Структурна організація комплексу органів імунної системи в ранньому постнатальному періоді онтогенезу при дії малих доз іонізуючого випромінювання (ек

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

МОТУЛЯК АНДРІЙ ПАМФІЛОВИЧ

УДК [611.4 + 57.017.64] : 612.014.482

Структурна організація комплексу органів імунної системи в ранньому
постнатальному періоді онтогенезу при дії малих доз іонізуючого
випромінювання (експериментально-морфологічне дослідження)

14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Івано-Франківському державному медичному університеті
МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Левицький
Володимир Андрійович, Івано-Франківський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України,
професор кафедри гістології, цитології та ембріології

доктор медичних наук, професор Пушкар Михайло Степанович, Вінницький
національний медичний університет імені М.І.Пирогова МОЗ України,
завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології

доктор медичних наук, професор Сирцов Вадим Кирилович, Запорізький
державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри
гістології, цитології та ембріології

Провідна організація: Тернопільський державний медичний університет
імені І.Я.Горбачевського МОЗ України

Захист дисертації відбудеться “5” 04 2007р. о 1330 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному
університеті імені О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м.Київ-57, пр.
Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м.Київ-57, вул.
Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “ ” 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Багатогранні ефекти впливу іонізуючого
випромінювання на організм людини і тварин привертають все більшу увагу
дослідників (Алексахин Р.М.,2006; Кеирим-Маркус И.Б.,2000; Ярмоненко
С.П., Вайсон А.А.,2004; Pouget J.-P., Mather S.J.,2001). Значний інтерес
до зазначеної проблеми пояснюється тим, що дані про наслідки впливу
опромінення використовуються для оцінки ризику виникнення патології у
різних суб’єктів за умов їх професійної діяльності, в самих
різноманітних аварійних ситуаціях, а також при використанні іонізуючого
випромінювання з діагностичною і лікувальною метою (Булдаков Л.А.,
Калистратова В.С.,2005; Дуброва Ю.Е.,2005; Seymour C.B., Mothersill
C.,2000).

Розширення сфери застосування іонізуючого випромінювання і необхідність
реальних оцінок наслідків радіаційних аварій для великих когорт
населення, а також для всього живого на землі, у воді та у повітрі
викликало закономірне переміщення інтересів науковців у бік дослідження
впливу іонізуючого випромінювання саме в малих дозах (Булдаков Л.А,2003;
Котеров А.Н.,2005; Яблоков А.В.,2002; Bonner W.M.,2001). Отримані
чисельними групами дослідників дані засвідчують існування особливостей
біологічної дії малих доз радіації (Ярмоненко С.П.,2000; Calabrese E.J.,
Baldwin L.A.,2002; Mothersill C., Seymour C.,2001), що, в свою чергу,
обмежує кількісне прогнозування ефектів реагуючих об’єктів на ґрунті
безпосередніх екстраполяцій таких ефектів при дії великих доз
випромінювання. Яка ж небезпека опромінення людини і тварин малими
дозами за рахунок техногенних джерел? Однозначної відповіді на це
питання, що має величезне медичне, загально-біологічне та
соціально-економічне значення, на жаль немає.

Загальновідомо, що одним із найбільш стратегічних наслідків впливу
іонізуючого випромінювання на організм людини і тварин є
морфо-функціональна трансформація органів імунної системи. Проведений
нами аналіз вітчизняної та доступної зарубіжної літератури, а також
твердження окремих авторів (Ахматуллина Н.Б.,2005; Василенко О.И.,2004;
Гродзинський Д.М.,2000; Verheij M., Bartelink H.,2000) свідчать про
відсутність спеціальних досліджень перебудови структури центральних і
периферійних імунних органів, що відбувається за умов впливу на організм
низьких доз гамма-випромінювання. В переважній більшості праць такого
спрямування представлені розрізнені, неповні дані, переважно описового
характеру, наводиться характеристика лише окремих клітин, що не дозволяє
скласти цілісну картину адаптивної реакції імунних органів на радіацію.
Викладеними вище фактами і міркуваннями зумовлена актуальність і
необхідність даного дослідження, його наукова цінність та вибір
адекватних методів дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота
виконана відповідно до тематичного плану наукових досліджень
Івано-Франківського державного медичного університету і є складовою
комплексної науково-дослідної роботи “Структурна організація білої
пульпи селезінки в ранньому постнатальному онтогенезі і за умов дії
малих доз іонізуючого випромінювання” (№ Державної реєстрації
0104U003808). У зазначеній роботі дисертант був відповідальним
виконавцем, обґрунтував ідею, мету і технологію дослідження, самостійно
його виконав, проаналізував та узагальнив отримані результати. Тема
дисертації (№ Державної реєстрації 0104U003809) і основні напрямки її
виконання обговорені, схвалені та затверджені на засіданні Проблемної
комісії МОЗ АМН України “Морфологія людини” (протокол №38 від
18.06.2001р.) та Вченою Радою Івано-Франківського державного медичного
університету (протокол №7 від 3.05.2001р.).

Мета і задачі дослідження. Метою цього наукового дослідження було
встановити загальні закономірності морфо-функціональної перебудови
структурних компонентів тимуса, селезінки та брижових лімфатичних вузлів
у ранньому постнатальному періоді онтогенезу при дії низьких доз
іонізуючого випромінювання; створити концепцію гістогенезу органів
імунної системи в ранньому періоді постнатального розвитку під впливом
низьких доз гамма-опромінення.

Завдання дослідження:

1.Дослідити становлення структури тимуса, селезінки та брижових
лімфатичних вузлів мишей у ранньому постнатальному періоді онтогенезу в
нормі та за умов впливу на них малих доз гамма-опромінення.

2.Дати кількісні та якісні характеристики ультраструктурної організації
лімфоцитів досліджуваних органів мишей різного віку в нормі та при дії
малих доз радіації.

3.Вивчити гістотопографію та ультраструктурні особливості найбільш
чутливих до дії малих доз радіації лімфоцитів, виявити характер їх
пострадіаційних пошкоджень та структурні механізми їх можливої загибелі,
адаптації і репарації.

4.Дослідити структурні особливості проявів апоптозу лімфоцитів у нормі
та при дії малих доз гамма-випромінювання.

5.Оцінити характер впливу радіаційно-індукованого апоптозу лімфоцитів на
структурні механізми міжклітинних взаємодій у імунних органах, в тому
числі на процеси трансендотеліальної міграції лімфоцитів та їх
кооперацію з клітинами мікрооточення.

6.Представити узагальнюючу концепцію впливу малих доз радіації на
структуру органів імунної системи мишей в ранньому постнатальному
періоді онтогенезу.

Об’єкт дослідження – тимус, селезінка та брижові лімфатичні вузли
ювенільних мишей-самців радіочутливої лінії BALB/c.

Предмет дослідження – особливості структурної перебудови органів імунної
системи радіочутливої лінії мишей в ранньому постнатальному періоді
онтогенезу за умов впливу малих доз іонізуючого випромінювання.

Методи дослідження – гістологічні (світлооптичні), імуногістохімічні,
гістохімічні (лектинова гістохімія), електронно-мікроскопічні
(трансмісійна електронна мікроскопія), морфометричні, біометричні,
стереологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що
морфологічні зміни у тимусі, селезінці та брижових лімфатичних вузлах
ювенільних мишей лінії BALB/c після дії зовнішнього одноразового
короткочасного тотального гамма-опромінення в дозах 0,05Гр і 0,2Гр
відзначаються своєрідністю, що проявляються специфікою часових і
просторових характеристик загибелі лімфоцитів та клітин їх
безпосереднього мікрооточення. Визначено, що при опроміненні клітини
органів імунної системи гинуть переважно за рахунок
радіаційно-індукованого апоптозу. Останній за своїми параметрами істотно
відрізняється від “класичного апоптозу”, котрий має місце в органах
імунної системи, у ранньому періоді постнатального розвитку в нормі.
Узагальнення одержаних результатів дозволило нам вперше окреслити у
пострадіаційних морфологічних змінах невідомі феномени “квантування”,
“кластеризації” та “компартменталізації”.

Встановлено, що в тимусі феномен “компартменталізації” набуває свого
максимального морфологічного прояву у вигляді формування вперше описаних
на ультраструктурному рівні, так званих, “кистоподібних структур”,
заповнених клітинним детритом і деградованими апоптозними клітинами. З
огляду на це висунуто гіпотезу про те, що саме ці структури є
еквівалентами тілець Гассаля. На нашу думку їх поява викликана
“надлишковістю” апоптозу лімфоцитів і клітин їх мікрооточення та
функціональною неспроможністю макрофагів тимуса у реалізації
повноцінного фагоцитозу. Виявлено, що радіаційно-індуковані зміни клітин
імунних органів вирізняються поєднанням ознак “класичного” апоптозу
лімфоцитів, який асоціюється з помірними змінами мітохондрій та
вираженим і локальним руйнуванням плазматичної мембрани розміщених поряд
апоптозно незмінених лімфоцитів.

Відмічено, що для розвитку радіаційно-індукованого апоптозу клітин
досліджуваних органів характерна фазність, а саме: 1) фаза ініціації; 2)
ефекторна фаза; 3) фаза деградації, яка складається з трьох послідовних
стадій.

Вперше виявлено, що важливою особливістю радіаційно-індукованого
апоптозу є міграція апоптозних лімфоцитів через стінку посткапілярних
венул тимуса та брижових лімфатичних вузлів.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені нами дослідження
надають можливість принципово і по-новому розглядати механізми дії малих
доз радіації на органи імунної системи. Досконало описано
радіаційно-індукований апоптоз лімфоцитів та клітин строми імунних
органів, в якому вперше істотно уточнено не лише фактологічні, але і
феноменологічні аспекти.

Показано, що важливою практичною задачею радіобіологів, онкологів,
інфекціоністів та інших спеціалістів є не лише стимуляція, гальмування
чи модуляція апоптозу, але і підсилення елімінації апоптозних клітин
(апоптозних тілець), які потрапивши з плином крові у органи і тканини
можуть істотно змінити перебіг у них імунних і запальних процесів
(феномен “імунологічної німоти”). Онкологи, виключно за потребою
стимулюючи хіміотерапевтичними середниками апоптоз лімфоїдних клітин
можуть зіштовхнутися з труднощами елімінації апоптозних тілець. Отож,
саме за рахунок трансмуральної міграції та рециркуляції апоптозних
клітин реалізується горизонтальна передача онкогенів (зокрема у складі
апоптозних тілець) в різноманітні лімфоїдні структури, що може призвести
до формування метастазів.

Дані стосовно визначених нами феноменів “квантування”, “кластеризації”
та “компартменталізації” в імунних органах дозволяють більш раціонально
оцінювати на біопсійному матеріалі результати протипухлинної терапії.
Дані щодо фазності та стадійності радіаційно-індукованого апоптозу
представляють інтерес для розробників хіміотерапевтичних і
біотерапевтичних препаратів, принципи дії яких базуються на модуляції
апоптозу в злоякісних і нормальних клітинах.

Узагальнення, що випливають із результатів нашого дослідження,
дозволяють стверджувати: оскільки імунокорекцію завжди проводять при
напруженій роботі імунної системи, слід особливо неухильно
притримуватись принципу, що безпосередньо витікає із системного підходу
– втручатись у баланс імунної системи можливо, однак з величезною
обережністю, намагаючись не змінити його, а лише дещо відкоригувати. При
цьому варто пам’ятати, що функціонування імунної системи скероване на
оптимальне досягнення цілі, водночас шляхи, структурні основи наближення
до цілі можуть суттєво відрізнятися.

Отримані результати стосовно природи феноменів “квантування”,
“кластеризації” та “компартменталізації” переконливо свідчать, що малі
дози радіації не забезпечують необхідної вибірковості у загибелі
лімфоїдних клітин, а призводять до смерті цілих клітинних популяцій,
судячи за все, як радіочутливих, так і умовно радіорезистентних. Це
дозволяє зробити здавалося б парадоксальний висновок – індукція апоптозу
клітин може бути менш ефективною, аніж просте пригнічення їхньої
проліферації, що протирічить розповсюдженій точці зору про ніби то
виразні переваги апоптозної елімінації пухлинних клітин, оскільки вона
не супроводжується запальною реакцією.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджені в навчальний та науковий
процес кафедр гістології, цитології та ембріології, анатомії людини,
патологічної фізіології, медичної біології з курсом медичної генетики
Івано-Франківського державного медичного університету, кафедри біології
та екології Інституту природничих наук Прикарпатського національного
університету ім. В.Стефаника, кафедр гістології, цитології та
ембріології Донецького, Буковинського та Кримського державних медичних
університетів, у Інституті біології клітини АМН України.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто обґрунтовано актуальність
проблеми, здійснено патентно-інформаційний пошук, сформульовано
концепцію, мету та задачі дослідження. Самостійно відтворено модель
зовнішнього одноразового загального опромінення ювенільних мишей-самців
радіочутливої лінії BALB/с у дозах 0,05Гр і 0,2Гр, здійснено забір
матеріалу, виконано гістологічні, електронно-мікроскопічні,
лектин-гістохімічні, імуногістохімічні, біометричні, морфометричні і
стереоморфометричні дослідження, проведено статистичну обробку,
проаналізовано і узагальнено отримані результати, сформульовано
положення, висновки і практичні рекомендації.

Автором не були використані результати виконаної ним раніше
кандидатської дисертації та ідеї співавторів публікацій. Основною є
участь автора у підготовці статей для опублікування у фахових журналах.
Автор самостійно готував дані для інших публікацій, виступав на різних
наукових форумах (з’їздах, конференціях, конгресах), особисто оформляв
дисертаційну роботу та автореферат.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і
обговорювались на ІІІ Міжнародному конгресі молодих вчених і
спеціалістів “Науки о человеке” (Томськ, Росія, 2002), на VI
науково-практичній конференції Українського товариства спеціалістів з
імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, Україна, 2002), на
32-му конгресі Європейського товариства досліджень мутагенезу (EEMS)
“DNA damage and repair fundamental aspects and contribution to human
disorders” (Варшава, Польща, 2002), на Міжнародній науковій конференції
до 100-ліття від дня народження Б.П.Хватова (Сімферополь, Україна,
2002), на ІІІ Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і
топографоанатомів України (Київ, Україна, 2002), на Всесвітньому
конгресі з клінічної та імунної патології (Сінгапур, 2002), на
Міжнародній конференції “Антропогенно-змінене середовище України: ризики
для здоров’я населення та екологічних систем” (Київ, Україна, 2003), на
Міжнародній науково-практичній конференції “Мікроциркуляція в
морфологічному і клінічному аспектах” (Івано-Франківськ, Україна, 2003),
на ІІІ З’їзді з радіаційних досліджень (Київ, Україна, 2003), ІІ
міжнародній науково-практичній конференції “Медицинские и экологические
эффекты ионизирующего излучения” (Северськ, Росія, 2003), на
науково-практичній конференції морфологів “Роль імунної, ендокринної та
нервової систем в процесах морфогенезу та регенерації” (Запоріжжя,
Україна, 2003), на ІV Всесвітньому конгресі з астми і IX Міжнародному
конгресі з клінічної патології (Бангкок, Таїланд, 2004), на І
Українському конгресі з клітинної біології (Львів, Україна, 2004), на ХХ
Російській конференції з електронної мікроскопії (Черноголовка-Москва,
Росія, 2004), на V Міжнародному конгресі з інтегративної антропології
(Вінниця, Україна, 2004), на науково-практичній конференції з
міжнародною участю “Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист
персоналу об’єктів атомної енергетики” (Київ-Чорнобиль, Україна, 2004),
на ІІ Національному конгресі з біоетики з міжнародною участю (Київ,
Україна, 2004), на науково-практичній конференції “Гістологія на
сучасному етапі розвитку науки” (Тернопіль, Україна, 2004), на
Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні питання клінічної
анатомії та оперативної хірургії” (Чернівці, Україна, 2004), на I з’їзді
фізіологів СНД: “Физиология иммунной системы” (Сочі, Росія, 2005), на ІV
з’їзді геронтологів і геріатрів України: “Проблемы старения и
долголетия” (Київ, Україна, 2005), на Всеукраїнській науковій
конференції “Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії”
(Чернівці, Україна, 2006), на VI з’їзді алергологів та імунологів СНД
(Москва, Росія, 2006), на IV Національному конгресі анатомів,
гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Сімферополь-Алушта,
Україна, 2006), на ІІІ Міжнародних Пироговських читаннях (Вінниця,
Україна, 2006), на Міжнародній науковій конференції “Механізми
функціонування фізіологічних систем” (Львів, Україна, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 44 наукові праці,
серед яких 22 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК
України. 16 статей опубліковано без співавторства, 2 проблемні статті у
фахових журналах, 3 статті у наукових збірниках, 22 роботи опубліковано
у матеріалах наукових форумів (з’їздів, конгресів, конференцій).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена державною мовою на
303 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, аналітичного
огляду літератури, опису об’єктів і методів дослідження, трьох розділів
власних досліджень, розділу з аналізом та узагальненням отриманих
результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних
літературних джерел. Фактичні цифрові дані досліджень розміщені в 7
таблицях. Дисертація ілюстрована 96 рисунками. Список літератури містить
444 найменування (152 роботи – кирилицею, 292 – латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом для дослідження були
селезінка, тимус і брижові лімфатичні вузли 170 ювенільних мишей-самців
радіочутливої лінії BALB/с. У віці 6-7 діб після народження тварини
опромінювалися на установці “Агат-Р1”, заряд Со60, потужність дози 45,9
Р/хв, ВДШ — 1м, поле — 20х15см. Тварини підлягали зовнішньому
одноразовому загальному опроміненню в дозах 0,05Гр і 0,2Гр. Дані про
розподіл тварин по групах, характер проведених досліджень та їх
тривалість представлені в табл.1. Тварин експериментальних груп забивали
під рауш-наркозом через 6 годин, 1, 3, 5, 7 і 10 діб після опромінення.
Окрім цього, органи відбирали у інтактних тварин (контроль) аналогічних
вікових груп. Опромінення тварин проводили на базі радіологічного
відділення Івано-Франківського обласного онкологічного диспансеру.
Утримання, догляд за тваринами та всі маніпуляції проводили у
відповідності до положень “Європейської конвенції про захист хребетних
тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей”
(Страсбург, 1985). Комісією з біоетики Івано-Франківського державного
медичного університету встановлено, що проведені дослідження
відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України №231 від
01.11.2000 року.

Таблиця 1. Розподіл тварин за характером проведених досліджень

Група Кількість тварин Характер

дослідження Термін дослідження

контроль г-опромінення

0,05 Гр 0,2 Гр

1 26 26 — — —

2 24 10 7 7 6 годин

3 24 10 7 7 1 доба

4 24 10 7 7 3 доби

5 24 10 7 7 5 діб

6 24 10 7 7 7 діб

7 24 10 7 7 10 діб

Всього: 170 86 42 42

Для гістологічного дослідження матеріал фіксували в нейтралізованому за
Ліллі 10 % розчині формаліну, в 70° спирті, рідинах Буена і Карнуа.
Зрізи товщиною 5-10 мкм фарбували гематоксиліном та еозином, залізним
гематоксиліном і пікрофуксином за Van Gieson, азуром А, азур-ІІ та
еозином, толуїдиновим синім, після чого характерні зміни вивчали і
документували у світловому мікроскопі “Биолам-70” під збільшенням 80х,
160х, 200х, 400х.

З метою візуалізації апоптозу лімфоцитів шляхом виявлення експресії
гену, що кодує синтез протеїну р53 та виявлення експресії антигену
Fas(Apo-1/CD95) ми застосували такі імуногістохімічні методи
дослідження:

1) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії гену,
що кодує синтез протеїну р53, принцип якого полягає у визначенні ступеню
експресії гену, що кодує синтез загальновизнаного проапоптотичного
протеїну р53. Послідовність дослідження: шматочки тканини
депарафінізували на скло, блокували ендогенну пероксидазу 3% розчином
пероксиду водню, обробляли предметне скло водою, блокували неспецифічні
протеїнові сполуки двома краплями 1% бичачого сироваткового антигену
(BSA), промивали в PBS-буфері, обробляли зрізи в цитратному буфері рH6,0
в мікрохвильовій печі, промивали в PBS-буфері з рН7,4, наносили первинні
антитіла до антигену р53 (DakoCytomation Inc., Denmark-USA) на 1 годину.
Згодом промивали в PBS-буфері і наносили вторинні антитіла на 30хв.
Промивали в PBS-буфері, наносили дві краплі комплексу
стрептавідин-пероксидази та інкубували 30хв, промивали і наносили АЕС-
хромоген-розчину, інкубували 5-20хв, аж до появи коричнево-червоного
забарвлення з дозабарвленням гематоксиліном Майєра;

2) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії
антигену рецепторів Fas(Apo-1/CD95), принцип якого полягає у виявленні
експресії антигену рецепторів Fas(Apo-1/CD95) за допомогою первинних і
вторинних Kit-моноклональних антитіл до вказаного антигену.
Послідовність дослідження: депарафінізували шматочки тканини на скло,
блокували ендогенну пероксидазу 3% розчином пероксиду водню, обробляли
предметне скло водою, блокували неспецифічні протеїнові сполуки двома
краплями 1% бичачого сироваткового антигену (BSA), промивали у
фосфатному буфері (PBS) з рН7,4, наносили первинні антитіла до антигену
рецепторів Fas(Apo-1/CD95) (DakoCytomation Inc., Denmark-USA) на одну
годину. Промивали у PBS-буфері і наносили вторинні антитіла на 30хв.
Згодом повторно промивали в PBS-буфері, наносили дві краплі комплексу
стрептавідин-пероксидази та інкубували впродовж 30хв, промивали і
наносили АЕС-хромоген-розчин, інкубували 5-20хв, аж до появи
червоно-коричневого забарвлення з наступним дозабарвленням
гематоксиліном Майера. Розповсюдженість та інтенсивність реакції
оцінювали напівкількісним методом в балах (0-3): а) розповсюдженість: 0
– немає забарвлення; 1 – менше 10% позитивно забарвлених клітин; 2 –
більше 10% і менше 50% позитивно забарвлених клітин; 3 – гомогенне
забарвлення більше 50% клітин; б) інтенсивність реакції: 0 – реакція
відсутня; 1 – слабка реакція; 2 – помірна реакція; 3 – виразна реакція.
Визначався також апоптозний індекс, який характеризує кількість клітин з
морфологічними ознаками апоптозу, в перерахунку на 100 досліджених
клітин з наступним обчисленням відсотку.

Для визначення вуглеводної специфічності клітинних мембран лімфоцитів
імунних органів (рівня експресії рецепторів лімфоцитів) проводили
лектиногістохімічні реакції із застосуванням лектинів арахісу, PNA
(вуглеводна специфічність до вDGal?3DGalNAcDgal), мічених пероксидазою
хрону, з візуалізацією місця зв’язування лектинів у системі
3,3-диамінобензидин тетрагідрохлорид – Н2О2 (Луцик А.Д., Детюк Е.С.,
Луцик М.Д.,1989). Таким чином лектини слугували специфічними маркерами
прояву модифікації глікополімерів цитомембран тих лімфоцитів, що вже
зазнали апоптозних змін. Результати реакції визначали за інтенсивністю
забарвлення, від світло-коричневого до темно-коричневого і оцінювали за
шкалою у балах: 0 – реакція відсутня; 1 – слабка реакція; 2 – помірна
реакція; 3 – сильна реакція, 4 – дуже сильна реакція.

Забір матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження
проводився негайно після декапітації тварин. Послідовність дослідження:
шматочки матеріалу пастерівською піпеткою поміщалися у фіксатор Millonig
(1%OsO4 на фосфатному буфері при рН7,45) на 1 годину. Частина
досліджуваних тканин фіксувалася в 2,5% глютаральдегіді на фосфатному
буфері. Дегідратація проводилася у спиртах зростаючої концентрації (50%,
70%, 80%, 96%, абсолютний спирт), в суміші спирт-ацетон та абсолютному
ацетоні. Згодом тканини заливалися епоксидними смолами (епон-аралдит).
Полімеризація здійснювалася при температурі +56°С впродовж доби.
Півтонкі зрізи забарвлювалися толуїдиновим синім, вивчалися під
світловим мікроскопом дослідницького класу Olympus BX61 (цифрова
фотокамера Olympus DP70). Ультратонкі зрізи контрастувалися
уранілацетатом і цитратом свинцю та досліджувалися в електронному
мікроскопі ПEM – 125К.

Імуногістохімічні дослідження виконані на базі лабораторії
патоморфології Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН
України (завідувач – д.мед.н., професор Задорожна Т.Д.).
Електронномікроскопічне дослідження здійснено на базі міжкафедральної
лабораторії електронної мікроскопії при кафедрі анатомії людини
Івано-Франківського державного медичного університету (завідувач –
заслужений діяч науки і техніки України, д.мед.н., професор Шутка Б.В.).
Автор вдячний керівникам та співробітникам вищезгаданих закладів за
увагу до його досліджень та всебічну допомогу.

При проведені морфометричного дослідження керувалися загальними
принципами морфо- та стереоморфометрії (Автандилов Г.Г.,1990). На
напівавтоматизованому пристрої обробки графічних зображень були одержані
стереологічні показники для лімфоцитів кортикальної зони тимуса, білої
пульпи селезінки, лімфатичних вузликів брижових лімфатичних вузлів ті їх
мітохондрій. При цьому вираховувалися наступні показники: середня площа
зрізу профілю клітини і середня площа зрізу профілю ядра; для
мітохондрій — об’ємна щільність (об’єм, який займають мітохондрії в
одиниці об’єму лімфоцита), кількісна щільність (кількість мітохондрій в
одиниці об’єму лімфоцита), середня площа зрізу профілю мітохондрій,
об’ємна і кількісна щільність крист в мітохондріях, а також щільність
міжкристних просторів. Біометрична обробка кількісних даних за кожним
параметром проводилася з попереднім визначенням необхідного об’єму
вибірки. Статистична обробка даних здійснювалася методами варіаційної
статистики, засобами Statistica for Windows 6.0 (Microsoft Corporation,
USA) та GraphPad Prizm4 (GraphPad Software Inc., USA). По кожному з
показників обчислювалися середнє значення та стандартна похибка для
кожної з піддослідних тварин. На цій основі одержували об’єднані
показники для кожної групи тварин.

Результати дослідження та їх аналіз. У кірковій та мозковій речовинах
тимуса ювенільних мишей контрольної групи серед інтактних нами виявлено
поодинокі апоптозні тимоцити з характерними змінами ядра і цитоплазми.
Найбільш ранніми морфологічними проявами апоптозу тимоцитів є ущільнення
ядра, конденсація та зморшкуватість цитоплазми. Значне ущільнення ядра
супроводжується звивистістю контурів, появою булавовидних вип’ячувань,
агрегацією ядерного хроматину у вигляді брилок різноманітного розміру.
Подекуди конденсований хроматин розташовується у вигляді півмісяця по
периферії ядра, іноді виповнює все ядро.

При ретельному вивченні напівтонких зрізів виявлено розподіл макрофагів
практично в усіх зонах тимуса у нормі. Особливо велика їх кількість
знаходиться в кортико-медулярній зоні, де макрофаги спостерігаються в
якості супутників венул. Привертає увагу те, що паравазально розташовані
макрофаги містять у своїй цитоплазмі фагоцитовані апоптозні тіла з
фрагментами ядра. Про зв’язок цього явища з апоптозом свідчать
ідентифіковані нами у кірковій та мозковій речовині тимуса поодинокі
апоптозні тимоцити, що не формують скупчень. Морфологічних свідчень
наявності лімфомікроциркуляторного русла тимуса, що є актуальним хоч і
дискутабельним питанням (Сапин М.Р., Никитюк Д.Б.,2000), не виявлено.

Трансмуральна міграція лімфоцитів з паренхіми тимуса у кровоносне русло,
як свідчать наші дані, здійснюється через стінку посткапілярних венул з
високим ендотелієм, котрі розташовуються в кортико-медулярній зоні
(Куприянов В.В., Бобрик И.И., Караганов Я.Л.,1986). Висота
ендотеліоцитів цих венул в 3-5 рази перевищує висоту ендотелію
кровоносних капілярів кіркової зони тимуса і корелює з розмірами
паравазальних лімфоцитів. При цьому міграція здійснюється через самі
ендотеліоцити, тоді як міжендотеліальні контакти залишаються
незайманими. Міграція проходить без видимих порушень цитолеми
ендотеліоцитів і лімфоцитів, реалізуючись шляхом утворення динамічно
конфігуруючої інвагінації в ендотелії. Початковий етап такої міграції
лімфоцита в просвіт посткапілярної венули найбільш вірогідно пов’язаний
з руйнуванням базальної мембрани, що підтверджується виявленими нами
локусами такого руйнування в місцях локалізації мігруючих лімфоцитів.

У тимусі мишей, що зазнали дії гамма-випромінювання в дозі 0,05Гр і
0,2Гр через 6-24 годин після опромінення нами були виявлені скупчення
апоптозних тимоцитів, особливо крупних – в його кортико-медулярній зоні
та мозковій речовині. Ці скупчення представлені тимоцитами, які
знаходяться на різних стадіях апоптозних змін – від початкових і аж до
утворення апоптозних тіл. На початкових стадіях апоптозу відбувається
зморщування ядерної оболонки тимоцитів, спостерігається агрегація
хроматину з утворенням зубців вздовж ядерної оболонки і закриттям
ядерних пор. В подальшому ядерні оболонки деяких тимоцитів відмежовують
зубці та формують обширні “міхурі” суперконденсованого хроматину.
Останній утворює скупчення у вигляді характерних півмісяців та зубців,
або ж і повністю займає всю нуклеоплазму. В такому випадку ядро
апоптозного тимоцита виглядає практично непізнаним на фоні вузенької
облямівки електроннощільної цитоплазми, а сам тимоцит набуває вигляду
“чорнильної плями”. Такі тимоцити фагоцитуються макрофагами. Слід
відзначити, що у кірковій та мозковій речовинах тимуса мишей в зазначені
терміни експерименту окрім чисельних апоптозних тимоцитів
ідентифікуються різні за формою і складом апоптозні тіла, які не
підлягають описаному в літературі так званому “випереджуючому
фагоцитозу” (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю.,2001), а розміщуються,
здебільшого, посеред повністю інтактних тимоцитів, на істотній віддалі
від макрофагів. Таким чином, базуючись на цих даних ще досить важко
говорити про те, чи відображає дана морфологічна картина різні варіанти
апоптозу тимоцитів, чи представляє собою окремі ланки єдиного ланцюга.

Об’єднані у великі групи (компартменти) апоптозні тимоцити на 1-3 добу
експерименту не підлягають фагоцитозу (в деяких випадках вони навіть не
фрагментуються на апоптозні тіла), а перебувають в оточенні інтактних
тимоцитів чи моношару епітеліоретикулоцитів, формуючи своєрідні
компартменти у вигляді кистоподібних структур. Останні на півтонких
зрізах нагадують тільця Гассаля. На нашу думку представляє інтерес той
факт, що найбільш стійкими структурами цих кистоподібних утворів є ядра,
клітинні мембрани та мембрани органел. Зазначені утвори сягають значних
розмірів, однак по мірі деградації їх вмісту, поступово зменшуються.

На 3-5 добу після гамма-опромінення характерною особливістю
ретикулоепітеліальних клітин кіркової речовини тимуса піддослідних
тварин є вакуолізація їх цитоплазми. В зазначені терміни відбувається
формування “кластерів” апоптозних лімфоцитів та ретикулоцитів, які
перебувають на різних фазах апоптозу і на різних стадіях деградації, що
дозволяє нам аргументувати послідовність цього процесу. Для першої
стадії характерною є агрегація ядерного хроматину, у тому числі і у
вигляді характерних “півмісяців”. Ядро набуває неправильної, іноді
полігональної форми, контури ядра стають звивисті. Випини ядра
відшнуровуються, внаслідок чого ядро поділяється на декілька частин,
кожна з яких містить брилки суперконденсованого хроматину.
Спостерігається мозаїчне руйнування мікрофіламентів, утворення локусів
конденсованої цитоплазми в ділянках групування органел. У другій стадії
ділянки конденсованої цитоплазми відшнуровуються з формуванням обмежених
мембраною апоптозних тілець. Останні містять один або декілька
фрагментів ядра, а подекуди лише частину цитоплазми. В окремих випадках
апоптозна клітина цілковито зморщується, перетворюється в одне сферичне
апоптозне тіло. Фагоцитоз апоптозних тілець характеризує третю стадію
процесу апоптозної деградації. Самі апоптозні тільця фагоцитуються
макрофагами, фагосоми в яких формуються за рахунок злиття первинних і
вторинних лізосом. В наступному фагоцитований матеріал руйнується із
збереженням неперетравлених залишків чи підлягає апоптозній
трансформації безпосередньо у цитоплазмі самого макрофага впродовж
тривалого часу. Четверта стадія характеризується наявністю апоптозних
тіл. Слід зазначити, що деякі фагоцитовані апоптозні тільця зберігають
свою структуру на самих пізніх стадіях апоптозу.

Результати проведеного дослідження дозволяють нам стверджувати, що на 3
добу виникають фазні зміни проникності стінки гемомікроциркуляторного
русла тимуса. Зокрема, у кірковій речовині тимуса виявляються обширні
поля з периваскулярним і міжклітинним набряком, а його зникнення
співпадає з підвищенням інтенсивності апоптозу на фоні посилення
трансмуральної міграції лімфоцитів. На 7-10 добу ці явища поєднуються з
вогнищевим зникненням лімфоцитів у тимусі (ефект “зоряного неба”) та
появою молодих тілець Гассаля.

Частина апоптозних тілець на 7-10 добу після опромінення не підлягає
фагоцитозу і залишається умовно “вільною” у складі апоптозних
компартментів. Решта апоптозних тілець звільняються з цитоплазми
макрофагів при руйнуванні їх клітинної оболонки. Такі “вільні” апоптозні
тіла в кистоподібних структурах тимуса підлягають спонтанній
дегенерації. При цьому апоптозні тіла набрякають, що веде до розриву їх
мембран. Цей процес руйнування “вільних” апоптозних тіл в кистоподібних
структурах можна умовно назвати вторинним некрозом, який відрізняється
від класичного некрозу клітин відсутністю запальної реакції. В кінцевому
результаті процес дегенерації більшості “вільних” апоптозних тіл
завершується тотальним руйнуванням мембран, органел цитоплазми,
евакуацією матеріалу в міжклітинний простір і формуванням кистоподібних
структур.

Таким чином, радіаційно-індукований апоптоз у тимусі вирізняється тим,
що апоптозу підлягають групи лімфоцитів (“кластери”), за рахунок
суттєвого збільшення чи/і злиття яких утворюються великі групи
апоптозних лімфоцитів та ретикулоепітеліоцитів (“компартменти”), що
дають початок кистоподібним структурам. Особливо велика їх кількість
виявляється на 10 добу після тотального опромінення в дозі 0,2Гр. Дані
електронно-мікроскопічного дослідження вказують, що саме у тварин цієї
експериментальної групи апоптозним змінам підлягають цілі групи
тимоцитів та окремі епітеліоретикулоцити. Цитоплазма таких апоптозних
клітин виглядає електронно-щільною та виповнюється дрібногранулярним
матеріалом. Мітохондрії містять просвітлений матрикс. Їх кристи та
внутрішня мембрана часто руйнуються. Важливо пам’ятати – апоптоз
тимоцитів у мишей в нормі характерний тим, що апоптозні тіла підлягають
так званому “випереджуючому фагоцитозу”. На противагу у тимусі мишей,
опромінених малими дозами радіації апоптозні тіла не завжди підлягають
фагоцитозу. Більше того, чисельні апоптозні тимоцити та
епітеліоретикулоцити у пізніх термінах експерименту взагалі не
фрагментуються на апоптозні тіла. Саме з цієї причини наявні скупчення
апоптозних тіл і апоптозних клітин перебувають в оточенні інтактних
клітин тимуса, створюючи постійну матеріальну основу для формування
кистоподібних структур. Звичайно, термін кистоподібні структури є
умовним, адже жодна із них не містила капсули. Щоправда, деякі із них
оточуються моношаром з’єднаних десмосомами епітеліоретикулоцитів, проте
більшість без різкої межі переходять у тканину тимуса. Центральні зони
таких структур зазвичай містять деградовані апоптозні клітини тимуса,
переважно тимоцити. Цікаво, що деградація захоплює усі компоненти цих
клітин, проте найбільш стійкими виявляються цитолема, каріолема,
мембрани органел, фрагменти хроматину і навіть окремі ядра. В аморфному
матриксі цих структур ми виявляли окремі фрагменти, що нагадували
лізосоми, фагосоми, мієліноподібні тіла, однак неушкоджені клітини
ніколи не були присутні. Особливо цікавим є той факт, що серед клітин,
розміщених поблизу центру кистоподібної структури, ідентифікуються
поодинокі секреторні епітеліоцити з неушкодженим ядром та інтактною
цитоплазмою.

Як засвідчують результати проведеного нами дослідження, утворення
кистоподібних структур при дії малих доз радіації є наслідком певного
інваріанту надлишкового апоптозу. Останній відрізняється від описаного в
літературі (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю.,2001; Green D.R., Evan
G.J.,2002; Hacker G.,2000) такими структурно-функціональними
особливостями: 1) окремі апоптозні клітини тимуса не фрагментуються на
апоптозні тіла; 2) новоутворені апоптозні тіла не фагоцитуються
макрофагами; 3) групи деградованих апоптозних клітин тимуса,
серед яких переважають тимоцити, формують центр кистоподібної структури;
4) до периферії зазначених центрів прилягають тимоцити та
епітеліоретикулоцити на різних фазах апоптозних змін, у тому числі і
активні, секреторні клітини.

При проведенні імуногістохімічного дослідження з метою виявлення
експресії рецепторів Fas(Apo-1/CD95) нами було встановлено, що в усіх
тварин контрольної та експериментальних груп експресія цих “рецепторів
смерті” була відсутня чи слабка (0-1 бал). Винятком були ювенільні миші
через 10 діб після опромінення в дозі 0,2Гр, в кірковій речовині тимуса
яких нами були виявлені вогнищеві скупчення Fas(Apo-1/CD95)-позитивних
лімфоцитів.

Дослідження проапоптотичного білка р53 в тимусі мишей після опромінення
в дозі 0,05Гр та 0,2Гр дозволило виявити низьку і нерівномірну експресію
антигену проапоптотичного білка р53 в ядрах лімфоцитів кіркової
речовини. В зонах локалізації епітеліоретикулоцитів кори, а також у
мозковій речовині тимуса зазначена реакція була взагалі від’ємною.
Водночас, після опромінення в дозі 0,2Гр у тимусі мишей була відзначена
виражена експресія антигену проапоптотичного білка р53 у лімфоцитах
кіркової речовини та її відсутність в епітеліоретикулоцитах кори та у
мозковій речовині. При цьому активація р53 в лімфоцитах кіркової
речовини була нерівномірною, суттєво зростала до 10 доби експерименту і
супроводжувалась формуванням обширних вогнищ посиленої експресії.

Приймаючи до уваги те, що глікопротеїни плазматичних мембран можуть бути
з успіхом використані для ідентифікації апоптозних клітин, а поява
кінцевих моносахаридних залишків в-D-галактози корелює з апоптозними
змінами лімфоцитів ми застосували лектин арахісу (PNA), який
характеризується вуглеводною специфічністю до вDGal?3DGalNAcDgal. В усіх
випадках при дослідженні і експериментальних груп, і в контролі у тимусі
нами не було відзначено експресії та модифікації рецепторів лектину
арахісу (PNA). Однак, ми відзначали їх посилене накопичення у тільцях
Гассаля, що вказує на суттєві зміни тих апоптозних клітин (і їх
залишків), які таки увійшли до складу тілець Гассаля. В даному контексті
мова може йти і про перебудову вуглеводних детермінант, і про прояв
зрушень ферментативних систем, процесів синтезу та секреції біологічно
активних речовин у тимусі.

Ультраструктурний аналіз засвідчив, що в усіх термінах експерименту має
місце локальний лізис плазматичної мембрани окремих лімфоцитів тимуса та
мозаїчні зміни їх мітохондрій: 1) нерівномірність розмірів і щільності
матриксу міжмембранного, внутрішньокристного і міжкристного просторів;
2) локальне (подекуди навіть повне) руйнування мітохондріальних крист;
3) порушення (іноді обширне) цілісності внутрішньої мембрани; 4)
порушення цілісності зовнішньої мембрани. Картин тотального руйнування
мітохондрій (навіть за умов обширних дефектів плазмолеми) не
спостерігали.

Стереологічний аналіз показав, що в тимусі контрольних мишей середня
площа зрізу профілю лімфоцита становить (23,53(1,11)х10-2мкм2 при
середній площі ядра (17,77(0,87)х10-2мкм2. Через 6 годин після
радіаційної експозиції показники середніх площ лімфоцитів та їх ядер
статистично залишаються на рівні контрольних і становлять
(22,65(1,61)х10-2мкм2 та (15,51(1,17)х10-2мкм2 відповідно. Через 24
години показник середньої площі лімфоцита статистично перевищує
аналогічний показник як в групі вікового контролю, так і в попередній
групі, тоді як показник середньої площі ядра залишається статистично
незмінним (табл.2). Ця ж направленість змін зберігається і через 5 діб
після опромінення – площа лімфоцитів статистично достовірно зростає в
порівнянні з контролем і після 24 годин, тоді як показник середньої
площі ядра залишається статистично незмінним. Через 10 діб після
опромінення показник середньої площі лімфоцитів та їх ядер статистично
значимо зменшується і не лише сягає контрольних величин, але і
статистично значимо нижче їх (табл.2).

Таблиця 2. Динаміка стереологічних показників лімфоцитів тимуса
після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр

Площа лімфоцита, 10-2мкм2 Площа ядра, 10-2мкм2

Контроль 23,53 ± 1,11 17,77 ± 0,87

6 год 22,65 ± 1,61 15,51 ± 1,17

24 год 28,35 ± 1,98*,** 19,89 ± 1,46

5 діб 34,38 ± 2,33*,** 20,6 ± 1,55

10 діб 19,09 ± 1,46** 13,31 ± 1,12**

Примітка: * — достовірно по відношенню до контрольної групи, (р<0,05) ** - достовірно по відношенню до попередньої групи, (р<0,05) Щодо стереологічних показників мітохондрій, слід відзначити, що показники об’ємної і кількісної щільності мітохондрій, в усі досліджувані нами терміни спостережень не підлягають достовірним коливанням. Разом з тим, зміни показника середньої площі мітохондрій та площі міжкристного простору у першу добу після радіаційного впливу аналогічні змінам показників середньої площі лімфоцитів. Через 6 годин після опромінення досліджувані площі не змінюються, однак через 24 години статистично достовірно перевищують відповідні показники в контролі (табл.3). На 5 добу після опромінення показники площі мітохондрій та міжкристних просторів достовірно зменшуються і наближаються до контрольних величин. Водночас, якщо через 10 діб експерименту показник площі мітохондрій залишається на попередньому рівні, то показник площі міжкристних просторів знову різко зростає. Показник кількісної щільності крист помітно знижується вже через 6 годин після опромінення, після чого залишається меншим від контрольних показників і через 1, 5 та 10 діб (табл.3). Таблиця 3. Динаміка стереологічних показників мітохондрій лімфоцитів тимуса після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр Об’ємна щільність мітохондрій, % Кількісна щільність мітохондрій, 10-2/мкм3 Площа мітохондрій, 10-2мкм2 Площа міжкристного простору, 10-2мкм2 Кількісна щільність крист, 10-2/мкм3 Контроль 1,99±0,40 20,64±4,54 12,45±0,79 0,49±0,02 166,5±15,8 6 год 2,10±0,33 17,87±3,23 14,57±0,80 0,46±0,03 118,9±18,7* 24 год 2,91±0,53 19,56±4,70 17,74±1,02*,** 0,59±0,03*,** 108,0±15,3* 5 діб 2,30±0,34 20,06±3,50 14,68±0,76*,** 0,48±0,02** 128,0±16,6* 10 діб 3,06±0,65 25,70±5,55 14,41±0,63* 0,62±0,03** 114,5±17,4* Примітка: * - достовірно по відношенню до контрольної групи, (р<0,05) ** - достовірно по відношенню до попередньої групи, (р<0,05) Проведений нами стереологічний аналіз пострадіаційної динаміки змін лімфоцитів та їх мітохондрій засвідчив, що ці величини і, в першу чергу розмірні показники, зазнають певних коливань, природа яких, за даними літератури (Афонина Г.Б., Яценко В.П.,2001) відображає зміни проникності плазматичних мембран і мембран органел для трансмембранних потоків. Зростання площі лімфоцитів через 24 години і 5 діб після опромінення свідчить про переважання у ці періоди трансмембранних переміщень, спрямованих з інтерстиційних просторів у клітину, що і призводить до їх набряку. На 10 добу зменшення клітинних розмірів може, з одного боку, відображати зміну трансмембранних потоків в напрямку з клітини у міжклітинну речовину, з іншої – загибель збільшених у розмірах та уражених лімфоцитів. Про зміну трансмембранних потоків, спочатку у клітину, згодом – навпаки, свідчать також зміни метричних показників мітохондрій та їх міжкристних просторів. Зниження цих показників на 5 добу після опромінення, коли показники середньої площі лімфоцитів все ще продовжують наростати, можуть вказувати на значно більшу чутливості мітохондріальних мембран до радіаційного впливу. Це підтверджується і відповідним показником кількісної щільності крист, який статистично достовірно зменшується вже через 6 годин після опромінення і залишається на зниженому рівні впродовж усього періоду спостережень. Виявлені нами ультраструктурні та морфометричні зміни мітохондрій переконливо свідчать про їх активну участь у регуляції апоптозу і дозволяють поряд з іншими авторами (Kroemer G., Reed J.C.,2000; Kuwana T. et al.,2002) стверджувати, що цей процес не є хаотичним і асинхронним. Аналізуючи пострадіаційну динаміку змін таких стереологічних показників лімфоцитів як площа лімфоцита та його ядра, можливо прийти до висновку, що вони відображають складний комплекс адаптаційної перебудови метаболізму, котрий включається як інтегральна реакція клітини на пошкодження ДНК. Логічно припустити, що за умов дії радіації індукуються не тільки гени апоптозу, але і гени “стресорної відповіді”. Останні запускають програму репарації уражених лімфоцитів і активують фагоцитарну активність макрофагів, які, за даними літератури (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,2002) забезпечують елімінацію апоптозних лімфоцитів. Таким чином, результати проведеного нами дослідження свідчать, що: 1) під дією малих доз радіації відбувається виразний апоптоз на тлі ознак помірного некрозу серед клітинних популяцій тимуса; 2) обидві форми клітинної смерті завершуються зупинкою існування та елімінацією залишків клітин, що реалізується достатньо своєрідно; 3) апоптозні клітини (чи тільця) та некротичні клітини підлягають фагоцитозу, порушення якого призводить до утворення кистоподібних структур; 4) фагоцитоз та формування кистоподібних структур гальмують запальний процес у тимусі і забезпечують можливість його функціонування як центрального органу імуногенезу. Зазначене вище спонукало нас вивчити можливу опосередковану (через ураження тимуса) дію малих доз гамма-випромінювання на інші органи імунної системи мишей лінії BALB/c. Одноразове опромінення малими дозами гамма-випромінювання не викликає суттєвих змін у структурі селезінки. Загальний вигляд співвідношення білої та червоної пульпи селезінки впродовж усіх термінів експерименту практично не змінюється. На світлооптичному рівні відмічено, що лімфатичні вузлики виглядають дещо крупнішими, їх гермінативні центри розширені, мантійна зона звужується. Декотрі вузлики зливаються між собою та оточуються спільною маргінальною зоною. Периартеріальні лімфатичні піхви на відміну від контролю є більш широкими, щільним кільцем оточують судини. В червоній пульпі зустрічаються обмежені ділянки крововиливів. Звертає на себе увагу нерівномірна щільність розподілу лімфоцитів. У ранні терміни після гамма-опромінення (6год, 1-3 доба) виявляється загальна тенденція до локальної деструкції цитолеми лімфоцитів, але у білій пульпі проявів некрозу лімфоцитів не спостерігається, тоді як некротичні процеси є характерними для клітинних популяцій червоної пульпи. Саме у цьому періоді в обидвох пульпах виявляються поодинокі апоптозні лімфоцити. Слід відзначити, що при дії гамма-опромінення в дозі 0,2Гр у ранніх термінах експерименту поодинокі апоптозні лімфоцити виявляються також і у радіорезистентних периартеріальних лімфатичних піхвах. Окрім апоптозних клітин тут виявляються макрофаги та поодинокі лімфоцити. Через 3 доби після тотального опромінення в дозі 0,2Гр у червоній пульпі виявляються чисельні некротично змінені клітинні елементи крові і макрофаги. Ця ж зона на 5-10 добу після опромінення дозою 0,2Гр містить велику кількість ушкоджених еритроцитів та апоптозно змінених лімфоцитів. & , E O O i ? E o 4 t & ( * , D ? Ae AE E E E I I ? O O i i ? „o dh^„o „\ dh^„\ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ ????????? kd' kdAE Гр) є зморщування клітини, зменшення її розміру. Закономірне ущільнення цитоплазматичного матриксу адекватне щільності ядерного матриксу. При дії дози 0,2Гр найбільш характерними проявами є брилчаста конденсація цитоплазматичного матриксу, помірна деструкція мітохондрій (супроводжується формуванням поодиноких мієліноподібних тіл), розширення канальців гранулярної ендоплазматичної сітки. Всі ці зміни ідентифікуються на фоні послідовних змін з боку ядра клітин. Останні закінчуються конденсацією хроматину по периферії каріолеми (іноді, за типом півмісяця) та руйнуванням ядра на різні за величиною фрагменти, оточені власною нуклеолемою. Також на 5-у і особливо 10-у доби експерименту відзначено масивний апоптоз ретикулярних клітин, які втрачають контакт з іншими ретикулоцитами і лімфоцитами, зморщуються, зменшуються у розмірах. Щільність їх цитоплазми сягає щільності ядерного матриксу, ядро ділиться перетяжками на сегменти. При цьому має місце їх тісний контакт з інтактними ретикулоцитами строми і макрофагами. Результатом подібних змін є руйнування апоптозних клітин на декілька апоптозних тіл, котрі дуже швидко фагоцитуються. На 7-10 добу в аналогічних ділянках селезінки виявляються компартменти, що складаються з апоптозних лімфоцитів на самих різних стадіях апоптозу. У тварин, опромінених дозою 0,2Гр, апоптозу підлягають навіть окремі ретикулярні клітини, відростки яких втрачають контакти з іншими ретикулярними клітинами. Згодом, апоптозно змінені клітини округляються, втрачають характерну відростчастість, а їх ядра фрагментуються без втрати цілісності каріолеми. У дистальних ділянках деяких селезінкових тяжів визначаються обмежені плазмолемою апоптозні тільця, які мають здебільшого сферичну чи овоїдну форму. Відзначимо, що кількість цих тілець у порівнянні з такими в тимусом є дуже незначною, а їх розмір і склад сильно варіюються. Деякі апоптозні тільця містять один чи декілька фрагментів ядра та інтактні органели, за виключенням зруйнованих мікрофіламентів. Інші апоптозні тільця представлені виключно фрагментами цитоплазми. Цілком очевидно, що невелика кількість апоптозних тілець в селезінкових тяжах пов’язана з високою фагоцитарною активністю макрофагів червоної пульпи. У цей же час відбувається активація макрофагів крайової зони білої та червоної пульпи селезінки, котра за термінами випереджує апоптозні зміни її лімфоцитів та характеризується деякою “надлишковістю”, що пов’язано як з безпосередньою чутливістю макрофагів до застосованого в експерименті випромінювання, так і зі змінами в мікрооточенні, які в ранніх термінах експерименту ще структурно не візуалізуються (Wang G.-Q. et al.,2001). З іншого боку не виключається думка (Liu H., Ma Y., Cole S.M., Zander C.,2003), що макрофаги можуть виступати в ролі модуляторів чи навіть індукторів апоптогенних ефектів радіації. Макрофаги цих ділянок мають неправильну багатовідростчасту форму і утворюють цитоплазматичні псевдоподії, що є морфологічним підтвердження їх амебоїдного руху та активного фагоцитозу. При проведенні імуногістохімічного дослідження з метою виявлення експресії рецепторів Fas(Apo-1/CD95) та проапоптотичного білка р53 нами було встановлено, що у всіх тварин контрольної та експериментальної груп експресія вивчених “рецепторів смерті” та білка р53 була відсутня чи слабка (0-1 бал). Винятком були лише миші через 10 діб після гамма-опромінення в дозі 0,2Гр, у мантійній зоні селезінки яких були виявлені вогнищеві скупчення Fas(Apo-1/CD95)-позитивних лімфоцитів та вогнищеві скупчення р53-позитивних лімфоцитів. Нами підтверджено, що в ранні строки експерименту має місце локальний лізис плазматичної мембрани лімфоцитів В-залежних (лімфатичні вузлики) і Т-залежних (периартеріальні лімфатичні піхви) зон білої пульпи селезінки, а також мозаїчноподібні зміни їх мітохондрій, а саме: 1) нерівномірність розмірів і щільності матриксу міжмембранного, внутрішньокристного та міжкристного просторів; 2) локальне або повне руйнування мітохондріальних крист; 3) порушення цілісності внутрішньої і/або зовнішньої мітохондріальних мембран. Застосовуючи стереологічний аналіз динаміки пострадіаційних змін нами було встановлено, що у інтактних мишей середня площа Т-лімфоцитів складає (18,12±2,26)х10-2мкм2 при середній площі зрізу ядра (13,25±2,04)х10-2мкм2 (табл.4), тоді як В-лімфоцитів відповідно (24,65± 3,00)х10-2мкм2 при середній площі ядра (13,30± 1,95)х10-2мкм2 (табл.5). Ці дані вказують на те, що В-лімфоцити істотно відрізняються від Т-лімфоцитів за розмірами цитоплазми, що зумовлюється їх різною функціональною направленістю і великою насиченістю цитоплазми органелами біосинтетичного плану. Таблиця 4. Динаміка стереологічних показників Т-лімфоцитів селезінки після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр Площа лімфоцита 10-2мкм2 Площа ядра 10-2мкм2 Контроль 18,12 ± 2,26 13,25 ± 2,04 6 год 17,12 ± 3,41 12,05 ± 2,36 1 доба 16,99 ± 1,98 12,31 ± 1,58 5 діб 13,83 ± 1,38 10,55 ± 1,93 10 діб 16,23 ± 1,18 11,99 ± 1,38 Через 6 годин після опромінення площа В-лімфоцитів і їх ядер статистично перевищує аналогічні показники у контролі і дорівнюють (34,18± 2,41)х10-2 мкм2 і (21,84± 1,34)х10-2 мкм2 відповідно. Через 24 години площа В-лімфоцитів зростає, тоді як площа ядра залишається незмінною у порівнянні з попереднім терміном. На 5 добу ці ж показники достовірно зменшуються у порівнянні з 1 добою і наближаються до контрольних через 10 діб (табл.5). Стереологічний аналіз стану мітохондрій обидвох типів лімфоцитів показав, що ці мембранні органели виявляються досить стійкими до радіаційного впливу і практично не змінюються впродовж експерименту (табл.6,7). Таблиця 5. Динаміка стереологічних показників В-лімфоцитів селезінки після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр Площа лімфоцита, 10-2мкм2 Площа ядра, 10-2мкм2 Контроль 24,65 ± 3,00 13,30 ± 1,95 6 годин 34,18 ± 2,41* 21,84 ± 1,34* 1 доба 41,02 ± 1,84*,** 23,86 ± 1,30* 5 діб 30,74 ± 2,67** 18,97 ± 2,47 10 діб 23,02 ± 2,97 13,88 ± 1,40 Примітка: * - достовірно по відношенню до контрольної групи (р<0,05) ** - достовірно по відношенню до попередньої групи (р<0,05) Таблиця 6. Динаміка стереологічних показників мітохондрій Т-лімфоцитів селезінки після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр Об’ємна щільність мітохондрій, % Кількісна щільність мітохондрій, 10-2/мкм3 Площа мітохондрій, 10-2мкм2 Контроль 1,67 ± 0,52 9,72 ± 3,08 18,82 ± 2,35 6 годин 1,08 ± 0,78 5,96 ± 4,08 18,88 ± 3,39 1 доба 2,05 ± 0,59 7,34 ± 1,06 23,10 ± 3,50 5 діб 1,48 ± 0,68 6,96 ± 3,08 16,98 ± 4,59 10 діб 0,83 ± 0,65 9,04 ± 6,83 11,79 ± 4,01 Таблиця 7. Динаміка стереологічних показників мітохондрій В-лімфоцитів селезінки після тотального г-опромінення у дозі 0,2 Гр Об’ємна щільність мітохондрій, % Кількісна щільність мітохондрій, 10-2/мкм3 Площа мітохондрій, 10-2мкм2 Контроль 4,54 ± 0,74 16,52 ± 2,49 25,91 ± 2,61 6 годин 2,86 ± 0,81 15,31 ± 5,85 22,56 ± 2,50 1 доба 2,49 ± 0,50 16,03 ± 5,08 17,79 ± 1,14 5 доба 2,89 ± 0,47 11,84 ± 2,10 23,12 ± 1,62 10 діб 2,09 ± 0,18 13,17 ± 0,02 18,44 ± 1,42 Починаючи з 6-24 години після опромінення в брижових лімфатичних вузлах виявляються апоптозні та некротичні зміни поодиноких лімфоцитів, які поєднуються з помірними або вираженими некротичними змінами клітин їх безпосереднього мікрооточення. Субкапсулярні та проміжні кіркові синуси брижових лімфатичних вузлів різко розширені та переповнені лімфоцитами, окремі з яких перебувають у стані апоптозної трансформації. На 3-5 добу після тотального опромінення в дозі 0,2Гр у брижових лімфатичних вузлах спостерігали зменшення набряку, спадання субкапсулярних синусів, появу довкола венул макрофагів обширних груп різко гіперхромних та апоптозних лімфоцитів. На електронних мікрофотографіях в гермінативних центрах лімфатичних вузликів на 5 добу експерименту визначалися активно фагоцитуючі групи макрофагів. На 5-7 добу експерименту кількість апоптозних лімфоцитів у гермінативних центрах лімфатичних вузликів суттєво збільшувалася, відповідно збільшувалася і кількість самих макрофагів з фагоцитованими апоптозними тілами. Також нами був відзначений фагоцитоз великих апоптозних тіл (або, навіть, цілих апоптозних лімфоцитів), залишки яких спостерігаються в цитоплазмі макрофагів гермінативного центру. При цьому слід зауважити, що плазматична мембрана і органели деяких макрофагів виглядали пошкодженими. Найбільш виражені апоптозні зміни були зафіксовані саме у паракортикальній зоні брижових лімфатичних вузлів, поблизу посткапілярних венул з високим ендотелієм. Особливістю зазначених судин є те, що через їх стінку, мігрують лімфоцити в стані апоптозу. В паренхімі брижових лімфатичних вузлів останні фрагментуються на апоптозні тіла, котрі в свою чергу невдовзі поглинаються паравазально розміщеними макрофагами. Цікаво, що суттєве підвищення активності апоптозу лімфоцитів і зникнення набряку на тлі посилення трансмуральної міграції (рециркуляції) лімфоцитів за часом співпадає із появою молодих тілець Гассаля та вогнищевим зникненням лімфоцитів у тимусі (ефект “зоряного неба”) на 7-10 добу після гамма-опромінення. Описані вище апоптозні прояви в рамках вивчених термінів експерименту) характеризуються деякою монотонністю, котра змінюється на 7 і ще більшою мірою на 10 добу після опромінення дозами 0,05Гр і 0,2Гр. У брижових лімфатичних вузлах зазначених груп тварин апоптозно змінені лімфоцити виявляються практично в усіх полях зору. Особливо масивний характер апоптоз лімфоцитів носить у паракортикальній зоні. Ідентифікація дрібних апоптозних тілець представляє великі труднощі, не дивлячись на наявність в декотрих з них базофільних мас хроматину. Для апоптозних лімфоцитів характерними є звивисті контури та конденсована цитоплазма, у якій виявляються гіперхромні ядра. При цьому чітко прослідковуються тенденція до формування груп апоптозних клітин: спершу – кластерів, а згодом – компартментів. І все ж таки найбільш виразно ці ознаки ідентифікуються саме при електронно-мікроскопічному дослідженні. У великих кластерах серед апоптозних лімфоцитів спостерігаються поодинокі ушкоджені ретикулоцити. Апоптозно змінені ретикулярні клітини та їх апоптозні тільця у 2-3 рази крупніші за лімфоцити, значно гірше фагоцитуються макрофагами, що неминуче сприяє зростанню кількості нефагоцитованих, вільних апоптозних тілець. Все це призводить до збільшення кількості продуктів експресії апоптозу і заміни кластерів апоптозних клітин на їх компартменти. При проведенні імуногістохімічного дослідження нами було встановлено, що у всіх тварин контрольної та експериментальних груп експресія білка р53 та “рецепторів смерті” Fas(Apo-1/CD95) в клітинах брижових лімфатичних вузлів була відсутня або слабка (0-1 бал). Характерною на 1-3 добу після опромінення є виражена фагоцитарна активність обширних груп паравазальних макрофагів, цитоплазма яких містить рештки апоптозних тіл. Як відомо, паракортикальна зона – це Т-залежна зона, через посткапілярні венули з високим ендотелієм якої здійснюється міграція рециркулюючих лімфоцитів у паренхіму лімфатичного вузла (Сапин М.Р., Никитюк Д.Б.,2000; Kraal G., Mebius E.,1996). У паракортикальній зоні брижових лімфатичних вузлів ювенільних мишей контрольної групи нами виявлені посткапілярні венули, товщина котрих корелює з розмірами Т-лімфоцитів. Міграцію апоптозних лімфоцитів через стінку посткапілярних венул брижових лімфатичних вузлів на ультратонких зрізах в контрольній групі зафіксувати не вдалось. Після опромінення у гемомікроциркуляторному руслі брижових лімфатичних вузлів прослідковуються фазні зміни. На 1-3 добу після опромінення у дозах 0,05Гр і 0,2Гр виявляється виражений набряк лімфатичних синусів, помірне розширення венул та спазм артеріол. Отримані нами дані також свідчать про виражену реакцію ендотелію судин брижових лімфатичних вузлів на дію малих доз радіації. Зазначена реакція проявляється своєрідним підтягуванням цитоплазми до ядра, стоншенням маргінальної зони, вип’ячуванням у просвіт судини навколоядерної зони ендотеліоцита, що веде до змін форми клітин. В їх цитоплазмі виявляються нові пучки мікрофіламентів із перерозподілом вже існуючих – феномен структуралізації цитоскелету. Зникають такі характерні в нормі для кровоносних капілярів та венул фокальні перицит – ендотеліальні контакти, які, за даними класиків морфології (Куприянов В.В., Бобрик И.И., Караганов Я.Л.,1986) забезпечують контактне гальмування, необхідне для підтримки цілісності ендотеліального пласту. Крім того на поверхні ендотеліоцитів з’являються складки, мікроворсинки, випини та міхурі, які локалізуються поблизу навколоядерної зони ендотеліальних клітин. Водночас спостерігається набряк та локальне стоншення базальної мембрани. В окремих ділянках судинної стінки ознаки збільшення рухливості ендотеліоцитів включають характерну округлу чи пелюсткоподібну форму ядра. Починаючи з ранніх строків експерименту спостерігається зморщування ядерної оболонки окремих ендотеліоцитів і агрегація хроматину, який утворює зубці вздовж ядерної оболонки та вщерть заповнює пелюсткоподібні вип’ячування. Ці зміни відповідають описаним у літературі початковим стадіям запрограмованої загибелі ендотеліоцитів. Апоптозно видозмінені клітини виявляються і у посткапілярних венулах. Цитоплазма таких ендотеліоцитів ущільнюється, у мітохондріях руйнуються кристи. На люменальній поверхні апоптозних ендотеліоцитів ідентифікуються чисельні вип’ячування, окремі з яких підлягають демаркації у просвіт гемосудини. Можна припустити, що апоптозні ендотеліоцити зміщуються в напрямку до просвіту судин, не втрачаючи міжендотеліоцитних контактів, а їх місце займають інші ендотеліальні клітини. Згодом, апоптозні ендотеліоцити втрачають міжклітинні контакти та злущуються у просвіт судини. Істотне зростання рухливості ендотеліоцитів стінки судин гемомікроциркуляторного русла брижових лімфатичних вузлів після дії малих доз гамма-випромінювання і десквамація апоптозних ендотеліоцитів супроводжуються збільшенням кількості мікровезикул, стоншенням ендотеліального пласту, появою чисельних трансендотеліальних каналів та не характерних для норми фенестр. Останні виявляються в посткапілярних венулах вже на 3 добу після опромінення і являють собою редуковані трансендотеліальні канали. Слід припустити, що навіть за умов нестабільності та швидкоплинності ідентифікованих нами процесів, вони неминуче повинні призвести до викривлень трансендотеліальної міграції лімфоцитів та порушення лімфоцитарного хомінга. На 5-10 добу після опромінення в дозах 0,05Гр і 0,2Гр спостерігається добре виражена міграція лімфоцитів через розташовані в паракортикальній зоні посткапілярні венули з високим ендотелієм, яка характеризується певними особливостями. Просвіт і зовнішній контур посткапілярних венул з високим ендотелієм має неправильну конфігурацію. Високий ендотелій відзначається нерівними контурами люменальної поверхні, присутністю ділянок стоншення цитоплазми у зонах їх контакту. Це сприяє формуванню заглиблень, що сповільнюють кровоплин і збільшують зону та час взаємодії з лімфоцитами. Форма лімфоцитів на усіх етапах трансмуральної міграції практично не змінюється. Мігруючі лімфоцити вп’ячуються в ендотеліоцити та істотно змінюють їх конфігурацію. При цьому ендотеліальне вистелення впинається у просвіт, що слугує додатковим фактором сповільнення кровоплину. Не виключено, що у міграції велику роль відіграють білки адгезії (Picker L.G.,1994). Про це може свідчити поява водночас декількох лімфоцитів, що перебувають на різних етапах міграції, в невеликому локусі стінки посткапілярної венули. Істотно не змінюючи форми лімфоцит мігрує через ендотеліоцит, проходить крізь базальну мембрану. Нездатність описаних нами лімфоцитів до зміни власної форми вказує на порушення фізико-хімічних властивостей їх цитоскелету. Ми не відзначали фрагментації лімфоцитів на апоптозні тіла безпосередньо у просвіті судин. У той же час поблизу деяких посткапілярних венул з високим ендотелієм ідентифікувалися поодинокі апоптозні лімфоцити, переважно на ранніх стадіях апоптозних змін, а також макрофаги, в цитоплазмі котрих визначались рештки фагоцитованих апоптозних тіл. Таким чином, отримані нами результати засвідчують можливість трансмуральної міграції апоптозно видозмінених лімфоцитів, що суттєво доповнює концепцію впливу малих доз радіації на імунну систему. В цьому випадку міграція та рециркуляція апоптозних Т-лімфоцитів свідчить про порушення балансу процесів оновлення цих клітин та їх безперервного обігу. Аналізуючи в цілому ультраструктурні зміни клітин брижових лімфатичних вузлів після тотального опромінення мишей малими дозами гамма-опромінення, можливо припустити, що вони віддзеркалюють складний комплекс адаптаційної перебудови імунної системи. Зазначена перебудова реалізується як інтегральна реакція клітин на радіаційне пошкодження. Найбільш вірогідно, що гамма-опромінення індукує не тільки гени апоптозу, але і гени “стресорної відповіді”. Останні: 1) актуалізують програму прискорення рециркуляції лімфоцитів і їх міграції через стінку посткапілярних венул з високим ендотелієм; 2) запускають програму “евакуації” надлишкової кількості апоптозно змінених лімфоцитів з тимуса; 3) активують фагоцитарну функцію макрофагів брижових лімфатичних вузлів. Загалом, малі дози застосованого в експерименті гамма-випромінювання призводять до істотних змін трансмуральної міграції лімфоцитів через стінку посткапілярних венул з високим ендотелієм у брижових лімфатичних вузлах. Ці зміни мають дуалістичний характер і можуть бути трактовані як прояви втрати контролю над вибірковістю міграції, та як компенсаторно-пристосувальні. У більшості сучасних наукових праць, присвячених регуляції чисельності клітин у багатоклітинному організмі, вказується не те, що вона відбувається завдяки делікатному балансуванню між процесами проліферації та загибелі клітин (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,2001; Белушкин Н.Н., Северин С.Е.,2001; Дъяченко А.А., Дъяченко А.Г.,2001). Одержані нами дані дозволяють погодитись з провідною роллю балансу між процесами проліферації та загибелі клітин у регуляції чисельності клітинних популяцій вивчених нами органів імунної системи, але кількість клітин у кожному конкретному компартменті лімфоїдного органу може залежати і від інших суттєвих обставин. Зокрема, чисельність лімфоцитів може змінюватися внаслідок процесів внутрішньоорганної міграції – активного переміщення нормальних і апоптозних лімфоцитів з однієї території на іншу. Кількість таких лімфоцитів у конкретному компартменті лімфоїдного органу може також змінитися за рахунок підсилення чи гальмування швидкості їх рециркуляції та змін інших факторів, що забезпечують лімфоцитарний хомінг. У якості основних механізмів компенсації наслідків досліджуваного нами радіаційно-індукованого апоптозу лімфоцитів можна запропонувати: 1) стимулювання механізмів інгібування їх апоптозу; 2) індукція проліферативної активності клітин; 3) підвищення внутрішньоорганної міграції та рециркуляції лімфоцитів. Що стосується брижових лімфатичних вузлів опромінених мишей, то в них останній механізм проявляє себе найбільш масштабно, тоді як перші два, судячи з усього, залишаються не задіяними (що в свою чергу забезпечує захист від потенційного онкогенезу). ВИСНОВКИ У дисертаційному дослідженні сформульовано теоретичне узагальнення і нове вирішення проблеми морфологічної сутності впливу малих доз радіації на розвиток органів імунної системи. Отримані дані є підґрунтям для наступних експериментальних досліджень у галузі морфології. 1.Морфологічні зміни в тимусі, селезінці і брижових лімфатичних вузлах ювенільних мишей-самців лінії BALB/c після зовнішнього тотального одноразового гамма-опромінення в дозах 0,05Гр і 0,2Гр відзначаються виразною своєрідністю, яка проявляється специфікою просторових і часових особливостей загибелі лімфоцитів і клітин їх мікрооточення. Узагальнюючи зазначені особливості у пострадіаційних морфологічних змінах клітинних популяцій імунних органів можна виділити феномени “квантування”, “кластеризації” та “компартменталізації”. 2.Феномен “квантування” проявляється тим, що в ранні строки експерименту одні клітини залишаються інтактними, інші характеризуються ознаками апоптозу, а ще інші – ознаками некрозу. Феномен “кластеризації” характеризується появою спочатку поодиноких змінених лімфоцитів, а згодом і їх груп. У тимусі поєднання цього феномену з евакуацією лімфоцитів проявляється ефектом “зоряного неба” – вогнищевим зникненням лімфоцитів. Збільшення кількості або ж злиття декількох кластерів апоптозних лімфоцитів приводить на 7 добу після опромінення до розвитку феномену “компартменталізації”, який в тимусі носить органоспецифічний характер і проявляється утворенням кистоподібних структур, що на світлооптичному ріні мають вигляд тілець Гассаля. 3.Прояв феномену “квантування” у тимусі за часом співпадає із активацією білка р53, яка обумовлює пригнічення поділу клітин (забезпечуючи таким чином можливість репарації багатьох лімфоцитів) і викликає р53-залежну індукцію апоптозу. “Квантування”, “кластеризація” та “компартменталізація” у тимусі та селезінці є результатом розгорнутої у часі реалізації різних шляхів трансдукції апоптозного сигналу: а) рецептор-залежного шляху з участю рецепторів Fas(Apo-1/CD95); б) рецептор-незалежних шляхів (р53-залежного та мітохондріального), а також мультиплікації різноманітних проявів апоптозу, який індукований малими дозами іонізуючого випромінювання. 4.Центральні частини кистоподібних структур тимуса опромінених тварин містять клітинний детрит і деградовані апоптозні клітини, серед яких переважають лімфоцити. Іноді вони оточуються моношаром з’єднаних десмосомами епітеліоретикулоцитів, але частіше всього без різкої межі переходять в незмінену тканину тимуса. Такі кистоподібні формуються як результат порушення розпаду апоптозних клітин на апоптозні тільця та порушень їх фагоцитозу. 5.Радіаційно-індуковані зміни клітин досліджуваних органів характеризуються поєднанням ознак їх апоптозу з вираженим локальним руйнуванням плазматичної мембрани розташованих поряд апоптозно незмінених лімфоцитів. При цьому у радіаційно-індукованому апоптозі клітин виділяються 3 фази: 1) фаза ініціації; 2) ефекторна фаза; 3) фаза деградації. 6.Морфологічним проявом фази ініціації є ураження мітохондрій лімфоцитів, що переконливо свідчить про мітохондріальний шлях трансдукції сигналу апоптозу. Для ефекторної фази характерними є агрегація ядерного хроматину у вигляді крупних брилок, розташованих вздовж внутрішньої поверхні ядерної мембрани, ускладнення конфігурації контурів ядра і ядерця, закриття ядерних пор. Фаза деградації включає три послідовних стадії: 1) початкову, в якій ядро та цитоплазма конденсуються і ядро розділяється на декілька фрагментів; 2) стадію утворення апоптозних тілець і 3) стадію – фагоцитозу цих тілець. 7.Апоптоз, що відбувається в нормі, суттєво відрізняється від радіаційно-індукованого апоптозу: наступним шляхом апоптозу асинхронно гинуть лише окремі клітини; він характеризується усіма “класичними” ознаками і не поєднується з некрозом; відбувається “швидко”, із-за чого неможливо чітко виділити його фази і розмежувати стадії. 8.Важливу роль в інтегративній клітинній реакції на опромінення малими дозами відіграють макрофаги досліджуваних органів імунної системи, які при різній активності фагоцитарної реакції одними із перших реагують на дію гамма-випромінювання. Зазначена реакція оцінюється як адекватна з боку макрофагів селезінки і брижових лімфатичних вузлів і як спотворена з боку мікрофагів тимуса. Останні, на відміну від макрофагів селезінки та брижових лімфатичних вузлів фагоцитують не лише апоптозні тільця, а й цілі апоптозні лімфоцити, які ідентифікуються в їх цитоплазмі. Зазначене явище свідчить не тільки про своєрідну “обжерливість” макрофагів, а і про їх неспроможність “переварити” фагоцитований матеріал, що веде до їх деградації і цитолізу, з утворенням клітинного детриту, який додається до кистоподібних структур тимуса. 9.При радіаційно-індукованому апоптозі виникають фазні зміни у гемомікроциркуляторному руслі тимуса і брижових лімфатичних вузлів, які проявляються збільшенням “висоти” ендотелію посткапілярних венул у тимусі, трансформацією високого ендотелію посткапілярних венул брижових лімфатичних вузлів у фенестрований ендотелій, що у часі співпадають із активацією трансмуральної міграції лімфоцитів та апоптозними змінами ендотеліоцитів. У зв’язку з трансмуральною міграцією апоптозних лімфоцитів останній набуває хвилеподібного перебігу, а кожна нова хвиля його морфологічних проявів запускається і підтримується каскадною системою продуктів експресії апоптозу. 10.Узагальнюючи досліджувані ефекти впливу малих доз радіації на органи імунної системи і оцінюючи їх прогностичне значення слід зробити висновок, що феномен “квантування” відображає різноманітну первинну реакцію клітин на опромінення, яка проявляється їх різною апоптогенною готовністю, тоді як феномени “кластеризації” та “компартменталізації” свідчать про зміни міжклітинних взаємодій у мікрорегіонах досліджуваних органів, а також про взаємний вплив апоптозних лімфоцитів і клітин мікрооточення, неминучим фіналом чого є їх деградація. В цьому контексті виявлені пострадіаційні морфологічні зміни віддзеркалюють істотне неблагополуччя органів імунної системи в їх постнатальному розвитку і свідчать про їх якісну перебудову, адаптаційна направленість якої носить не зовсім стійкий характер. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1.Мотуляк А.П. Ультраструктурні аспекти апоптозу тимоцитів мишей у нормі та при дії низьких доз іонізуючого випромінювання // Вісник проблем біології і медицини. – 2001. – №4. – С.84-88. 2.Мотуляк А.П. До питання про гістогенез кистоподібних структур у тимусі ювенільних мишей після дії іонізуючого випромінювання // Галицький лікарський вісник. – 2001. – Т.8,№4. – С.68-70. 3.Мотуляк А.П. Структурні зміни судин гемомікроциркуляторного русла брижових лімфатичних вузлів мишей після дії низьких доз гамма-випромінювання // Буковинський медичний вісник. – 2002. – Т.6,№2. – С.123-125. 4.Мотуляк А.П, Особливості ультраструктурних механізмів міграції лімфоцитів через стінку посткапілярних венул брижових лімфатичних вузлів мишей після дії низьких доз радіації // Вісник морфології. – 2002. – Т.8,№1. – С.24-26. 5.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Морфологічні прояви реактивності ендотелію судин мікроциркуляторного русла брижових лімфатичних вузлів мишей лінії BALB/c при дії низьких доз радіації // Таврический медико-биологический вестник. – 2002. – Т.5,№3. – С.123-125. Здобувачу належить ідея, проведено експеримент, здійснено аналіз результатів. 6.Мотуляк А.П. Структура макрофагів тимуса мишей у нормі та при активації апоптозу під дією низьких доз радіації // Вісник морфології. – 2002. – Т.8,№2. – С.177-179. 7.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М, Шутка Б.В., Хананаєв Л.І. Морфологічні зміни у червоній пульпі селезінки мишей після дії низьких доз гамма-випромінювання // Галицький лікарський вісник. – 2003. – Т.10,№2. – С.144-147. Здобувачу належить ідея, набрано матеріал, проведено аналіз. 8.Мотуляк А.П. Апоптоз лімфоцитів у брижових лімфатичних вузлах мишей лінії BALB/c після дії низьких доз радіації // Вісник проблем біології і медицини. – 2003. – №6. – С.50-53. 9.Мотуляк А.П. Сучасні методи ідентифікації апоптозу // Буковинський медичний вісник. – 2003. – Т.7,№2. – С.210-213. 10.Мотуляк А.П. Ультраструктура посткапілярних венул тимуса ювенільних мишей лінії BALB/c в нормі і після дії низьких доз гамма-випромінювання // Вісник морфології. – 2003. – Т.9,№1. – С.77-79. 11.Нейко Є.М., Левицький В.А., Мотуляк А.П. Радіаційно-індукований апоптоз: сучасні аспекти проблеми // Галицький лікарський вісник. – 2004. – Т.11,№1. – С.12-19. Автору належить ідея, проведено огляд літератури по вказаній проблемі, сформульовані перспективи дослідження. 12.Мотуляк А.П. Морфогенез білої пульпи селезінки після дії низьких доз гамма-випромінювання // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. – 2004. – Т3,№3. – С.29-31. 13.Нейко Є.М., Левицький В.А., Мотуляк А.П. Актуальні аспекти структурної організації імунної системи в нормі та за умов дії низьких доз іонізуючого випромінювання // Галицький лікарський вісник. – 2004. – Т.11,№2. – С.10-14. Здобувачу належить ідея, проведено огляд літератури, сформульовані перспективи подальшого дослідження. 14.Мотуляк А.П. Структурна перебудова лімфоїдної тканини селезінки мишей лінії BALB/c у ранньому періоді постнатального онтогенезу після опромінення низькими дозами гамма-випромінювання // Буковинський медичний вісник. – 2005. – Т.9,№1. – С.85-89. 15.Нейко Є.М., Левицький В.А., Мотуляк А.П. Фазні зміни мікроциркуляторного русла та особливості міграції лімфоцитів у брижових лімфатичних вузлах і тимусі мишей лінії BALB/c у ранні терміни після дії низьких доз гамма-випромінювання // Галицький лікарський вісник. – 2005. – Т.12,№4. – С.76-79. Автору належить ідея, постановка експерименту, аналіз та узагальнення результатів. 16.Мотуляк А.П. Ультраструктурные изменения лимфоцитов при радиационно-индуцированном апоптозе в белой пульпе селезёнки ювенильных мышей линии BALB/c // Таврический медико-биологический вестник. – 2006. – Т.9,№3. – С.117-121. 17.Мотуляк А.П. Морфологічні феномени “квантування”, “кластеризації” та “компартменталізації” при радіаційно-індукованому апоптозі в органах імунної системи ювенільних мишей радіочутливої лінії BALB/с // Буковинський медичний вісник. – 2006. – Т.10,№3. – С.113-115. 18.Мотуляк А.П. Ультраструктурні та морфометричні зміни мітохондрій і ядер лімфоцитів при радіаційно-індукованому апоптозі в тимусі ювенільних мишей-самців лінії BALB/c // Вісник морфології. – 2006. – Т.12,№2. – С.213-117. 19.Стефанов О.В., Шеремета Л.В., Гудивок Я.С., Купновицька І.Г., Мотуляк А.П. Ліпосомальний кварцетин при експериментальному променевому ураженні у мишей – радіопротективна дія // Ліки. – 2006. – №1-2. – С.48-51. Автору належить постановка і відтворення експерименту. 20.Мотуляк А.П., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М Структурно-функціо-нальні характеристики апоптозної трансформації епітеліоретикулоцитів і тимоцитів при дії низьких доз радіації // Спеціальний випуск журналу “Екологічний вісник”, Київ, 2003. – С.142-146. Здобувачем набрано матеріал, проведено аналіз і узагальнено результати. 21.Мотуляк А.П. Морфологічні особливості радіаційно-індукованого апоптозу в тимусі, селезінці та брижових лімфатичних вузлах мишей лінії BALB/c // Збірник наукових статей: “Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики”, Запоріжжя, 2003. – випуск IX. – С.103-108. 22.Мотуляк А.П. Ретикулоцити селезінки та брижових лімфатичних вузлів мишей лінії BALB/c у ранньому постнатальному онтогенезі за умов дії малих доз г-випромінювання // Сборник статей “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”, Труды КГМУ, Симферополь, 2006. – Т.142,ч.1. – С.53-55. 23.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Особливості структурної організації макрофагів тимуса за умов дії низьких доз гамма-випромінювання // Імунологія та алергологія: Матеріали VI науково-практичної конференції Українського товариства спеціалістів з імунології, алергології та імунореабілітації (Тези доповідей). – Київ, 2002. – №2. – С.42. Здобувачу належить ідея дослідження, самостійно проведено експеримент, здійснено аналіз результатів. 24.Motulyak A.P., Tarnavska T.G., Sluchyk V.M. Influence of gamma-ray low doses radiation on the apoptosis of thymocytes of BALB/c mice line // Abstract of 32-th Annual Meetings of European Environmental Mutagen Society: “DNA Damage and Repair Fundamental Aspects and Contribution to Human Disorders”, Warsaw, Poland (Abstract). – 2002. – Р.133. Здобувач запропонував ідею дослідження, провів експеримент, узагальнив результати. 25.Мотуляк А.П. Ультраструктурные аспекты апоптоза тимоцитов в норме и при действии в эксперименте низких доз радиации // “Науки о человеке”: Сборник статей ІІІ Международного конгресса молодых учёных и специалистов, Томск, Россия (Тези доповідей). – 2002. – С.182-183. 26.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М., Шутка Б.В., Хананаєв Л.І. Особливості морфології кистоподібних структур тимуса ювенільних мишей радіочутливої лінії BALB/c після дії гамма-випромінювання // “Актуальні питання морфології”: Наукові праці ІІІ Національного конгресу анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України, Київ (Тези доповідей). – 2002. – С.219-220. Здобувачу належить ідея, проведено експеримент, аналіз і узагальнення результатів. 27.Мотуляк А.П. Морфологічні особливості білої пульпи селезінки ювенільних мишей лінії BALB/c після дії низьких доз гамма-випромінювання // “Актуальні питання морфології”: Наукові праці ІІІ Національного конгресу анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України, Київ (Тези доповідей). – 2002. – С.182-183. 28.Мотуляк А.П., Левицкий В.А., Тарнавская Т.Г. Структурные преобразования макрофагической системы тимуса при активации апоптоза под действием низких доз гамма-излучения // International Journal of Immunorehabilitation: Труды Всемирного конгресса по клинической и иммунной патологии, Сінгапур (Тези доповідей). – 2002. – Т.4,№2. – С.252. Автором запропоновано ідею дослідження, проведено експеримент та узагальнено результати. 29.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Хананаєв Л.І. Ультрамікроскопічні особливості макрофагів тимуса і білої пульпи селезінки мишей після дії низьких доз гамма – випромінювання // Спеціальний випуск журналу “Екологічний вісник”: Матеріали міжнародної конференції “Антропогенно-змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем”, Київ (Тези доповідей). – 2003. – С.105-106. Здобувачу належить ідея дослідження, проведено експеримент, проаналізовано отримані результати. 30.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М., Хананаєв Л.І. Лімфоїдні структури селезінки мишей радіочутливої лінії BALB/c за умов дії низьких доз іонізуючого випромінювання // Наукові праці ІІІ З’їзду з радіаційних досліджень, Київ: Фітосоціоцентр (Тези доповідей). – 2003. – С.175. Автору належить ідея, визначена мета, проведено аналіз отриманих даних. 31.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Случик В.М. Структурные изменения в селезёнке мышей радиочувствительной линии BALB/c после воздействия низких доз ионизирующей радиации // “Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения”: Материалы ІІ международной научно-практической конференции, Северск, Росія (Тези доповідей). – 2003. – С.133-135. Автор провів експеримент, проаналізував та узагальнив результати. 32.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавская Т.Г., Толоконникова Н.Н. Субмикроскопические особенности фагоцитоза в органах иммунной системы мишей линии BALB/c при действии низких доз гамма-излучения // International Journal on Immunorehabilitation: Труды ІV Всемирного конгресса по астме и IX Международного конгресса по клинической патологии, Бангкок, Таїланд (Тез доповідей). – 2004. – Т.6,№1. – C.34. Здобувачу належить ідея дослідження, проведено аналіз і сформульовані висновки. 33.Motulyak A., Sluchyk V., Sluchyk I., Tarnavska T., Tolokonnikova N. Post-radiation apoptosis of immunocompetent cells in peripheral immune system organs of BALB/c mice // Abstracts of First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Lviv, Ukraine (Abstract). – 2004. – P.361. Здобувачу належить ідея, набрано матеріал, проведено дослідження, сформульовано висновки. 34.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавская Т.Г., Толоконникова Н.Н. Субмикроскопические особенности индуцированного гамма-излучением апоптоза стромальных элементов иммунных органов // Материалы ХХ Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка-Москва, Росія (Тези доповідей). – 2004.– С.255. Здобувачу належить ідея дослідження, проведено експеримент, проаналізовано отримані результати 35.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Шутка Б.В., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Трансмуральна міграція лімфоцитів у посткапілярних венулах тимуса // Biomedical and Biosocial Anthropology: Матеріали V Міжнародного конгресу з інтегративної антропології, Вінниця (Тези доповідей). – 2004. – №2. – С.55-56. Автору належить ідея дослідження, проведено забір матеріалу, проаналізовано результати та сформульовано загальні висновки. 36.Мотуляк А.П., Хананаєв Л.І., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Підсумки результатів досліджень реакції стромальних клітин периферійних органів імунної системи в постнатальному онтогенезі після дії малих доз гамма-випромінювання // Парадигми сучасної радіобіології. “Радіаційний захист персоналу об’єктів атомної енергетики”: Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю, Київ-Чорнобиль (Тези доповідей). – 2004. – С.49. Автору належить ідея, набрано матеріал, зроблено аналіз і сформульовано загальні висновки. 37.Мотуляк А.П., Левицький В.А., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Сучасні аспекти біотестування в морфологічних дослідженнях // Матеріали ІІ Національного конгресу з біоетики з міжнародною участю, Київ (Тези доповідей). – 2004. – С.162-163. Здобувачу належить ідея, проведено експеримент, проведено узагальнення та зроблені висновки. 38.Мотуляк А.П., Хананаєв Л.І., Тарнавська Т.Г., Толоконнікова Н.М. Морфо-функціональні особливості організації стромальних елементів вилочкової залози після дії низьких доз іонізуючого випромінювання // “Гістологія на сучасному етапі розвитку науки”: Матеріали науково-практичної конференції, Тернопіль (Тези доповідей). – 2004. – С.47-48. Здобувачу належить ідея, проведено експеримент, зроблені узагальнення. 39.Мотуляк А.П., Левицкий В.А., Шутка Б.В., Ткач-Мотуляк О.В. Морфо-функциональные характеристики некоторых органов иммунной системы после воздействия низких доз гамма-излучения // “Физиология иммунной системы”: Научные труды I Съезда Физиологов СНГ, Сочи, Россия (Тези доповідей). – 2005. – Т.2. – С.123. Автору належить ідея, провів експеримент, проаналізував та узагальнив результати. 40.Мотуляк А.П., Ткач-Мотуляк О.В. Структурні механізми старіння клітин тимуса ювенільних мишей в нормі і при дії низьких доз радіації // “Проблемы старения и долголетия”: Наукові праці ІV З’їзду геронтологів і геріатрів України, Київ (Тези доповідей). – 2005. – Т.14. – С.38. Автор самостійно провів експеримент, проаналізував та узагальнив результати. 41.Мотуляк А.П., Толоконнікова Н.М., Тарнавська Т.Г., Ткач-Мотуляк О.В. Довготривалі клітинні ефекти в ендотелії кровоносних судин мікроциркуляторного русла брижових лімфатичних вузлів після впливу низьких доз г-випромінювання // Імунологія та алергологія (Тези доповідей). – 2006. – №2. – С.88-89. Здобувачу належить ідея дослідження, проведено аналіз результатів і сформульовані загальні висновки. 42.Мотуляк А.П., Толоконнікова Н.М., Левицький В.А., Ткач-Мотуляк О.В. Гетерогенність епітеліоретикулоцитів тимуса після впливу низьких доз гамма-випромінювання // Клінічна анатомія та оперативна хірургія: Матеріали Всеукраїнської наукової конференції “Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії”, Чернівці (Тези доповідей). – 2006. – Т5,№2. – С.45. Автору належить ідея, визначена мета, проведено аналіз отриманих даних. 43.Мотуляк А.П., Толоконникова Н.Н., Левицкий В.А., Ткач-Мотуляк О.В. Иммунобиологические феномены при радиационно-индуцированном апоптозе в тимусе, селезёнке и брыжеечных лимфатических узлах ювенильных мышей линии BALB/c // Аллергология и иммунология: Труды VI съезда аллергологов и иммунологов СНГ, Москва, Росія (Тези доповідей). – 2006. – Т.7,№3. – С.253. Здобувачу належить ідея, виконано експеримент, проведено аналіз результатів. 44.Мотуляк А.П., Случик В.М., Толоконнікова Н.М., Ткач-Мотуляк О.В. Стереоморфометричні зміни лімфоцитів при радіаційно-індукованому апоптозі в тимусі та селезінці мишей лінії BALB/с // “Механізми функціонування фізіологічних систем”: Матеріали міжнародної наукової конференції, Львів (Тези доповідей). – 2006. – С.103-104. Автору належить ідея, проведено дослідження, сформульовано висновки. АНОТАЦІЯ Мотуляк А.П. Структурна організація комплексу органів імунної системи в ранньому постнатальному періоді онтогенезу при дії малих доз іонізуючого випромінювання (експериментально-морфологічне досліджен-ня). – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України. – Київ, 2007. Дисертаційне дослідження присвячено розробці нової концепції впливу малих доз радіації на розвиток органів імунної системи в ранньому постнатальному періоді онтогенезу. Вивчено особливості структурної організації тимуса, селезінки і брижових лімфатичних вузлів ювенільних мишей-самців лінії BALB/c в нормі та після зовнішнього тотального одноразового гамма-опромінення в малих дозах. Зафіксовано чисельні структурні зміни, що є основою різних форм загибелі лімфоцитів і клітин їх безпосереднього мікрооточення. Узагальнення отриманих результатів дозволило окреслити у пострадіаційних морфологічних змінах такі феномени, як “квантування”, “кластеризація” та “компартменталізація”. Кількісно та якісно вивчено морфологічні прояви окремих фаз радіаційно-індукованого апоптозу лімфоцитів. Встановлено гістотопографію та ультраструктурні особливості найбільш чутливих до дії малих доз радіації лімфоцитів, визначено характер їх пострадіаційних пошкоджень, виявлено структурні механізми їх адаптації і репарації. Визначено фазні зміни у гемомікроциркуляторному руслі тимуса, брижових лімфатичних вузлів та селезінки після опромінення. Подано морфо-функціональне обґрунтування механізмів, а також прогностичного значення процесів загибелі клітин у становленні та особливостях структурних механізмів міжклітинних взаємодій у постнатальному періоді розвитку органів імунної системи як в нормі, так і при дії малих доз радіації. Представлено узагальнюючу концепцію впливу малих доз радіації на структуру органів імунної системи за умов їх постнатального розвитку, проведено оцінку характеру їх пошкоджуючої і стимулюючої дії. Ключові слова: тимус, селезінка, брижові лімфатичні вузли, лімфоцити, апоптоз, радіація. АННОТАЦИЯ Мотуляк А.П. Структурная организация комплекса органов иммунной системы в раннем постнатальном периоде онтогенеза при действии малых доз ионизирующего излучения (экспериментально-морфологическое исследование). – Рукопись. Диссертация на соискание учёной ступени доктора медицинских наук по специальности 14.03.09 – гистология, цитология, эмбриология. Национальный медицинский университет имени А.А.Богомольца МОЗ Украины. – Киев, 2007. Диссертационное исследование посвящено разработке новой концепции влияния малых доз радиации на развитие органов иммунной системы в раннем постнатальном периоде онтогенеза. Изучены структуры тимуса, селезёнки, брыжеечных лимфатических узлов ювенильных мышей-самцов радиочувствительной линии BALB/c в норме и после воздействия внешнего общего однократного гамма-облучения малыми дозами (0,05Гр и 0,2Гр). Впервые установлено, что морфологические изменения характеризуются своеобразием, которое определяется спецификой временных и пространственных характеристик гибели лимфоцитов иммунных органов, а также клеток их непосредственного микроокружения. Установлено, что в эксперименте клетки органов иммунной системы гибнут за счёт преобладания именно радиационно-индуцированного апоптоза, существенно отличающегося от “классического апоптоза”. Обобщение полученных результатов разрешило нам впервые определить в пострадиационной картине морфологических изменений новые, неизвестные к настоящему времени феномены “квантирования”, “кластеризации” и “компартментализации”. Определено, что в тимусе (за счёт мультипликации феноменов “квантирования” и “кластеризации”) феномен “компартментализации” приобретает максимальное морфологическое проявление в виде впервые описанных на ультраструктурном уровне так называемых “кистообразных структур”, заполненных клеточным детритом, а также деградированными апоптозными клетками. Нами предложено гипотезу о том, что эти структуры представляют собой эквиваленты общеизвестных телец Гассаля, их появление вызвано “избыточностью” апоптоза лимфоцитов и клеток их непосредственного микроокружения, а также функциональной неспособностью макрофагов тимуса реализовать полноценный фагоцитоз. Установлено, что радиационно-индуцированные изменения клеток иммунных органов сопровождаются сочетанием весьма характерных черт “классического” апоптоза (ассоциированного с умеренными изменениями митохондрий) с выраженным и распространенным локальным разрушением плазматической мембраны находящихся рядом апоптозных лимфоцитов. Продемонстрировано, что для морфологической картины радиационно-индуцированного апоптоза клеточных популяций исследованных нами органов характерно наличие фаз, а также его своеобразное замедление. В связи с этим целесообразно выделить: 1) фазу инициации; 2) эффекторную фазу; 3) фазу деградации (состоит из 3 самостоятельных стадий). Установлено, что морфологическим проявлением фазы инициации являются модуляции стереологических показателей митохондрий и повреждения их мембран, что свидетельствует об актуализации именно митохондриального сигнального пути радиационно-индуцированного апоптоза. Встановленоа якісно ванізми та м в виде каскадной системы продуктов экспрессии ьствует об актуализации митохондриального сигнаИзучено гистотопографию и ультраструктуру наиболее чувствительных к действию малых доз радиации лимфоцитов, определён характер их пострадиационных повреждений, идентифицированы структурные механизмы их адаптации и репарации. Установлено, что важной особенностью изученного нами радиационно-индуцированного апоптоза является миграция лимфоцитов через стенку посткапиллярных венул тимуса и брыжеечных лимфатических узлов. В связи с эти апоптоз приобретает волнообразный характер, а морфологические изменения получают новый стимул в виде каскадной системы продуктов экспрессии апоптоза. Впервые предложено морфо-функциональное обоснование механизмов и прогностического значения гибели клеток в становлении и особенностях структурных механизмов межклеточных взаимодействий в постнатальном онтогенезе органов иммунной системы при действии малых доз радиации. Представлено обобщающую концепцию влияния малых доз радиации на структуру органов иммунной системы в условиях их постнатального развития, осуществлена оценка их повреждающего и стимулирующего действия. Ключевые слова: тимус, селезёнка, брыжеечные лимфатические узлы, лимфоциты, апоптоз, радиация. ANNOTATION Motulyak A.P. The structure of the immune system complex in young postnatal period of ontogenesis at the conditions of low doses of ionizing radiation (experimental-morphological investigation). – Manuscript. Dissertation for a scientific degree of Doctor of Medical Sciences on the speciality 14.03.09 – histology, cytology, embryology. – National Bogomolets Medical University of Ukrainian Ministry of Public Health, Kyiv, 2007. The thesis| is devoted to the elaboration |of the new concept concerning low doses of radiation on the organogenesis of the immune system in early postnatal period of lymphatic ontogenesis. The thymus morphology|, spleen and mesenteric| lymphatic nodules of juvenile male mice of the BALB/c line in norm and after total external one-time г-radiation in low doses have been explored. Numerous changes in the structure, marked by their peculiarities, specificity of space and time characteristics of the death of lymphocytes and cells of their direct microenvironment have been stated. General conclusions of the mentioned characteristics allowed | to outline new phenomena such as “quanta process”, “clusterization” and “compartmentalization” in postradiation picture|painting| of morphological changes|changing|. Morphological displays of separate phases of radiation-induced apoptosis of lymphocytes| have been studied in qualitative and quantitative relations.|trained,learned| The research established histotopography| and ultrastructure of the lymphocytes most sensitive |sensitive|to|by| low doses of radiation, t|he |definicharacter|nature| of their postradiation damages, structural mechanisms of their adaptation and restoration have been discovered|. |Phase changes|changing| in hemomicrocirculational | riverbed of the thymus|, mesenteric| lymphatic nodules and spleen after radiation treatment have been defined. The research presents such results as the morpho-functional basis of mechanisms, their prognostics importance of necrocytosis processes in development and peculiarities of structural mechanisms of intercellular interactions of the organs of immune system in norm and disposed to low doses of radiation. The generalization concept of the low radiation doses influence on the structure of the organs of immune system in conditions of their postnatal period of| ontogenesis and the evaluation of the character of their damaging and stimulation action|presented|. Key words: thymus, spleen, mesenteric lymphatic nodules, lymphocytes, apoptosis, radiation.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *