.

Розробка та вивчення властивостей вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби (автореф

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
91 2389
Скачать документ

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

КУЧЕРЯВЕНКО ВІКТОРІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 619:615.371:578.825.15:616.98:578.833.3

Розробка та вивчення властивостей вакцини емульсійної інактивованої
проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої
худоби

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної
медицини УААН.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор

Білокінь Віктор Степанович

Інститут експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини УААН, головний науковий співробітник лабораторії
біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Романенко Володимир Пилипович

Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії імунології і
генетики;

доктор ветеринарних наук, професор

Скибицький Володимир Гурійович

Національний аграрний університет, завідувач

кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології.

Провідна установа: Харківська державна зооветеринарна академія,

кафедра епізоотології і ветеринарного менеджменту.

Захист відбудеться “ 12 ” квітня 2005 р. о 900 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:
61023, м. Харків,

вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:
61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 9 ” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Успішний розвиток скотарства можливий лише при
стійкому благополуччі господарств з інфекційних хвороб, забезпечення
якого може бути здійснено шляхом обов’язкового дотримання загальних
ветеринарно-санітарних правил і створення імунного поголів’я за
допомогою засобів специфічної профілактики. Серед інфекційних хвороб
великої рогатої худоби значного поширення набули інфекційний ринотрахеїт
(ІРТ) і вірусна діарея (ВД), які спричиняють досить значні економічні
збитки галузі тваринництва

(Андрєєв Є.В. і співавт., 1975; Чечеткина Н.П. и соавт., 1984; Атамась
В.А. и соавт., 1986; Красочко П.А., 1997; Сюрин В.Н. и соавт., 1998).

Сучасна епізоотична ситуація з ІРТ та ВД характеризується змішаним
перебігом цих хвороб (Ковалев Н.А. и соавт., 1998; Глотов А.Г. и соавт.,
2002). Їх поширенню сприяє здатність вірусів ІРТ та діареї до
персистенції, внаслідок чого перехворілі тварини залишаються довічними
вірусоносіями й джерелом збудника інфекції (Юров К.П. и соавт., 1998;
Castrucci G. at al., 2002).

В деяких країнах Європи (Австрія, Данія, Норвегія, Фінляндія, Швейцарія
та Швеція) розроблені й впроваджені програми з контролю та боротьби з
ІРТ і ВД великої рогатої худоби, які передбачають повну ліквідацію
хворих та серопозитивних до цих збудників тварин. В інших країнах світу
(США, Німеччина, Великобританія, Франція) розроблені програми з контролю
та профілактики ІРТ та ВД за допомогою вакцин, виготовлених як з
інактивованих, так і атенуйованих вірусів (Akermann M., 1998; Grooms
D.L. at al., 2002;

Lindberg A., 2003).

В Україні для профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої
худоби застосовують живу вакцину „ІРТ-LG” (Фукс П.П., Волосянко Е.В.,
1995). На цей час завершується розробка живої вакцини проти ВД (Чебанюк
І.В. та співавт., 2004). Проте, внаслідок можливої персистенції
вакцинних вірусів в організмі імунізованих тварин, а нерідко і
залишкової вірулентності їх використання дещо обмежене, а в племінних
господарствах взагалі заборонене.

Що стосується інактивованих засобів профілактики хвороб вірусної природи
великої рогатої худоби, в Україні застосовують вакцину „Рипавак” проти
інфекційного ринотрахеїту й парагрипу – 3 великої рогатої худоби
(Кучерявенко Л.І. та співав., 2004). Інактивована вакцина проти вірусної
діареї великої рогатої худоби знаходиться в стадії розробки (Годовский
А.В., 2004). Зазначені вакцини індукують високий рівень накопичення у
щеплених тварин специфічних вірусонейтралізуючих антитіл, однак схема їх
почергового засто-сування для профілактики ІРТ та ВД збільшує витрати на
профілактичні заходи.

Враховуючи дані відносно домінуючого останнім часом змішаного перебігу
ІРТ та ВД, актуальною є проблема як з теоретичної, так і практичної
точок зору розробка інактивованої бівакцини проти ІРТ і ВД, яку можна
без обмежень застосовувати в господарствах для профілактики цих інфекцій
великої рогатої худоби.

В той же час створення засобів специфічної профілактики ІРТ та ВД
неможливе без відпрацювання технологічних процесів отримання
вірусовмісної сировини для виготовлення біопрепарату, що залежить від
властивостей штамів вірусу, клітинної тест-системи, умов їх
культивування та інших факторів (Закутский Н.И., 1997).

Вирішенню цих актуальних завдань і присвячена наша робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР ІЕКВМ УААН за завданнями: 05.
(2001-2005 рр.) „Розробити та впровадити комплексну систему діагностики,
терапії та профілактики інфекційних та незаразних хвороб жуйних тварин”
(номер державної реєстрації 0101U001610), 05.01. „Розробити засоби і
методи діагностики та специфічної профілактики вірусної діареї великої
рогатої худоби” та 04. (2001-2005 рр.) „Розробити на основі прогресивних
технологій ефективну систему діагностики, терапії та профілактики
хвороб, спільних для різних видів тварин” (номер державної реєстрації
0101U001616).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи – розробити технологію та
вивчити властивості вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного
ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби.

Основні завдання досліджень:

– розробити ефективну технологію накопичення вірусовміщуючої біомаси з
використанням продуктивних ліній перещеплюваних клітин і штамів вірусів
ІРТ та діареї;

– підібрати оптимальні способи очистки, концентрування та інактивації
вірусів ІРТ та діареї;

– оцінити імуностимулюючу активність та реактогенність різних ад’ювантів
у складі інактивованої вакцини проти ІРТ та ВД;

– вивчити властивості вакцини за показниками якості: стерильність,
нешкідливість, реактогенність та імуногенна активність і визначити
оптимальну дозу щеплення великої рогатої худоби;

– розробити нормативну документацію (технічні умови, інструкцію з
виго-товлення й контролю та настанову з застосування) на вакцину
емульсійну інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної
діареї великої рогатої худоби.

Об’єкт дослідження: вірус інфекційного ринотрахеїту, вірус діареї,
перещеплювані культури клітин, лабораторні тварини та велика рогата
худоба.

Предмет дослідження: вакцина емульсійна інактивована проти інфекційного
ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби. Технологія
отримання і ефективність її застосування.

Методи дослідження: цитологічні, вірусологічні, серологічні, біохімічні,
гематологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні:

– створено бівакцину емульсійну інактивовану проти інфекційного
ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби;

– розроблено ролерний спосіб культивування клітин і вірусів ІРТ та
діареї, який дозволяє отримувати з високою інфекційною активністью
вихідну вірусовміщуючу сировину для виготовлення вакцини без
концентрування з застосуванням хімічних речовин;

– вивчено реактогенні та імуностимулюючі властивості бівакцини
виготовленої на основі масляних і кремнійвміщуючих ад’ювантів, на
лабораторних і сільськогосподарських тваринах.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень
використані при розробці нормативної документації на вакцину емульсійну
інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої
рогатої худоби (технічні умови, інструкція з виготовлення і контролю та
настанова з застосування), яка розглянута й схвалена методичною комісією
ІЕКВМ (протокол № 16 від 8 грудня 2004 року) та представлена в ДНКІБШМ
для експертизи.

Запропонована технологія виготовлення вакцини на основі стабільних за
властивостями виробничих штамів „Молдавський” та „ВК-1” вірусів ІРТ та
діареї і ліній перещеплюваних клітин НВ і КСТ.

Зазначені розробки підтверджено патентами Україні №4626, №4432 від
1.01.2005 р. та висновком про видачу деклараційного патенту на штам
перещеплюваних клітин нирки вівці РО-2/04, № 20040605098 від 20.01.2005
р.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз
отриманих даних та їх узагальнення виконано дисертантом особисто.
Біохімічні дослідження проводили спільно з співробітниками лабораторії
біохімії

ІЕКВМ УААН Романько М.Є., Михайловою С.А., а гематологічні дослідження з
науковим співробітником лабораторії повільних інфекцій ІЕКВМ УААН
М’ягких Н.В.

Апробація результатів дисертації. Основні розділи дисертації
доповідались і обговорювались на:

– засіданнях вченої ради й методичної комісії ІЕКВМ УААН в 2001 –

2004 рр.;

– всеукраїнській науковій конференції молодих вчених „Сучасні проблеми
діагностики інфекційних хвороб тварин” (2 – 3 грудня 2003 р., м.
Харків);

– міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми
ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (26
травня – 2 червня 2003р., АР Крим, м. Феодосія);

– міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицини –
2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних
препаратів” (24 – 31 травня 2004 р., АР Крим, м. Феодосія).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковані чотири наукові праці
у фахових виданнях. Результати виконаної роботи захищені трьома
патентами.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 132 сторінках
комп’ютерного друку й складається з наступних розділів: вступ, огляд
літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних
досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки,
практичні пропозиції, список використаної літератури, додатки. Робота
ілюстрована 17 таблицями, 13 рисунками. Список використаної літератури
включає 184 найменування, у тому числі 70 іноземних.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційна робота виконана протягом 2001 – 2004 років в лабораторіях
біотехнології і вірусології Інституту експериментальної і клінічної
ветеринарної медицини УААН та в дослідному господарстві „Елітне”
Інституту рослинництва ім. Юр’єва УААН. Дослідження проводили на 100
білих мишах масою 18-20 г, 83 морських свинках масою 350-400 г, 855
головах ВРХ.

В лабораторних дослідах використовували: перещеплювані культури клітин
нирки вівці (НВ), трахеї теляти (ТрТ), коронарних судин теляти (КСТ) та
нирки новонародженого хом’ячка (ВНК-21/2-17); штам вірусу інфекційного
ринотрахеїту „Молдавський”; штам вірусу діареї „ВК-1”, а також сироватки
крові від лабораторних тварин і ВРХ.

Специфічні антитіла до вірусів ІРТ та діареї в сироватці крові
досліджуваних тварин визначали в реакції нейтралізації (РН) за
загальноприйнятим методом (Сюрин В.Н. та співавт, 1984) та мікрометодом
за стандартом МЕБ (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,
2000).

Вихідну біомасу для виготовлення вакцини отримували культивуванням
вірусів ІРТ та діареї у вирощених в бутлях моношарових перещеплюваних
культурах клітин. Очистку вірусовміщуючої культуральної рідини від
клітинного детриту здійснювали за методом природної седиментації
(відстоювання) при 40 С впродовж 24 годин і центрифугування при 3000
об/хв на центрифузі MPW 340 (ротор до 4000) впродовж 25 – 30 хвилин.
Кількість загального білка визначали за методом Лоурі (Фримель Г.,
1987). Вірусовміщуючу рідину концентрували в діалізних мішках за
допомогою 50% стерильного розчину ПЕГ-6000. Інактивацію вірусів
здійснювали розчином формальдегіду або етиленіміну (в концентрації 0,1%)
при температурі 370 С.

Імуногенну активність досліджуваного зразка вакцини оцінювали за
приростом титрів специфічних антитіл до вірусів ІРТ та діареї в
сироватці крові щепленої великої рогатої худоби за допомогою реакції
нейтралізації. З цією метою відбирали сироватки крові до вакцинації,
через 7, 25, 45, 60 та 120 діб після щеплення.

Оцінку стану клітинного імунітету за показниками фагоцитарної
активності, фагоцитарного числа, кількості лейкоцитів та лейкоцитарної
формули проводили за методом Чеботкевича В.Н., Лютинского С.И. (1998).

Визначення кількості імуноглобулінів класів M та G у сироватках крові
ВРХ проводили за методом радіальної імунодифузії за Manchini G. (1970).
Вміст загального білка в сироватці крові визначали за допомогою
рефрактометра IRT – 22.

Визначення серомукоїдів у пробах сироваток крові проводили за методом
Веймера та Мошина (Асатиани В.С., 1957), а циркулюючих імунних
комплексів за методом Гриневича Ю.А. шляхом преципітації 3,5 % розчином
поліетиленгликолю ПЕГ-тест ОЩ 280 (Меньшиков В.В. и др., 1987).

Обчислення та статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за
допомогою персонального комп’ютера в електронних таблицях Microsoft
Excel XP professional, які входять до програмного пакету MS Office XP
Professional.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Сучасний стан епізоотичної ситуації щодо ІРТ та ВД в Україні

З метою вивчення поширення ІРТ та ВД серед великої рогатої худоби в
Україні нами було проведено дослідження сироваток крові від тварин
різних вікових груп з семи областей України, при цьому визначали
кількість серопозитивних тварин (табл. 1, 2).

Проведений аналіз показав, що найвищий рівень серопозитивності до вірусу
ІРТ мають корови та молодняк 6-12 – місячного віку – 68,7-100 %. Нижчий
рівень серопозитивності виявлено у телят 1 – 6 – місячного віку – 33,3 –
87,5 %. Відносно ситуації щодо ВД ми спостерігали таку ж закономірність.
Максимальну кількість серопозитивних тварин виявлено серед корів та
молодняка 6 – 12 – місячного віку – 52,0 – 100 %. У молодняка ВРХ 1 – 6
– місячного віку серопозитивність до ВД становила на рівні 42,5 – 86,7
%.

Дані таблиць 1 та 2 свідчать про високий рівень інфікованості стад як
вірусом ІРТ, так і вірусом діареї ВРХ. Найвищий рівень серопозитивності
великої рогатої худоби до вірусів ІРТ і діареї спостерігали в
Рівненській області – 96,8 та 96,1 %, відповідно. Найнижчий рівень
серопозитивності до вірусу ІРТ і діареї встановлено в Луганській області
– 52,9 та 32,3 %, відповідно.

Таблиця 1

Серопозитивність до вірусу ІРТ великої рогатої худоби по деяким областям
України, РН (2003-2004 рр.)

Область Корови

Телята 1 – 6 – місячного віку

Молодняк 6-12 – місяців

Всього проб

всього

проб

позитивних

проб

%

всього

проб

позитивних

проб

%

всього проб

позитивних

проб

%

всього

проб

позитивних

проб

%

Харківська 39 38 97,4 101 68 67,3 15 15 100,0 155 121 78,0

Полтавська 74 72 97,3 17 14 82,3 20 14 70,0 111 100 90,0

Дніпро-петровська 35 32 91,4 24 20 83,3 – – – 59 52 88,1

Донецька 30 24 80,0 30 10 33,3 25 25 100,0 85 59 69,4

Рівненська 22 22 100,0 16 14 87,5 25 25 100,0 63 61 96,8

Луганська 16 11 68,7 18 7 38,8 – – – 34 18 52,9

Одеська 34 25 73,5 – – – 28 23 82,1 62 48 77,4

Таким чином, наші дані свідчать про широку змішану інфікованість
вірусами інфекційного ринотрахеїту та діареї великої рогатої худоби в
обстежених господарствах різних регіонів України. Це спонукало нас до
створення засобу специфічної профілактики ІРТ та ВД – інактивованої
вакцини.

Таблиця 2

Серопозитивність до вірусу діареї великої рогатої худоби по деяким
областям України, РН (2003-2004 рр.)

Область Корови

Телята 1 – 6 – місячного віку Молодняк 6-12 – місяців

Всього проб

всього

проб

позитивних

проб

%

всього

проб

позитивних

проб

%

всього

проб

позитивних

проб

%

всього

проб

позитивних

проб

%

Харківська 48 25 52,0 101 43 42,5 15 15 100,0 164 83 50,6

Полтавська 69 49 71,0 17 13 76,5 20 18 90,0 106 80 75,5

Дніпро-петровська 35 25 71,4 24 14 58,3 – – – 59 39 66,1

Донецька 15 15 100,0 25 13 52,0 15 12 80,0 55 40 72,7

Рівненська 22 22 100,0 15 13 86,7 15 15 100,0 52 50 96,1

Луганська 16 11 68,7 18 0 0 – – – 34 11 32,3

Одеська 22 15 68,2 – – – 28 22 78,6 50 37 74,0

Вибір і оцінка клітинних систем для культивування вірусів ІРТ та діареї

З метою підбору чутливої клітинної системи для накопичення вірусів ІРТ
та діареї з максимальним титром інфекційної активності були випробувані
лінії перещеплюваних клітин трахеї теляти, нирки вівці, коронарних судин
теляти, нирки сірійського хом’ячка (табл. 3).

Таблиця 3

Результати визначення інфекційної активності вірусів ІРТ та діареї на
культурах перещеплюваних клітин (М±м, n=3)

Перещеп-лювана культура клітин Титр інфекційної активності вірусів (lg
ТЦД50/см3)

ІРТ

ВД

Послідовні пасажі вірусів

вихідний титр

1

2

3

вихідний титр

1

2

3

ТрТ 7,12

±0,14 7,37

±0,14 7,43

±0,12 7,5

±0 6,0

±0,2 6,0

±0,2 6,25

±0,28 6,56

±0,12

КСТ 7,12

±0,14 7,12

±0,14 7,12

±0,14 7,12

±0,14 6,0

±0,2 6,75

±0,28 7,0

±0,28 7,5

±0*

НВ 7,12

±0,14 7,75

±0,28 7,87

±0,14 8,06

±0,12* 6,0

±0,2 6,0

±0,2 6,12

±0,14 6,31

±0,12

ВНК-21/2-17 7,12

±0,14 7,12

±0,14 7,12

±0,14 7,12

±0,14 6,0

±0,2 6,0

±0,2 6,0

±0,2 6,0

±0,2

* – різниця достовірна при р – ? ¶ ae ae ^ – ? ? ae ae ’aaE®E®®??Eap- O O i O O Ff* $ O O i O O $ O $ O $ O $ O ae‹e‹ $ O $ O ”?–? $ O $ O ?? . . bb O ???????и (%) ІРТ ВД ІРТ ВД до очистки після очистки до очистки після очистки до очистки після очистки до очистки після очистки ІРТ ВД Природня седиментація 9,25 ±0,28 9,25 ±0,28 8,56 ±0,12 8,56 ±0,12 0,85 ±0,05 0,68 ±0,03* 0,98 ±0,04 0,70 ±0,05* 20,0 28,6 Центрифу гування 9,25 ±0,28 9,25 ±0,28 8,56 ±0,12 8,56 ±0,12 0,85 ±0,05 0,49 ±0,02* 0,98 ±0,04 0,53 ±0,04* 42,4 46,0 * - різниця достовірна при р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020