,2 1,2+ 0,08 2,7± 0,20 ty/90710/, 30.05. 2000 Про Ала Арг Сер Ліз Арг 2,85* + 0,25 25,2* + 3,1 0,064* ± 0,09 28,6* + 2,6 2,0* + 0,23 0,83* ± 0,13 ty/615/, 30.01. 2002 Про Ала Арг Сер Ліз Арг ty/965/, 17.03. 2002 Про Ала Арг Сер Сер Арг 3,02* + 0,30 20,2* + 1,8 0,172* ± 0,022 21,2* + 2,11 2,7* + 0,23 0,33* ± 0,03 сh/137314.07. 2003 Про Ала Арг Сер Сер Арг ty/1562/, 28.12. 2003 Про Ала Арг Сер Сер Арг ty/1747/, 15.05. 2004 Про Ала Арг Сер Сер Арг Примітки:* – вірогідно відносно референтного штаму (р < 0,05). Еволюція структурно-функціональних властивостей NA. Результати вимірів температурної залежності нейрамінідазної активності при двох дозах вірусу, що відповідає різній концентрації ферменту, наведені в табл. 5. Таблиця 5 Температурна залежність активності NA (од. оптичної густини) штамів вірусу грипу птахів H9N2 та людини H2N2 і H3N2. Штам вірусу, дата ізоляції Розве- дення Т0 С 15 25 37 42 56 ty/wisconsin- 66, 1966 1:32 0,22±0,02 0,24±0,03 0,52*±0,06 0,70±0,08 0,27±0,04 1:100 0,17±0,02 0,20±0,02 0,36*±0,03 0,55±0,05 0,26±0,03 ty/90710/, 30.05.2000 1:32 0,20±0,02 0,26±0,04 0,62±0,04 0,72±0,06 0,32±0,03 1:100 0,18±0,02 0,23±0,03 0,42*±0,04 0,55±0,05 0,28±0,03 ty/965/, 17.03.2002 1:32 0,23±0,02 0,22±0,02 0,58*±0,06 0,89±0,09 0,40±0,05 1:100 0,16±0,01 0,22±0,03 0,46*±0,04 0,58±0,07 0,30±0,06 сh/1373/, 14.07.2003 1:32 0,15±0,01 0,21±0,02 0,48±0,06 0,55±0,08 0,27±0,03 1:100 0,11±0,01 0,16±0,02 0,32±0,04 0,30±0,03 0,24±0,03 ty/1562/, 28.12.2003 1:32 0,17±0,02 0,20±0,02 0,46*±0,05 0,32±0,04 0,28±0,04 1:100 0,13±0,03 0,15±0,01 0,39*±0,03 0,29±0,02 0,24±0,03 Singapore /57, 1957 1:32 0,07±0,007 0,07±0,008 0,37*±0,04 0,25±0,03 0,20±0,02 1:100 0,06±0,007 0,06±0,006 0,29*±0,03 0,22±0,02 0,18±0,02 Hong Kong /68, 1968 1:32 0,08±0,006 0,08±0,007 0,30*±0,04 0,22±0,02 0,22±0,03 1:100 0,07±0,008 0,08±0,007 0,27*±0,03 0,20±0,02 0,17±0,02 Примітка: * – вірогідно відносно 42о С (р < 0,05). t v ¦ E ` ? ¤ ¦ ` ° oe ?? ?? a ?????????$? С, в той час, як у обох референтних штамів вірусу грипу людини – Singapore/57 і Hong Kong/68 – при 37о С. Ці особливості температурного оптимуму пов’язані з різною температурою тіла ссавців і птахів, яка становить, в середньому, 37о та 42о С відповідно. Штами ty/90710/ і ty/965/, що були вилучені в період з 30.05.2000 по 17.03.2002 р., мають максимальну активність NA при 42оС, так само, як і вірус ty/wisconsin-66. Але вже в 2003 році максимальна активність фермента у штама сh/1373/ при 42оС не відрізняється вірогідно від активності при 37о С, а у штама ty/1562/ вона стає вищою при 37оС, як і у вирусів грипу людини. Це свідчить про те, що специфічність температурного оптимуму активності NA у “пізніх” штамів вірусу H9N2 дозволяє їм ефективно брати участь у позаклітинній стадії розповсюдження в організмі ссавців, температура тіла яких нижча, ніж птахів. Константи Міхаеліса нейрамінідазної реакції, розраховані для 37о і 42о С, надані в Табл. 6. Як бачимо, величини Кm нейрамінідазної реакції референтного штаму вірусу грипу птахів і штамів, які були вилучені до 2003 року, при 42оС нижчі, ніж при 37о С. У штамів, вилучених в 2003 році, а також референтних штамів вірусу грипу людини цей показник, навпаки, або вищій при 42оС, ніж при 37о С, або не відрізняється вірогідно при обох температурах. Таблиця 6 Константи Міхаеліса (Кm) NA деяких штамів вірусу грипу птахів H9N2 та людини H2N2 і H3N2 при 370 та 420 С Штам вірусу, дата ізоляції Кm, М · 10-3 370 С 420 С ty/wisconsin-66, 1966 0,83*±0,09 0,56±0,07 ty/90710/, 30.05.2000 0,77*±0,08 0,50±0,07 ty/965/, 17.03.2002 1,11*±0,13 0,43±0,06 сh/1373/, 14.07.2003 1,31±0,15 1,13±0,13 ty/1562/, 28.12. 2003 0,42*±0,06 0,71±0,09 Singapore/57, 1957 0,71*±0,08 1,25±0,14 Hong Kong/68, 1968 0,83*±0,10 2,50±0,36 Примітка:* – вірогідно відносно 42о С (р < 0,05). Таким чином, слід констатувати, що NA “ранніх” штамів має більшу спорідненість до субстрату при 42оС, а “пізніх” – при 37 оС. У 32 штамів вірусу, які були вилучені у період з 30.05.2000 р. по 05.03.2004 р., а також у референтних вірусів ty/wisconsin-66 і Singapore/57 було проаналізовано ділянки генів поміж позиціями 724 – 1298 нуклеотідних послідовностей і відповідні їм амінокислотні послідовності (позиції 242 – 433) NA, де знаходяться амінокислотні залишки, що входять до складу активного центру і здійснюють зв’язок з субстратом, а також ті, що обумовлюють антигенні властивості NA. Було знайдено 21 заміну амінокислотних залишків. За винятком 4, всі інші не мають регулярного характеру, який збігався б з розвитком епізооті, і хронологично досить рівномірно розсіяні по всім 32 дослідженим штамам. Ці ж 4 визначені як залишки, що, вочевидь, входять до складу антигенних ділянок [Colman P.M. et al.,1983]. Еволюція антигенних детермінант HA і NA. Аналіз за допомогою гель-електрофорезу консервативних і варіабельних нуклеотидних ділянок генів HА і NА, які були отримані методом ПЛР, показав, що у всіх досліджених штамів вірусу HА відноситься до серотипу 9, а NА – до серотипу 2. Однак вивчення реакцій гальмування з антисироватками виявило для обох білків більш тонкі структурні особливості їх антигенних властивостей. Вони полягають у наявності кросреактивності – взаємодії HА та NА частини штамів вірусів з антисироватками не тільки до Н9 і N2, але й до інших серотипів цих білків (Табл. 7 та 8). Таблиця 7 РГГА з антисироватками до HА та амінокислотні залишки, що входять до антигенного сайту ІІ Штам вірусу, дата ізоляції Референтні антисироватки Номер позиції 135 183 216 Амінокислотний залишок ty/90710/, 30.05.2000 Н2, Н6, Н9, Н13 Глі Асн Глн ch/786/, 07.12.2001 Н6, Н9, Н13 Глі Асн Лей ty/625/, 10.02.2002 Н9, Н13 Глі Асн Лей ch/1308/, 12.05.2003 Н9 Асп Асн Лей ty/1562/, 28.12.2003 Н9 Асп Асн Глн В обох випадках кросреактивність спостерігається у “ранніх” штамів і зникає з появою “пізніх” – в період 2002 – 2003 років. Істотно, що титр гальмуючої антисироватки завжди росте з ходом епізоотії. Причина змін кросреактивності повинна полягати в заміні амінокислотних залишків ділянок, що визначають антигенні особливості НА та NA. Молекула HA містить 3 атигенних сайті – І-й (позиції 129,147,152), змішаний (позиції 127,179,188) і ІІ-й (позиції 135,183,216). В НА досліджених штамів вірусу у сайті І не було знайдено жодної заміни амінокислотних залишків. У змішаному сайті виникали поодинокі заміни Тре ? Асп (позиція 179) і Тре ? Про (позиція 188), які досить швидко зазнавали зворотного переходу, і наприкінці епізоотії в цих позиціях завжди знаходився Тре. Заміни амінокіслотних залишків, які мали регулярний характер, відбувалися лише в ІІ-му сайті у позиціях 135 і 216. Найбільший рівень кросреактивності спостерігається, якшо в усіх трьох його варіабельних позиціях знаходяться полярні незаряджені амінокислотні залишки. Заміна Глн в позиції 216 на неполярний Лей зменшує кросреактівність, а подальше повернення Лей ? Глн і заміна в позиції 135 Глі на негативно заряджений залишок Асп приводить до відсутності кросреактивності – реакція гемаглютинації гальмується тільки антисироваткою до Н9. Таким чином, отримані дані наочно демонструють, як еволюційні зміни антигенного статусу HА досліджених штамів на протязі епізоотії залежать від фізико-хімічних характеристик амінокислотних залишків, що замінюють один одного під час еволюції (їх полярності, наявності та знаку електростатичного заряду). Вивчення РГНА у 7 штамів вірусів пташиного грипу, вилучених під час епізоотії, і референтного вірусу ty/wisconsin-66 показало, що нейрамінідазну активність у останнього гальмує лише антисироватка до N2 (Табл. 8). Але у досліджених штамів, вже починаючи з середини 2000 р., таке гальмування здійснює антисироватка також і до N3. У цей час заміни амінокислотних залишків у порівнянні з референтним штамом виникають у позиціях: 346 (Асн ? Глі), 381 (Глі ? Асп), 386 ( Про ? Ала). Водночас виникає й кросреактивність, яка відверто корелює з цими замінами. Очевидно, це пов’язано з тим, що в той час, як у позиціях 346 і 386, полярність залишків при замінах суттєво не змінюється, в позиції 381 незаряджений полярний залишок змінюється на заряджений негативно. Крім того, заміна Про на Ала може суттєво збільшити гнучкість ланцюгу головних валентностей в цій ділянці молекули. Це становище продовжувалось до початку 2003 р., коли на протязі короткого часу відбулися заміни в усіх 4-х варіабельних позиціях. У позиціях 381 та 386 сталися повернення до Глі і Про, як і у референтного штаму, а в позиціях 312 і 346 – заміни Ілей ? Вал та Глі ? Ала відповідно. Одночасно нейрамінідазну реакцію починає гальмувати лише антисироватка до N2. Таблиця 8 РГНА з антисироватками до NА і амінокислотні залишки, що входять до ії варіабельних ділянок Штам вірусу, дата ізоляції Референтні антисироватки Номер позиції 312 346 381 386 Амінокислотний залишок ty/wisconsin-66, 1966 б/N2 Ілей Асн Глі Про ty/90710/, 30.05.2000 б/N2, б/N3b Ілей Глі Асп Ала ty/868/, 20.01.2002 б/N2, б/N3a Ілей Глі Асп Ала ty/615/, 30.01.2002 б/N2, б/N3a Ілей Глі Асп Ала ty/616/, 30.01.2002 б/N2, б/N3a Ілей Глі Асп Ала ch/1304/, 05.05.2003 б/N2 Вал Ала Глі Про ch/1373/, 14.07.2003 б/N2 Вал Ала Глі Про ty/1562/, 28.12.2003 б/N2 Вал Ала Глі Про Перша заміна не змінює гідрофобність молекули NA порівнянно з такою референтного вірусу, але повертає підвищену рухомість пептидного ланцюгу в місці розташування Глі та компенсує ці зміни поверненням Про. Друга ж, за рахунок заміни Глі на Ала, дещо збільшує кількість гідрофобних ділянок в варіабельних частинах молекули NA. Виявлена втрата кросреактивності може виникати, скоріш за все, через повернення до сполучення Глі та Про в позиціях 381 та 386. Однак це не виключає, що і в інших ділянках цієї молекули відбулись не виявлені в роботі заміни, ялі теж вплинули на зникнення кросреактивності у вивчених штамів. Отримані дані підтверджують попередні результати про витіснення у період між 2002 – 2003 р. “ранніх” штамів “пізніми” з новими функціональними властивостями. Слід також підкреслити, що зміни ферментативної активності NA в ході епізоотії, скоріш за все, в певній мірі пов’язані з виявленими замінами амінокислотних залишків. Еволюція досліджених штамів вірусів та їх філогенетичні зв’язки з іншими вірусами H9N2 птахів, ссавців і людини. Про еволюцію вірусів можна судити, виходячи з особливостей молекулярної еволюції їх білків та нуклеїнових кислот [С.Оно,1973; М.Кимура,1985]. Філогенетичний аналіз повної нуклеотидної послідовності гена HA 5-ти досліджених штамів вірусу H9N2 показав, що вони чітко поділяються на дві групи: “ранні” – ty/90710/30.05/2000, ch/786/07.12.2001, ty/965/17.03.2002 та “пізні” – сh/1304/05.05.2003 та ty/1562/28.12.2003. На рис. 2 наведені еволюційні дерева HA та NA 16-ти досліджених штамів вірусу H9N2, ізольованих на протязі епізоотії. Вони побудовані на підставі порівняння амінокислотних послідовностей між позиціями 32–332 для HА, де знаходяться сайти розщеплення, рецептор-зв’язуючі та всі три антигенних сайти, і послідовностей між позиціями 242 – 433 для NA, що містять амінокислотні залишки, які входять до складу зв’язуючого та активного центрів ферменту. Як бачимо, дані щодо молекулярної еволюції HА та NА недвозначно підтверджують попередні результати про те, що в ході епізоотії, у проміжок часу 2002 – 2003 років, відбулася заміна “ранніх” форм вірусу “пізніми”, із зміненими структурно-функціональними властивостями. При цьому, хоча загальний напрямок еволюції обох білків повністю співпадає, їх диференційні зміни дещо різняться, так що ступінь близькості первинних структур і HA, і NA в групах як “ранніх”, так і “пізніх” штамів неоднакова (рис. 2). Істотним для оцінки небезпеки досліджених штамів по відношенню до людини є, крім функціональних властивостей HА та NА, також і питання про місце цих штамів у філогенетичній ієрархії вірусів грипу H9N2. В Табл. 9 подані середні величини різниці між первинними структурами HА і NА 14 досліджених штамів у порівнянні з референтним штамом пташиного грипу і вірусом грипу A/Hong Kong/1073/99, ізольованим в 1999 році від людей у Гонконзі. За амінокислотним складом HА ранні і пізні штами однаково віддалені від обох порівнюваних вірусів, а за амінокислотним складом NА вони трохи ближчі до ty/Wisсonsin-66, ніж до A/Hong Kong/1073/99, і, таким чином, знаходяться приблизно посередині між ними. Слід підкреслити, що ці дані вказують на близкість вивчених штамів до A/Hong Kong/1073/99 за повним амінокислотним складом обох білків і до того ж в середньому по всім штамам. Таблиця 9 Середні відмінності між первинними структурами HА та NА досліджених штамів вірусу пташиного грипу H9N2, референтним штамом ty/Wisconsin-66 та вірусом Hong Kong/1073/99 Вірус Штам вірусу, дата ізоляції ty/Wisconsin-66 A/Hong Kong/1073/99 Амінокислотні заміни, % НА NА НА NА Ранні ty/90710/30.05.2000, ty/615/30.01.2002, ty/619/30.01.2002, ty/625/10.02.2002, ty/810/25.12.2001, ch/811/7.12.2001 ty/965/17.03.2002 14,1± 0,32** 5,2± 0,51 17,3± 0,45* 5,4± 0,58 Пізні ch/1308/12.05.2003, ch/1308/12.05.2003, ch/1376/14.07.2003,os/1436/04.11.2003, ch/1475/0 8.12.2003, ty/1738/05.03.2004, ch/1747/13.05.04 14,5± 0,46** 4,9± 0,28 19,6± 1,05 5,3± 0,52 Примітки: * – вірогідно відносно пізніх штамів (р < 0,05). ** – вірогідно відносно штаму A/Hong Kong/1073/99 (р < 0,05). В той же час і серед ранніх, і серед пізніх штамів є розташовані набагато ближче до вірусів H9N2, що можуть інфікувати ссавців. Порівняння ділянок нуклеотидних послідовностей генів НА (позиції 172 – 551) та NA (позиції 718 – 1292) штамів ty/615/30.01.2002 i os/1436/30.10.2003 з такими ж послідовностями вірусів A/Kong Hong/1073/99 i A/sw/HK/10/98, що були вилучені із свиней у Китаї, показало 96% і 84% ідентичності відповідно. Саме в цих позиціях містяться нуклеотиди, які входять до складу функціонально-активних ділянок обох білків. Таким чином, за своїм філогенетичним місцем серед вірусів H9N2, як і за функціональними властивостями, досліджені штами пташиного грипу є потенційно небезпечними для людини. Особливо це стосується “пізніх” штамів. ВИСНОВКИ Проведено дослідження молекулярної еволюції НА та NA 64 штамів пташиного грипу Н9N2, що спричинили епізоотію в Ізраілі в 2000 – 2004 р.р. Знайдено кореляцію між змінами первинної структури та функціональними властивостями обох білків Побудовано еволюційні дерева, що уточнили положення вивчених штамів в систематиці вірусів грипу Н9N2. 1. Визначені повні нуклеотидні послідовності гена НА 6-ти штамів та області гена, що кодують ланки розщеплення, рецепторзв’язуючий та антигенний сайти інших штамів, а також нуклеотидні області гену NA, які кодують амінокислотні залишки в активному центрі та центрі зв’язування вивчених штамів вірусу Н9N2. За цими даними відтворені відповідні амінокислотні послідовності обох білків.. 2. Показано, що в процесі епізоотії константи зв’язування та швидкості адсорбції вірусу на еритроцитах птахів знижуються, а на клітинах нирок собаки MDCK – зростають; часи 50%-ої адсорбції поводять себе протилежним чином. 3. В процесі епізоотії температурний оптимум ферментативної активності NA вивчених штамів вірусу грипу Н9N2 зсувається від 420 С до 370С , а константа Міхаеліса стає меншою при 370 С, ніж при 420 С. 4. Показано, що на початку епізоотії для обох білків вивчених штамів була притаманна кросреактивність до антигенів різних серотипів вірусу грипу. Наприкінці епізоотії кросреактивність відсутня – всі штами віднесені до серотипу Н9N2. 5. Знайдені зміни функціональних властивостей НА та NA корелюють з регулярними крапковими мутаціями в їх генах та відповідними змінами первинних структур цих білків в ході епізоотії. 6. Аналіз структурно-функціональних змін властивостей НА та NA свідчить про виникнення в ході епізоотії 2-х груп штамів вірусу грипу Н9N2 : “ранніх”, характерних , в основному, до початку 2003 р., та “пізніх”, які повністю витіснили “ранні” наприкінці епізоотії. “Ранні” штами ближчі за своїми властивостями до референтного вірусу пташиного грипу ty/Wisconsin-66 (H9N2), а “пізні” – до референтних вірусів людини Singapore/57 (Н2N2) та Hong Kong/68 (Н3N2). 7. Базуючись на нуклеотидних послідовностях генів та амінокислотних послідовностях білків НА та NA вивчених штамів, а також на відповідних послідовностях з генних банків, побудовано філогенетичне дерево вірусів грипу Н9N2. Показана близька систематична спорідненість вивчених штамів до вірусів грипу Н9N2 з Європи та Південно-Східної Азії. 8. Отримані результати свідчать про те, що вивчені “пізні” штами вірусу пташиного грипу Н9N2 є вірогідними кандидатами на роль нового штаму, здібного перейти до людини. СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Shihmanter E., Lipkind M., Rosenbluth E., Lapin K., Gisin I., Pokamunski S., Perk S., Panshin A. Sequence analysis of the haemagglutinin gene of H9N2 Israeli Avian Influenza viruses. //World Poultry Science Association Federation of European Branches and Institute of Poultry Diseases. Free University Berlin, Germany. – 2003. – N 28. – P. 164-176. (Дисертантом були вилучені ділянки генів НА вірусів грипу і визначена їхня первинна структура) Panshin A., Tendler Y., Lapin K., Gisin I., Pokamunski S., Zinder O., Orvell C., Lipkind M., Shihmanter E. Monoclonal antibodies and RT-PCR in diagnostic ortho- and paramyxovirus avian infections.// Med. Immunology.- 2003.-V. 5 (3-4).- P. 316-317, Petersburg.(Дисертантом було проведено реакції гальмування НА і NA активності та визначені серотипи досліджених вірусів грипу) Shihmanter E., Gisin I., Perk S., Lipkind M., Panshin A. Philogenetic Analysis of H9N2 Avian Influenza Viruses Isolated from Poultry in Israel during 2000-2004. //5 International Symposium on Turkey Diseases. World Poultry Science Association Federation of European Branches and Institute of Poultry Diseases, Free University Berlin, Germany. Jun. 17.- 2004.- Р. 81-97. (Дисертантом визначено первинні структури HA та NA вірусу пташиного грипу для здійснення філогенетичного аналізу) Гисина И.Л., Перский Е.Э., Шихмантер Э.И. Анализ нуклеотидной последовательности участка 177–551 гена гемагглютинина вируса гриппа птиц Н9N2. //Биологический Вестник. -2004.- Т.8, № 2. – С. 94 – 98. (Дисертантом були вилучені ділянки генів НА вірусів грипу і визначена їхня первинна структура ) Гисина И.Л., Перский Е.Э.. Температурная зависимость активности нейраминидазы вирусов гриппа птиц и человека // Проблемы криобиологиии- 2004.- № 4.- С. 101 – 106. (Дисертантом було визначено активність NA штамів пташиного і людського вірусу грипу при різних температурах) Гисина И.Л., Буланкина Н.И., Перский Е.Э. Эволюция структурно-функциональных свойств участка расщепления геммагглютинина вируса гриппа птиц Н9N2. // Вестник ХНУ им. В.Н. Каразина. Сер. Биология. – 2006 .- № 729.- С.16-20. (Дисертантом була вивчена залежність кінетичних показників адсорбції штамів вірусу пташиного грипу на культурі клітин собаки і еритроцитах курки від первинної структури ділянки розщеплення HA цих штамів). Shihmanter Е, Weisman Y, Panshin A., Lapin E., Gisin I., Lipkind M.. Ecological, Antigenic, And Genetic Studies On Other-Than-NDV Avian Paramyxoviruses (APMV) Isolated In Israel. // XIII Congress of the world veterinary poultry association. July 20.- 2003. Denver, Colorado. – P. 31. 8. Shihmanter E, Panshin A., Lapin K., Gisin I., Lipkind M. The reverse transcriptase-polymerase chain reaction in diagnostic of the avian paramyxovirus infection. // World Poultry Science Association Federation of European Branches and Institute of Poultry Diseases. Free University, Berlin, Germany. Feb. 28.- 2003. 9. Panshin A., Tendler Y., Shihmanter E., Orvell C., Gisin I., Lipkind M., Zinder O. Predictive Estimation Proteins Antigenic Profiles, Comparison with the Antigenic Structure Determined by Means of Monoclonal Antibodies// 12 International Congress of Immunology and 4 Annual Conference of FOCIS. Julу. 20, 2004. Montreal, Canada. Abstract. 2004.- Р.146В 10. Shihmanter E., Panshin A., A. Rosenbluth A., Lapin K., Gisin I., Pokamunski S., Lipkind M., Perk S. Characterization of avian H9N2 influenza viruses recently isolated in Israel.// In: Annual Meeting of the Israel Society for Microbiology, Tel Aviv, Feb. 3-4.- 2003, – P. 59. 11. Shihmanter E., Panshin A., Rosenbluth E., Lapin K., Gisin I., Pokamunski S., Lipkind M. (2003) Pathotype-diagnostic of the Newcastle disease viruses by means of the RT PCR. // In: Annual Meeting of the Israel Society for Microbiology.- Tel Aviv.-Feb. 3-4. – 2003 – P. 59. 12. Gisin I., Shihmanter E., Perk S., Pokamunski S., Rosenbluth E., Orvell C., Lipkind M., Panshin A. Antigenic and genetic heterogeneity amongst the Newcastle virus strains recently isolated in Israel. // Tel Aviv University. – 2003. – P. 11 – 12. 13. Гисина И.Л., Перский Е.Э. Возможный механизм быстрой эволюции вируса гриппа птиц Н9N2 путём межвидового переноса. // Генетика в современном обществе. Научн. конф., посвящ. 70-летию каф. генетики и цитологии ХНУ. Тез. докл. – Харків. – 2004. – C. 44. 14. Перський Є.Е., Гісіна І.Л., Буланкіна Н.І. Порівняльне дослідження первинної структури і функціональних властивостей нейрамінідази та гемаглютинину вірусів грипу ty/wisconsin 66 i H9N2 птиць та Singapure/57 i Hong Kong/68 людини. // ІХ Укр. біохім. з’їзд.- К.: Н.думка. – Тези доповідей. Т.1. – С. 20. АНОТАЦІЯ Гісіна І. Л. Структурно-функціональні властивости гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів вірусу грипу Н9N2. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2006. Проведено дослідження структурно-функціональних властивостей НА і NA 64 штамів пташиного грипу Н9N2, що викликали епідемію в птахівничих господарствах Ізраіля в 2000-2004 р.р. Досліджено зв’язок між змінами структури цих білків та деякими їх біологічними властивостями в ході епізоотії, що є важливим для визначення потенційної небезпеки переходу вірусів пташиного грипу Н9N2 до людини. Для досягнення цієї мети були визначені повні нуклеотидні послідовності генів НА та NA 6-ти штамів вірусів H9N2 та функціонально важливих областей генів інших штамів. За цими даними відтворені відповідні амінокислотні послідовності обох білків.. Показано, що в процесі епізоотії константи зв’язування та швидкості адсорбції вірусу на еритроцитах птахів знижуються, а на клітинах нирок собаки MDCK – зростають. Температурний оптимум ферментативної активності NA вивчених штамів зсувається від 420 С до 370 , а константа Міхаеліса Km стає меншою при 370 С, ніж при 420 С. Це свідчить про наближення властивостей обох білків до таких, що відповідають умовам функціонування в організмах ссавців. Знайдені зміни функціональних властивостей НА та NA корелюють з регулярними крапковими мутаціями в їх генах та відповідними змінами первинних структур цих білків. Побудовано філогенетичні дерева НА та NA вірусів Н9N2. Отримані результати свідчать, що вивчені “пізні” штами вірусу пташиного грипу Н9N2 є вірогідними кандидатами на роль нового штаму, здібного перейти до людини. Ключові слова: вірус грипу Н9N2, гемаглютинін, нейрамінідаза, первинна структура, еволюція. АННОТАЦИЯ Гисина И. Л. Структурно-функциональные свойства гемагглютинина и нейраминидазы разных штаммов вируса гриппа Н9N2. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2006. Проведено исследование структурно-функциональных свойств НА и NA 64-х штаммов вирусов птичьего гриппа Н9N2, которые вызвали эпидемию в птицеводческих хозяйствах Израиля в период с 2000 по 2004 г. На основании полученных данных сделана попытка проследить связь между изменениями структуры указанных белков и их генов, с одной стороны, и некоторыми функциональными их особенностями, с другой, в ходе эпизоотии. Целью такого сопоставления было уточнение положения данных штаммов в систематике вирусов гриппа, построение эволюционных деревьев их и выявление потенциальной опасности перехода вирусов птичьего гриппа Н9N2 к млекопитающим (особенно к человеку). Для достижения этой цели были определены полные нуклеотидные последовательности генов НА и NA ряда штаммов вируса за указанный период времени. По этим данным воспроизведены соответствующие аминокислотные последовательности и найдены аминокислотные замены, имевшие место ходе эпизоотии в функционально важных сайтах указанных белков. Таковыми являются рецептор-связывающий сайт и сайт расщепления в НА, сайты, расположенные вблизи активного центра в NA, а также участки, отвечающие за антигенные свойства обоих белков. Изучены характеристики адсорбционной способности НА по отношению к клеткам птиц (эритроцитам) и млекопитающих (клеткам культуры почек собаки – MDCK). Показано, что способность связываться с эритроцитами птиц в ходе эпизоотии у исследованных штаммов снижается, а сродство к клеткам млекопитающих – возрастает. Найдены аминокислотные замены, которые могут определять данные функциональные изменения исследованных белков. Это замены в рецептор-связывающем сайте и сайте, ответственном за протеолитическую активацию НА. Найдено, что в ходе эпизоотии температурный оптимум NA сдвигается к 37оС, а величина Км при этой температуре уменьшается. Эти изменения, как и изменения в свойствах НА, свидетельствуют о том, что вирусы гриппа птиц Н9N2 постепенно приобретают черты, которые могут облегчить их переход от птиц к млекопитающим, в том числе и к человеку. Обнаружены определенные изменения в антигенных свойствах НА и NA. Из трёх антигенных сайтов НА только сайт II (позиции 135 и 216) подвергся систематическим изменениям в ходе эпизоотии, причем эти изменения носили во времени закономерный характер. В опытах по исследованию РТГА найдена кроссреактивность, которая коррелировала с наличием аминокислотных замен в вариабельных позициях этих сайтов по сравнению с НА референтного штамма птичьего гриппа ty/Wisconsin-66. Она была выражена максимально в случае преобладания полярных незаряженных остатков в указанном сайте. Замена Глн на Лей (позиция 216) уменьшала степень кроссреактивности, а обратный переход в сочетании с заменой Гли на Асп (позиция 315) проводила к исчезновению кроссреактивности у “поздних” штаммов. Кроссреактивность найдена и в экспериментах по изучению нейраминидазы с помощью РТНА. Она связана с аминокислотными заменами в позициях 312, 346, 381, 386. По сравнению с референтным штаммом в период с 2000 по начало 2003 г. в этих позициях произошли замены Асн на Гли (позиция 346), Гли на Асп (позиция 381) и Про на Ала (позиция 386). Эти изменениях сопровождались появлением существенной кроссреактивности. Однако с середины 2003 г. кроссреактивность исчезала, а в позициях 381 и 386 происходило возвращение к исходному аминокислотному составу. В позициях же 312 и 346 Илей завменялся на Вал, а Гли – на Ала соответственно. Обсуждено значение этих аминокислотных замен для изменения физико-химических свойств антигенных сайтов фермента. Обнаружено, что в ходе эпизоотии возникают 2 группы штаммов – “ранние” и вытесняющие их “поздние”, более близкие по ряду признаков к вирусам гриппа человека. На основании изучения первичных структур НА и NA и их генов у исследованных штаммов, а также с привлечением сведений из банка данных по вирусам гриппа птиц и человек, построены филогенетические деревья НА и NA для вирусов Н9N2. Обнаружено, что направление эволюции этих белков совпадает, однако имеются и некоторые различия в степени близости первичных структур данных белков из разных “ранних” и “поздних” штаммов. Показана систематическая близость изученных штаммов к вирусам гриппа Н9N2, распространённым в Европе и Юго-Восточной Азии. Найдено, что “ранние” штаммы ближе по своим свойствам и структуре к референтному вирусу птичьего гриппа Н9N2 (ty/Wisconsin-66), а “поздние” – к вирусам гриппа человека H2N2 (Singapore/57) и H3N2 (Hong Kong/68). Полученные результаты свидетельствуют о том, что изученные “поздние” штаммы вируса птичего гриппа Н9N2 являются вероятными кандидатами на роль нового патогена человека. Ключевые слова: вирус гриппа Н9N2, гемагглютинин, нейраминидаза, первичная структура, эволюция. SUMMARY Gisina I. L. Structural and functional properties of influenza viruses H9N2 different strains hemagglutinin and neuraminidase. – The manuscript. The thesis for a degree of candidate of science in biology on speciality 03.00.04 – biochemistry.- V.N.Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2006. The structural and functional properties of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) from 64 strains of H9N2 influenza viruses were researched at Israel poultry farms during 2000-2004 years epizooty. Relations between these proteins structural changes at this period and some of their essential biological properties have been found. These changes are essential for potential ability of virus H9N2 to pass from birds to mammals, including humans. Total nucleotide sequences of HA and NA genes from 6 H9N2 viruses strains were investigated. From these results HA and NA amino acid sequences have been obtained. Adsorbtion degrees аnd its constants were increased during epizooty for mammal cells and diminished – for cells of birds. NA temperature optimum was displaced from 420 C to 370 C; Michaelis constants became less at 370 C than at 420 C in this period. All these facts suggest, that HA and NA properties were approaching to those optimal for mammalian organisms. Some correlations between point mutations in HA and NA genes, the primary structures of these proteins and their functional changes are discussed. Phylogenetic trees for HA and NA of H9N2 strains have been constructed. Results of this work suggest, that investigated H9N2 influenza virus “late” strains are probable chellengers for pass to humans. Key words: influenza virus H9N2, hemagglutinin, neuraminidase, prime structure, evolution. ПЕРЕЛІК ОСНОВНИХ УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ НА – гемаглютинін NA – нейрамінідаза РГГА – реакція гальмування гемаглютиніну РГНА – реакція гальмування нейрамінідазної активності МDCK – культура клітин нирок собаки ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *