Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляції вищих еукаріотів (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

Лукаш Тетяна Олександрівна

УДК 577.152.611

577.217.535

Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляції вищих
еукаріотів

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів
трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та
генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Негруцький Борис Сергійович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач лабораторії біосинтезу білка

відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор, член–кор. НАН України

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу білкової інженерії та біоінформатики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Галкін Анатолій Павлович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу генетичної інженерії.

Провідна установа: Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,
м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 20 жовтня 2006 року о 1000 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної

біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143,

вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Академіка
Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 18 вересня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нативні, функціонально активні білки утворюються
шляхом фолдингу новосинтезованих поліпептидних ланцюгів, внаслідок якого
інформація, що міститься у лінійних полімерах амінокислот, переходить у
просторову структуру (Anfinsen, 1973). Висока концентрація макромолекул
у клітині (макромолекулярний краудинг), що може перевищувати 500 мг/мл
(Ellis et al., 2001), зміна умов середовища (рН, температури, іонної
сили, окисно-відновних властивостей середовища), а також інгібування
системи деградації білків можуть призводити до утворення некоректно
згорнутих проміжних продуктів фолдингу, схильних до агрегації (Kopito,
2000; Garcia-Mata et al., 1999).

Проблема неправильного фолдингу білків у клітині частково вирішується
завдяки молекулярним шаперонам. Це велика група неспоріднених білкових
сімейств, які, завдяки своїй властивості зв’язувати ненативні
конформації білків, контролюють фолдинг і агрегацію білків всередині
клітини. Останнім часом шапероноподібні функції відкрито у цілого ряду
білків (Kern et al., 2003; Mehta et al., 2005; Cherepkova et al., 2006).
Дана робота присвячена вивченню шапероноподібних властивостей окремих
компонентів білоксинтезувального апарату вищих еукаріотів.

Фактор елонгації трансляції 1А (еEF1А) відіграє важливу роль у процесі
білкового синтезу, каталізуючи GTP- залежне зв’язування аміноацил-тРНК з

А- сайтом рибосоми, і є одним із найпоширеніших білків у клітині.
Результати досліджень останніх років свідчать про величезну кількість
так званих неканонічних функцій еEF1А. Деякі з цих функцій нагадують
властивості молекулярних шаперонів. Так, наприклад, еEF1A зв’язує
актинові філаменти і мікротрубочки in vitro i in vivo і, таким чином,
впливає на збирання та стабільність полімерів цитоскелету (Yang et al.,
1990; Shiina et al., 1994). EF1A, прокаріотний аналог еEF1A, виявляє
дисульфідізомеразну активність (Richarme et al., 1998), перешкоджає
агрегації білків за умов теплової денатурації, зв’язує денатуровані та
розгорнуті білки і відновлює їхню функціонально активну конформацію
(Kudlicki et al., 1997; Caldas et al., 1998), що свідчить про можливу
участь EF1A у білковому фолдингу. Що стосується еEF1A ссавців, то дані
про його участь у фолдингу білків відсутні.

Важливу роль у процесі фолдингу білків також можуть відігравати рибосоми
(Hardesty et al., 2001). Існує припущення, що згортання деяких
новосинтезованих поліпептидних ланцюгів може відбуватись в тунелі
рибосоми, де вони захищені від агрегації та деградації, що може бути
важливою передумовою для їх коректного фолдингу (Kudlicki et al., 1997;
Sanyal et al., 2002; Nakatogawa et al., 2002).

Як відомо, характерною особливістю апарату трансляції вищих еукаріотів є
високий рівень компартменталізації, що забезпечує ефективне
функціонування цього апарату в збільшеному, порівняно з прокаріотами,
об’ємі еукаріотної клітини (Ryazanov et al., 1987; Negrutskii et al.,
1994). Проявом компартменталізації апарату білкового синтезу є існування
мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК синтетаз (ARS) (Deutscher et
al., 1984; Mirande et al., 1991), мультисубодиничного комплексу фактора
елонгації eEF1H (Carvalho et al., 1984; Ejiri et al., 1994), комплексу
eEF1H з валіл–тРНК синтетазою (Motorin et al., 1991; Bec et al., 1994),
а також асоціація компонентів апарату трансляції з рибосомами та
цитоскелетом (Ryazanov et al., 1987; Mirande et al., 1985; Sanders et
al., 1996).

Оскільки шапероноподібні властивості рибосом і еEF1А можуть бути
необхідними для підтримки функціонально активних конформацій компонентів
білоксинтезувального апарату в трансляційних компартментах, вивчення
можливої участі еEF1A і рибосом у стабілізації та збереженні активної
форми ARS є актуальним для розуміння механізмів і функціонального
значення складної організації білкового синтезу у вищих еукаріотів.
Важливим є той факт, що еEF1А має в розчині частково неструктуровану
конформацію (Budkevich et al., 2002), що є типовим для шаперонів (Dunker
et al., 2002; Tompa et al., 2004).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у
лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної
інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за
бюджетними темами: “Роль неканонічних взаємодій компонентів
трансляційного апарату в організації білкового синтезу у вищих
еукаріотів“ (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0101U009211, 2002-2005рр.);
“Макромолекулярні комплекси і ченелінг тРНК в трансляційних
компартментах ссавців“ (НДР Міністерства освіти і науки України, № держ.
реєстрації 0103U008714, 2001-2003рр.)

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення ролі 80S
рибосом та eEF1A у стабілізації активної форми ARS з високим рівнем
каталітичної активності.

Для досягнення даної мети необхідно було вирішити такі завдання:

Виділити в препаративних кількостях 80S рибосоми, 40S і 60S субчастинки
рибосом, еЕF1А, мультиферментний комплекс ARS, індивідуальну
фенілаланіл–тРНК синтетазу (PheRS) та сумарну тРНК із печінки кроля.

Вивчити вплив 80S рибосом на активність “вільних” ARS та таких, що
входять до складу мультиферментного комплексу ARS.

Дослідити вплив eEF1A на термоінактивацію серил-тРНК синтетази (SerRS)
та PheRS.

Методами кругового дихроїзму (КД), електрофорезу в нативних умовах і
динамічного світлорозсіяння (ДСР) дослідити можливі структурні зміни
молекул PheRS під час теплової денатурації.

Дослідити вплив eEF1A на можливі структурні зміни молекул
термоденатурованої PheRS.

Об’єкт дослідження: вплив eEF1A і рибосом на фолдинг та стабілізацію ARS
вищих еукаріотів.

Предмет дослідження: ізолейцил–тРНК синтетаза (IleRS), лейцил–тРНК
синтетаза (LeuRS), PheRS, SerRS, eEF1A, рибосоми.

Методи дослідження: біохімічні методи дослідження ферментативних
реакцій, метод гель–фільтрації, іонообмінна та афінна хроматографії,
методи електрофорезу в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах та в
агарозному гелі в нативних умовах, метод кругового дихроїзму, метод
динамічного світлорозсіяння.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі представлено
експериментальні докази шапероноподібних властивостей 80S рибосом та
еEF1А.

Вивчено вплив 80S рибосом та їхніх субчастинок на активність ARS вільних
(PheRS) і таких, що входять до складу мультисинтетазного комплексу
(LeuRS і IleRS). На прикладі PheRS вперше показано, що 80S рибосоми
здатні відновлювати активність термоінактивованого ферменту і
стабілізувати ферментативну активність синтетази за умов
термоінактивації.

Вперше виявлено стабілізуючий та ренатуруючий ефекти eEF1A при
термоінактивації PheRS і SerRS.

Методами кругового дихроїзму, електрофорезу в нативних умовах та
динамічного світлорозсіяння вперше встановлено, що інкубація PheRS при
42 °С спричиняє руйнування 20 % (- спіральних структур, зміни загального
поверхневого заряду та агрегації. Додавання eEF1A призводить до
руйнування агрегатів PheRS і формування біологічно активної форми PheRS,
можливо, у вигляді комплексу однієї молекули ферменту та фактора.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені результати можуть
бути використані для подальшого детального вивчення неканонічних
взаємодій між компонентами апарату трансляції, що беруть участь у
процесі каналювання субстратів у білковому синтезі, а також регуляції
активності апарату білкового синтезу в клітинах вищих еукаріотів.
Отримані результати використовуються в спецкурсі „Біосинтез білка”
біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса
Шевченка.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи
автором самостійно проаналізовано наукову літературу за темою
досліджень, разом із керівником розроблено програму проведення
експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань.
Здобувачем особисто виділено всі необхідні препарати для проведення
експериментів із вивчення шапероноподібних властивостей рибосом і eEF1А,
зокрема препарати 80S рибосом та окремих 60S і 40S субчастинок рибосом,
eEF1A, мультиферментного комплексу ARS та PheRS. Результати досліджень
обговорено і проаналізовано з науковим керівником

д.б.н., зав. лаб. біосинтезу білка Б.С. Негруцьким. Частину
експериментальної роботи із вивчення впливу 80S рибосом та eEF1A на
каталітичні параметри реакції аміноацилювання тРНК виконано в
співробітництві з к.б.н. Г.В. Турківською, з якою автор має спільні
публікації. Дисертантка вдячна за препарат SerRS, який було люб’язно
надано к.б.н. З.М. Петрушенко, а також співробітнику Інституту біохімії
імені О.В. Палладіна НАН України к.ф.-м.н. В.Ф. Горчеву за технічну
допомогу в проведенні експериментів із визначення розмірів PheRS методом
динамічного світлорозсіяння.

Автор висловлює глибоку подяку д.б.н., професорові, академіку НАН
України Г.В. Єльській за постійну підтримку і велику увагу до
дисертаційної роботи.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертації було представлено на
VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, Україна, 2002);
Міжгалузевій конференції молодих науковців “Актуальні проблеми біохімії
та біотехнології – 2003” (Київ, Україна, 2003); Міжнародній конференції
молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та
генетики (Київ, Україна, 2003); Установчому з’їді Українського
товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004); Міжнародній
конференції „Aminoacyl-tRNA Synthetases: Ancient Molecules for Future
Biology and Medicine” (Сеул, Корея, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових
наукових журналах та тези 5 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини,
яка має 2 підрозділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, а
також висновків та переліку використаних джерел, який нараховує 168
найменувань. Роботу викладено на 125 сторінках машинописного тексту.
Ілюстративний та числовий матеріал дисертації подано у вигляді 29
рисунків і 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі було використано такі реактиви:
набір 20 амінокислот, N,N-метиленбісакриламід, акриламід, бичачий
сироватковий альбумін (БСА), імідазол виробництва фірми “Sigma” (США);
додецилсульфат натрію, HЕPES виробництва фірми “Calbiochem” (США);
дитіотреітол (DTT) виробництва фірми “Boehringer Mannheim” (Німеччина);
2-меркаптоетанол, трис, MgCl2, гліцерин, полі(етиленгліколь) 6000, NH4Cl
виробництва фірми “Merck” (Німеччина); TEMED, PMSF, виробництва фірми
“Serva” (Німеччина); фосфоцелюлоза P11, ДЕАЕ- целюлоза DE-52, фільтри
GF/C виробництва фірми “Whatman” (Велика Британія); амонію персульфат,
бромфеноловий синій, Кумасі R-250 і G-250, гідроксиапатит Bio Gel НТР
виробництва фірми “Bio-Rad” (США); гепарин-сефароза, SP-сефароза,
сефакрил S-400, сефадекс G-200 виробництва фірми “Pharmacia” (Швеція);
нітроцелюлозні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм виробництва фірми
“Sartorius-GmbH” (Німеччина); [3H]GTP (9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл), [3H]GDP
(11,9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл), [14С]фенілаланін (50 Кі/моль, 100 мкКі/мл)
виробництва фірми “Amersham” (Велика Британія); [14С]серин, [14С]лейцин,
[14С]ізолейцин (50 Кі/моль, 100 мкКі/мл) виробництва фірми “UVVVR”
(Чехія).

Одержання 40S і 60S субчастинок рибосом та реасоційованих 80S рибосом
здійснювали як описано в роботах (Овчаренко и др., 1983; Bommer et al.,
1996). Активність 80S рибосом визначали у реакції зв’язування
[14С]АсPhe–тРНКPhe. Рибосомні білки та рРНК одержували за схемою,
описаною в роботах (Sherton et al., 1974; Chomczynsky et al., 1989).

eEF1A виділяли з печінки кролів (Shalak et al., 1997). Активність eEF1A
визначали в реакції GDP/[3H]GDP обміну. Для переведення eEF1A із GDP- в
GTP- зв’язану форму необхідну кількість білка інкубували 5 хв при 37
°С в 20 мМ трис-HCl буферному розчині (pH 7,5), що містив 100 мМ NH4Cl,
10 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ GDP або GTP, 25 % гліцерин.

PheRS виділяли з печінки кролів відповідно до методики (Pailliez et al.,
1984) з деякими модифікаціями.

Для виділення комплексів ARS застосовували принцип методу (Deutscher et
al., 1974), заснований на м’якій гомогенізації тканин із подальшою
хроматографією пострибосомної надосадової фракції на сефадексі G-200.

Активність ARS визначали на початковій швидкості реакції аміноацилювання
тРНК, коли концентрації ферментів, які використовувались, знаходились на
ділянці прямолінійної залежності виходу аміноацил-тРНК від концентрації
білка (Овчаренко и др., 1979; Pailliez et al., 1984). Специфічну
активність ARS визначали за графіком залежності початкової швидкості
реакції аміноацилювання від концентрації ферменту. За одиницю активності
брали кількість ферменту, що продукує 1 нмоль Phe-тРНК за хвилину при 25
°С.

Для денатурації ARS очищені препарати ферментів розводили 10 мМ

трис-НСl буферним розчином (рН 7,5), що містив 10 мМ 2-меркаптоетанол, і
прогрівали протягом 10 хв при 42 °С. В контрольних експериментах для
збереження активності синтетаз їх розводили буферним розчином, що також
містив 4 мг/мл БСА.

Спектри КД PheRS вивчали за допомогою термостатованого
спектрополяриметра Jasco-700 (Японія). Для одержання спектрів в далекому

УФ-діапазоні від 250 до 190 нм використовували кювету з довжиною
оптичного шляху 10 мм. Спектри PheRS вимірювали в 25 мМ К- фосфатному
буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ КCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ
PMSF, в інтервалі температур 4 – 42 °С. Концентрація білка становила 0,1
мг/мл. Вміст вторинних структур у молекулі білка вираховували за
допомогою програм “Selcon”, “K2D” і “Contin” ( HYPERLINK
«http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html»
http://www.cryst.bbk.ac.uk/сdweb/html/home.html ).

Денатурацію PheRS аналізували в 0,6 % агарозному гелі, який готували на
12 мМ СН3СООН-КОН (рН 7,0). PheRS розводили в 25 мМ К- фосфатному
буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ KСl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF
до концентрації 0,1 мг/мл і інкубували при 42 °С 10 хв. В якості
контролю використовували нативний фермент. Перед нанесенням зразків до
них додавали 1/3 розчину 80 % гліцерину з бромфеноловим синім. Час
проведення електрофорезу дві години при силі струму 40 мА в 350 мМ
(-alanine-KOH (pH 7,5). Гель забарвлювали Кумасі R-250.

Функцію розподілу молекул PheRS за розмірами вивчали методом ДСР за
допомогою термостатованого лазерного кореляційного спектрофотометра
“ZetaSizer-3” Malvern Instrument, який був обладнаний корелятором multi
computing correlator type 7032 ce та гелій-неоновим лазером ЛГ-111,
потужністю 25 мВт та довжиною хвилі 633 нм. Вимірювання проводили в 25
мМ К- фосфатному буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ КCl, 1 мМ
DTT, 0,1 мМ PMSF в інтервалі температур 18 – 42 °С. Перед вимірюванням
зразки центрифугували 2 год 16000 x g при 4 °С для видалення агрегованих
форм білків. Експерименти проводили в скляних кюветах діаметром 10 мм.
Реєстрацію та статистичну обробку здійснювали протягом 60 – 180 с за
допомогою стандартної комп’ютерної програми PCS – Size mode v 1,61 (
HYPERLINK «http://www.malvern.co.uk» http://www.malvern.co.uk ).

Результати досліджень та їхнє обговорення.

Вплив 80S рибосом на активність ARS. Дослідження
структурно–функціональної взаємодії ARS з рибосомами було розпочато в
попередніх роботах нашого відділу (Сана и др., 1992; Белянская и др.,
1998), в яких було показано, що 80S рибосоми підвищують активність та
термостабільність гомологічної LeuRS. Перший розділ роботи є
продовженням досліджень із вивчення впливу рибосом на активність ARS.

Оскільки дев’ять ARS в клітинах ссавців існують у вигляді
високомолекулярного комплексу, важливо було дослідити вплив рибосом як
на активність ферментів, що входять до складу комплексу, зокрема IleRS і
LeuRS, так і індивідуальних, на прикладі PheRS. Рибосоми або субчастинки
рибосом вносили безпосередньо до інкубаційної суміші для аміноацилювання
тРНК. Як видно з рис. 1, активність IleRS в реакції аміноацилювання тРНК
підвищується із зростанням концентрації рибосом. Максимальний рівень
стимуляції IleRS спостерігали, починаючи з 0,7 мкМ концентрації рибосом.
Аналогічний стимулюючий ефект виявлено і для LeuRS.

Рис. 1. Вплив 80S рибосом ((), 60S (() і 40S (() субчастинок рибосом,
БСА (() та суміші рибосомних білків і рРНК (() на початкову швидкість
реакції синтезу [14C]Ile–тРНК;

( – ендогенна IleRS активність 60S субчастинок рибосом;

( – ендогенна IleRS активність 40S субчастинок рибосом

БСА, як контрольний білок, що виявляє слабку шаперонну активність (Zhi
et al., 1992), та суміш рРНК і рибосомних білків у відповідних молярних
концентраціях не мали стимулюючого впливу на активність IleRS і LeuRS,
що свідчить про специфічність впливу рибосом і необхідність нативної
структури для стимуляції ферментативної активності досліджуваних ARS.
Слід зазначити, що ендогенна ARS активність рибосомних субчастинок і
цілих рибосом не перевищувала 0,3 % активності синтетази, що вносили в
інкубаційну суміш для аміноацилювання.

Було також вивчено вплив рибосом та їхніх окремих субчастинок на
кінетичні параметри реакції синтезу [14C]аміноацил-тРНК. Наведені в
таблиці 1 дані свідчать, що додавання в реакційну суміш як 80S рибосом,
так і окремих субчастинок рибосом (0,7 мкМ) призводить до зростання
значення каталітичної константи (kcat), що може свідчити про підвищення
каталітичної активності ARS. В той же час значення константи
Міхаеліса–Ментен (KМ) практично не змінюється. При додаванні 80S рибосом
спостерігали зростання співвідношення kcat/KM майже в 2 рази, що
свідчить про підвищення ефективності реакції аміноацилювання в
присутності рибосом. Таким чином, з наведених даних видно, що як цілі
рибосоми, так і їхні окремі субчастинки мають вплив на активність LeuRS
і IleRS, хоча ефективність дії 80S рибосом значно вища. Найменш
виражений ефект спостерігали в присутності 40S субчастинок рибосом.

Таблиця 1

Вплив 80S рибосом та їхніх окремих субчастинок

на кінетичні параметри реакції синтезу [14C]аміноацил-тРНК

Суміш для аміноацилювання KМ, мкМ Vmax,

пмоль/хв kcat, хв-1 kcat/KM

IleRS

Без рибосом 0,21± 0,01 5,75 ± 0,05 4,10 ± 0,03 19,55 ± 0,08

+ 0,75 мкМ 80S рибосоми 0,19 ± 0,02 10,00 ± 0,08 7,14 ± 0,03 37,59 ±
0,10

+ 0,75 мкМ 60S субчастинки рибосом 0,31 ± 0,03 8,00 ± 0,08 5,71 ± 0,04
18,43 ± 0,12

+ 0,75 мкМ 40S субчастинки рибосом 0,30 ± 0,02 5,00 ± 0,04 3,57 ± 0,02
11,90 ± 0,08

+ 0,75 мкМ суміш рРНК і рибосомних білків 0,22 ( 0,10 3,30 ( 0,04 2,35 (
0,02 10,71 ( 0,10

+ 0,75 мкМ БСА 0,25 ( 0,07 3,40 ( 0,08 2,42 ( 0,03 9,71 ( 0,09

LeuRS

Без рибосом 0,20± 0,07 3,40 ± 0,03 2,61 ± 0,06 13,07 ± 0,14

+ 0,75 мкМ 80S рибосоми 0,20 ± 0,06 7,80 ± 0,02 6,00 ± 0,04 30,00 ± 0,09

+ 0,75 мкМ 60S субчастинки рибосом 0,23 ± 0,05 7,20 ± 0,01 5,53 ± 0,04
24,08 ± 0,10

+ 0,75 мкМ 40S субчастинки рибосом 0,25 ± 0,06 5,90 ± 0,09 4,53 ± 0,08
18,15 ± 0,07

+ 0,75 мкМ суміш рРНК і рибосомних білків 0,20 ( 0,09 3,00 ( 0,08 2,31 (
0,03 11,53 ( 0,10

0,75 мкМ БСА 0,23 ( 0,06 3,20 ( 0,10 2,46 ( 0,09 10,70 ( 0,06

Підвищення активності ARS у реакції аміноацилювання тРНК також може бути
обумовлено інактивацією деяких інгібіторів реакції рибосомами. Одним із
таких інгібіторів є неорганічний пірофосфат (РРі), який крім того, що є
продуктом реакції аміноацилювання, може відігрівати важливу роль у
функціонуванні ARS. Залежно від концентрації, РРі може впливати на
порядок приєднання субстратів і, як наслідок, параметри реакції
аміноацилювання тРНК, а також здатний інгібувати деякі ARS. Однак, у
наших експериментах пригнічення реакції аміноацилювання під впливом РРі
спостерігали однаковою мірою як у присутності, так і у відсутності
рибосом, що свідчить про те, що рибосоми не здатні запобігати дії
інгібітора.

В роботах нашого відділу було показано, що очищені 80S рибосоми вищих
еукаріотів мають АТРазну активність (Rodnina et al., 1994), що може
впливати на конформаційний стан самої рибосоми (El’skaya et al., 1997),
і, можливо, на її здатність стимулювати активність ARS. Щоб перевірити,
чи не пов’язаний стимулюючий ефект рибосом із функціонуванням рибосомної
АТРази, ми використали алкалоїд еметин, відомий як інгібітор рибосомної
АТРази (Rodnina et al., 1994). На рис. 2 показано, що за таких
концентрацій еметину (0,01 – 0,1 мМ), які вдвічі зменшують АТРазну
активність рибосом, але не впливають на аміноацилюючу активність ARS,
рівень стимуляції активності LeuRS 80S рибосомами не змінювався.

Рис. 2. Вплив різних концентрацій еметину на здатність 80S рибосом
стимулювати активність LeuRS:

– активність LeuRS без додавання рибосом;

– активність LeuRS у присутності 0,75 мкМ концентрації рибосом

Таким чином, стимулюючий вплив 80S рибосом на активність LeuRS скоріш за
все не був пов’язаний з АТPазною активністю рибосом.

На основі наведених результатів і даних літератури ми дійшли висновку,
що найвірогіднішою причиною стимулюючого впливу рибосом може бути
безпосередня взаємодія ARS із рибосомами, яка необхідна для підтримки
їхньої функціонально активної конформації. Важливо, що максимальний
рівень стимуляції активності звичайно спостерігали при роботі з LeuRS та
IleRS із низькою активністю, що була втрачена в процесі очистки або при
тривалому зберіганні. При використанні високоактивного комплексу ARS
стимуляція активності синтетаз в його складі була незначною. Це є ще
одним свідченням на користь нашого припущення, що підвищення активності
ферменту в присутності рибосом може бути результатом відновлення його
активної конформації.

З літератури відомо, що прокаріотні 70S рибосоми подібно до молекулярних
шаперонів здатні здійснювати рефолдинг частково денатурованих білків
(Chattopadhyay et al., 1994; Das et al., 1996; Kudlicki et al., 1997).
На підставі цих результатів можна припустити, що і 80S рибосоми вищих
еукаріотів можуть виконувати подібну до молекулярних шаперонів функцію.
Пропозицію щодо шапероноподібної властивості 80S рибосом було перевірено
при вивченні можливого впливу рибосом на каталітичну активність
термоінактивованої PheRS. При розведенні ферменту буфером, що не містив
БСА, та наступному прогріванні протягом 10 хв при 42 °С спостерігали
зниження активності PheRS на 50 – 70 %. Активність такого, частково
інактивованого ферменту, відновлювалась після додавання 80S рибосом
(рис.3).

Рис. 3. Залежність “реактивації” PheRS від концентрації рибосом і БСА.

Реактивацію термоінактивованої PheRS проводили 10 хв при 25 єС в
присутності зазначених концентрацій 80S рибосом або БСА

Для максимального відновлення активності PheRS необхідною є 0,75 мкМ
концентрація 80S рибосом. Контрольний білок БСА в концентрації, що
дорівнювала концентрації рибосом, не впливав на активність
інактивованого ферменту. Важливо, що при додаванні 80S рибосом
безпосередньо в буфер для розведення ферменту і наступному прогріванні
при 42 °С 10 хв, активність ферменту повністю зберігалась, в той час як
БСА за тих же концентрацій не виявляв подібного впливу.

R T b d h ? ue 6

b d f h ? ue 6

¦

o

Oe0”y2

?

Oe0”y2

?

Oe0”y2

?

Oe0”y2

?

&

$

ctcecic F0FY„Y?Y?YIYaeYUJJJJJ

J

aeYeY<¦T¦l¦„¦?¦UJJJJJ J §-§UJJJJJ J Q-§ §,§UJ J ,§.§F§\§t§?§¦§!––––– ? ?:?UJJJJJ J :?

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *