.

Роль цистеїнових катепсинів у деградації білків при патологічних станах (реферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
124 3380
Скачать документ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЛЯННА ОЛЬГА ЛЕОНІДІВНА

УДК 577.152.34; 616.006

Роль цистеїнових катепсинів у деградації білків при патологічних станах

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Чорна Валентина Іванівна,

Дніпропетровський національний університет,

професор кафедри експериментальної фізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Мінченко Олександр Григорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу молекулярної біології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Хижняк Світлана Володимирівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет,

провідний науковий співробітник

лабораторії фізико-хімічної біології.

Захист відбудеться “24” _грудня____ 2007 р. о 16 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т академіка
Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “15” _листопада_ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біохімічні, клініко-біохімічні дослідження механізмів
патологічних процесів та розробка ефективних заходів для збереження
здоров’я нації становить особливо актуальну проблему для України.
Внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, яка класифікується як глобальна
техногенна катастрофа, загострення екологічної ситуації, рівень
захворюваності населення країни невпинно зростає (Іпатов А.В., 2002,
Леха В., 2005). На окрему увагу в цьому питанні заслуговує проблема
канцерогенезу (Зюков О., 2002, Ліанова Е.М., 2006, Міронова Ю.А., 2006).
На фоні активного вивчення процесу виникнення неоплазії, залишається
багато нез’ясованого стосовно протікання пухлинної трансформації клітин,
отримання ними властивостей, які обумовлюють стійкість протипухлинним
методам лікування (Koblinski J.E. et al., 2000, Castells A. et al.,
2002, Lin N.U. et al., 2004, Skrzydlewska E. et al., 2005, Nusse R.,
2007). На особливу увагу заслуговують дослідження біохімічних процесів,
які мають місце в клітині при її перетворенні на злоякісну та змін
метаболізму функціонування її ферментних систем. Відомо, що
протеолітичні ферменти, які приймають участь у канцерогенезі,
залучаються в складну послідовність взаємовідносин ракової клітини з
нормальними прилеглими тканинами, регуляторними та захисними системами
організму хазяїна (Matrisian L.M. et al., 2003, DeClerk Y.A. et al.,
2004, Arora P. et al., 2007). Останнім часом особлива увага приділяється
дослідженню участі протеолітичного-антипротеолітичного балансу та його
регуляції за канцерогенезу (Turk B. et al., 2000, Berdowska I. et al.,
2004). Серед протеїназ, пов’язаних зі злоякісним ростом, основними є
металопротеїнази, аспартільна протеїназа катепсин D та цистеїнові
протеїнази (катепсини В, L та Н) (Okamoto I. et al., 1999, Mareel M. et
al., 2003, Fehrenbacher N. et al., 2005). Порушення експресії,
компартменталізації, секреції цистеїнових катепсинів та регуляції їх
активності представляє собою відмінну рису пухлинних клітин (Jedeszko
C., 2004, Mohamed M., 2006). Секреція лізосомних кислих протеїназ
клітинами пухлини призводить до деструкції екстрацелюлярного матриксу та
лізису базальної мембрани, що є необхідною умовою інвазії пухлини
(Kayser K., 2003, Werle B. et al., 2004). Відомо, що за нормальних умов
незначна кількість каталітично активних катепсинів, які звільнилися з
лізосом пошкоджених клітин, ефективно блокується їх внутрішньо- та
зовнішньоклітинними інгібіторами, тоді як у трансформованій клітині
активація протеїназ пов’язана зі змінами синтезу, процесінгу та
локалізації їх ендогенних інгібіторів (Dickinson D.P., 2002, Turk B. et
al., 2002, Hirsch J. et al., 2004). Але питання участі лізосомних
цистеїнових протеїназ та їх ендогенних інгібіторів у процесах росту,
інвазії та метастазування пухлин залишається остаточно нез’ясованим.
Таким чином, визначення ролі лізосомних цистеїнових протеїназ
(катепсинів В, L та Н) і модуляції їх активності за умов пухлинного
росту в залежності від конкретної нозології, а також встановлення
зв’язку даних показників з характером перебігу, відповіддю на обрану
терапію та прогнозом захворювань зумовлюють актуальність проведення
досліджень у цьому напрямку.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у рамках д/б теми № Фіз.Ф.-63.2-04 “Роль лізосомних протеїназ в
діагностиці патологічного стану організму” кафедри експериментальної
фізики Дніпропетровського національного університету, д/б теми №
4-152-07 “Молекулярно-клітинні механізми розвитку патології нервової
системи та розробка комплексних методів ранньої діагностики” (№ д/р
0107U000529) медичного факультету Дніпропетровського національного
університету, д/б теми “Використання та встановлення критеріїв
ефективності ведучих груп психотропних речовин на поведінкові когнітивні
та мнестичні процеси при психотичних станах” (№ д/р 0199U002121) ЦНДЛ
Дніпропетровської державної медичної академії та договору про
науково-технічне співробітництво між Дніпропетровським національним
університетом та Дніпропетровською державною медичною академією №1256
(2005-2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – дослідження участі лізосомних
цистеїнових катепсинів у протеолізі білків та особливостей модуляції
активності катепсинів ендогенними інгібіторами за умов патологій.
Відповідно до мети поставлено такі задачі:

дослідити активність лізосомних цистеїнових катепсинів у
післяопераційному матеріалі та плазмі крові хворих з пухлинами головного
мозку;

виділити, очистити та дослідити фізико-хімічні властивості тканинних
ендогенних білкових інгібіторів лізосомних цистеїнових катепсинів за
канцерогенезу головного мозку;

дослідити вплив тканинного ендогенного інгібітору на гідроліз
фібронектину, основного білка екстрацелюлярного матриксу сполучної
тканини, цистеїновими катепсинами;

дослідити активність лізосомних цистеїнових катепсинів у
післяопераційному матеріалі та плазмі крові хворих із пухлинами
щитовидної залози;

виділити, очистити та дослідити фізико-хімічні властивості цистеїнових
катепсинів з пухлин щитовидної залози різного ступеня злоякісності;

дослідити гідроліз тиреоглобуліну, основного білка епітеліальної
тканини, цистеїновими катепсинами, виділеними та очищеними з пухлин
щитовидної залози;

дослідити та оцінити зміни активності лізосомних цистеїнових катепсинів
у плазмі крові хворих із онкологічними захворюваннями головного мозку та
щитовидної залози у післяопераційний період;

дослідити динаміку активності лізосомних цистеїнових катепсинів після
операції на моделі післяопераційного соматогенного болю у щурів, а також
за умов введення металотіонеїнів.

Об’єкт дослідження. Шляхи регуляції протеолізу в тканинах головного
мозку та щитовидної залози за патологічних станів.

Предмет дослідження. Органоспецифічні особливості регуляції активності
цистеїнових катепсинів В, L, Н; фізико-хімічні властивості цистеїнових
катепсинів В, L, Н; взаємодія катепсинів з ендогенними білковими
інгібіторами, виділеними та очищеними з пухлин головного мозку; динаміка
активності цистеїнових катепсинів у біологічних рідинах та тканинах за
патологічних станів; деградація цистеїновими катепсинами основних білків
сполучної та епітеліальної тканин.

Методи дослідження: біохімічні для визначення активності ферментів,
спектрофотометричні, хроматографічні для очистки білків,
електрофоретичні для з’ясування молекулярних мас та чистоти ізольованих
білків, а також математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження активності цистеїнових катепсинів у післяопераційному
матеріалі та плазмі крові хворих за канцерогенезу головного мозку та
щитовидної залози. Показано, що рівень активності ферментів залежить від
ступеня злоякісності пухлин.

Вперше запропоновано метод виділення та очистки ендогенних білкових
інгібіторів цистеїнових катепсинів та отримано очищені препарати
тканинних ендогенних білкових інгібіторів з тканин головного мозку без
новоутворень та пухлин головного мозку; досліджено їх фізико-хімічні та
функціональні властивості.

Вперше отримано очищені препарати цистеїнових катепсинів папілярної та
фолікулярної карцином щитовидної залози, проведено порівняльний аналіз
їх фізико-хімічних властивостей (Мr, Vmax, Км) та досліджено гідроліз
тиреоглобуліну цистеїновими катепсинами, які ізольовані з цих пухлин.

Вперше показано, що активність цистеїнових катепсинів змінюється в
післяопераційний період хворих із онкологічними захворюваннями головного
мозку та щитовидної залози, що проявляється у найбільш виражених змінах
активності катепсинів на першу добу після операції, та тенденцією до її
нормалізації на сьому добу післяопераційного періоду. За використання
моделі післяопераційного соматогенного болю в структурах і відділах ЦНС
та сироватці крові щурів досліджено активність цистеїнових катепсинів на
першу добу та через тиждень після проведення операції, а також визначено
вплив на неї металотіонеїнів (МТ-ІІ).

Практичне значення одержаних результатів. Визначення величин активності
цистеїнових катепсинів В, L, Н у біологічних рідинах та тканинах хворих
із онкологічними захворюваннями головного мозку та щитовидної залози
може бути інформативним методом оцінки (тестом) стану протеолізу
організму за канцерогенезу та використовуватись як об’єктивний показник
перебігу захворювання та ефективності обраної терапії. Дослідження
гідролізу основних білків сполучної (фібронектину) та епітеліальної
(тиреоглобуліну) тканин за участю цистеїнових катепсинів є зручним та
інформативним додатковим критерієм оцінки прогресу хвороби, а також
розширює можливості теоретичної медицини у плані сприяння для з’ясування
механізму ґенезу та терапії онкологічних захворювань.

Результати досліджень включено до програми курсу “Методи наукових
досліджень” для магістрів за спеціальністю лікар-ветеринар
Дніпропетровського державного аграрного університету. Отримані
результати використовуються в лікувально-діагностичній практиці
ЛОР-онкологічного відділення Дніпропетровської обласної клінічної
лікарні ім. Мечнікова при проведенні клініко-біохімічних аналізів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз
даних літератури, проведено експериментальні дослідження та статистична
обробка отриманих результатів. Розробка методології та обговорення
результатів проведено сумісно з науковим керівником. Консультативна
допомога в інтерпретації результатів біохімічних досліджень, наданні
матеріалів для дослідження та проведенні експериментів надано д.б.н.,
проф. Бразалуком О.З., д.б.н., проф. Ушаковою Г.О., д.мед.н., проф.
Кобеляцьким Ю.Ю, д.мед.н., проф. Хворостенко М.І., к.мед.н.
Ніколаєнко Т.П.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були
представлені на конгресах, симпозіумах та конференціях: І-м Молодежном
научно-практическом форуме “Информационные технологии в ХХІ веке”
(Днепропетровск, 2003), Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004), 8 Междисциплинарной международной
конференции биологической психиатрии “Стресс и поведение”
(Санкт-Петербург, Россия, 2004), Міжнародній науково-практичній
конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної
біохімії” (Тернопіль, 2004), Науково-практичній конференції “Актуальні
питання променевої діагностики і лікування онкологічних захворювань”
(Чернівці, 2004), Науково-практичній конференції “Фундаментальні питання
експериментальної та клінічної ендокринології” (Харків, 2005),
Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми
медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005), ІV з’їзді Українського
товариства терапевтичних радіологів та радіаційних онкологів (Алушта,
2005), FEBS Forum of Young Scientists (Visegrad, Hungary, 2005), 30th
FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Budapest, Hungary, 2005), 5th
Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Kyiv,
2005), IV Львівсько-Люблінській конференції “Сучасні аспекти
експериментальної та клінічної біохімії” (Люблін, Польща, 2006), ХІ
з’їзді онкологів України (Судак, АР Крим, 2006), Конференции
“Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности
ЦНС” (Пенза, Россия, 2006), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків,
2006), 6th Parnas Conference “Molecular Mechanism of Cellular Signaling”
(Krakow, Poland, 2007), ІІІ Міжнародній конференції молодих вчених
“Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція.” (Одеса, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, з них 6
статей, які опубліковані у профільних вітчизняних та зарубіжних
журналах, 11 тез доповідей у збірниках матеріалів міжнародних та
вітчизняних конференцій, симпозіумів, конгресів та 1 патент.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 122
сторінках друкованого тексту та складається з вступу, огляду літератури,
опису матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення,
висновків, списку використаних джерел, що включає 288 посилання (36
вітчизняних та 252 закордонних джерел) та додатків. Робота ілюстрована
17 таблицями та 50 рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експериментальну модельну частину роботи проведено на щурах лінії
Wistar, 4 місячного віку, вагою 180-220 г (54 тварини). Тварини
знаходилися в стандартних умовах із циклічністю доби: світло – 12 годин,
ніч – 12 годин. Для дослідження використано такі структури та відділи
головного мозку: гіпокамп, кора великих півкуль, мозочок, продовгуватий
мозок, таламус/гіпоталамус, а також сироватку крові. В дослідах
використано плазму крові донорів; тканини головного мозку, без
новоутворень, людей, що загинули від нещасного випадку; плазму крові та
післяопераційний матеріал хворих із пухлинами головного мозку
(невриноми, ангіоми, менінгеоми, астроцитоми, гліобластоми); плазму
крові та післяопераційний матеріал хворих із пухлинами щитовидної залози
(вузловий еутиреоїдний зоб, папілярний, фолікулярний рак) (загальна
кількість пацієнтів становила 107 осіб). В процесі виконання
дисертаційної роботи було передбачено заходи по забезпеченню безпеки для
здоров’я пацієнтів, дотримання їх прав та морально-етичних норм у
відповідності до конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини,
Гельсінської декларації прав людини та відповідних законів України.

Визначення активності цистеїнових катепсинів В, L, Н. Активність
катепсину В досліджували за розщепленням p-нітроаніліду
Nб-бензоїл-D,L-аргініну (БАПА) “Fluka” (Швейцарія) за 60 хв інкубації
при 37 єС (Barrett A. et al., 1981) з деякими модифікаціями (Черная В. и
др., 1989). Активність катепсину L визначали за гідролізом 1%
азоказеїну, денатурованому 3М сечовиною за 60 хв інкубації при 37 єС
(Березин В. и др., 1982). Азоказеїн синтезували за методом Сурінова Б.Г.
и др. (Суринов Б.Г., 1965). Активність катепсину Н виявляли за
гідролізом в-нафтіламіду L-лейцину (Лей-НА) “Koch-Light Laboratories”
(Англія) за 120 хв інкубації при 37 єС (Schwartz W. et al., 1980) з
деякими модифікаціями (Черная В. и др., 1989).

Виділення та очистку катепсинів В, L, Н проведено згідно до схеми
(Чорна В.І., 2001).

Виділення та очистку тканинних ендогенних білкових інгібіторів
цистеїнових катепсинів проведено згідно до авторської схеми, яка
включала такі етапи: гомогенізація (середовище гомогенізації – 0,025 М
трис-HCl буфер (рН 7,4), який містив ЕДТА – 0,001 М, NaCl – 0,15 М,
тритон Х-100 – 0,2 %), висолювання сульфатом амонію (до 80% насичення),
гель-хроматографію на колонці з сефадексом G-150 (“Pharmacia”, Швеція),
іонообмінну хроматографію на DEAE- сефадексі A-50 (“Pharmacia”, Швеція)
(десорбцію білків ендогенних інгібіторів проводили 0,3 М NaCl,
приготовленому на 0,1 М фосфатному буфері (рН 6,0)) та
гель-хроматографію на колонках з сефадексом G-100 (“Pharmacia”, Швеція).

Модель експериментального післяопераційного соматогенного болю за
Бреннаном (Brennan T.J., 1996).

Визначення молекулярних мас білків виконано за допомогою авторської
комп’ютерної програми Glikan (Какадій О.Л. та ін., 2003).

Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами
варіаційної статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Розрахунки та побудову
графіків виконано на РС –Pentium (133) з використанням прикладних
програм Microsoft Office Excel 2003, Statistica 5.0. Вірогідними вважали
результати, якщо pAAeAE4 p @ B D F ? ? i D??? 4 r Oe 1При дослідженні деградації ТГ катепсинами В та Н, виділеними та очищеними з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ, відмінностей у фрагментації глікопротеїну не виявлено, а продукти деградації мають молекулярні маси від 321 до 61 кДа. Встановлено, що гідроліз ТГ очищеним катепсином L з фолікулярної карциноми ЩЗ відрізняється від деградації ТГ катепсином L з папілярної карциноми ЩЗ, що проявляється в появі фрагментів тиреоглобуліну з молекулярними масами 155, 104, 96 та 61 кДа. Таким чином, з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ отримано цистеїнові катепсини В, L, Н та визначено їх молекулярні маси (29 кДа). Аналіз фізико-хімічних властивостей виявив відмінності у специфічності цистеїнових катепсинів В, L, Н у злоякісних пухлинах ЩЗ за змінами Vmax, KM/Куяв та кінетики каталізу. Методом електрофорезу в ПААГ з ДСН встановлена деградація тиреоглобуліну цистеїновими катепсинами В, L, Н, виділеними з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ. Показана відмінність у ступені фрагментованості тиреоглобуліну для катепсину L з фолікулярної карциноми ЩЗ, порівняно із гідролізом ТГ катепсином L з папілярної карциноми, яка проявляється у появі нових фрагментів. Активність лізосомних цистеїнових катепсинів після операції по видаленню пухлин. Рівень активності катепсину L, визначений у плазмі крові хворих із патологіями головного мозку та щитовидної залози, свідчить про порушення функціонального стану лізосомно-вакуолярного апарату клітин нервової та епітеліальної тканин за канцерогенезу. Зміни даного показника на різних етапах лікування хворих можуть вказувати на наявність/відсутність цитолітичних процесів у тканинах організму та пов’язаних з ними метаболічних порушень. Рівні активності катепсину L у плазмі крові хворих, визначали у день проведення операції по видаленню пухлини та порівнювали із показниками на сьомий день після операції. Згідно з даними літератури, перший день після хірургічного втручання є періодом вираженої гіпералгезії, а на сьому добу відбувається загоєння рани та послаблення гіпералгезії (Кобеляцький Ю.Ю. и др., 1999, Козубенко Н.В. и др., 2001). Встановлено, що на сьомий день після операції рівні активності катепсину L у плазмі крові хворих із менінгіомами та астроцитомами зменшились на 94 та 22% відповідно до показника активності ферменту у день операції (рис. 4А), а в плазмі крові хворих із доброякісними та злоякісними пухлинами ЩЗ активність ферменту вірогідно зменшилась у 14,0 та 13,0 рази відповідно, порівняно з операційним показником (рис. 4Б). Зниження активності цистеїнового катепсину L в плазмі крові хворих після проведення хірургічної операції, свідчить про те, що видалення пухлини – джерела неконтрольованої протеолітичної активності, яка є наслідком метаболічних змін та порушень протеолітичного-антипротеолітичного балансу в клітинах пухлин – відбивається на функціональному стані лізосомно-вакуолярного апарату. Представлені дані вказують на можливість використання визначення рівня активності цистеїнового катепсину L в плазмі крові хворих із пухлинами головного мозку та щитовидної залози для моніторингу перебігу онкологічного захворювання. Рис.4. Активність катепсину L в плазмі крові хворих з пухлинами головного мозку (А) та щитовидної залози (Б) у післяопераційний період (M±m): 1 – контроль (n=18ч30), 2 – менінгіома (n=6), 3 – астроцитома (n=5), 4 – доброякісні пухлини ЩЗ (n=10), 5 – злоякісні пухлини ЩЗ (n=21). * - р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020