Роль металотіонеїнів коропа (cyprinus carpio l.) та рака (astacus leptodactylus eschscholtz) в адаптації організму до забруднення водного середовища (

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ФАЛЬФУШИНСЬКА ГАЛИНА ІВАНІВНА

УДК 577.352.38:577.64

Роль металотіонеїнів коропа (cyprinus carpio l.) та рака (astacus
leptodactylus eschscholtz) в адаптації організму до забруднення водного
середовища

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському національному педагогічному
університеті імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки
України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор кафедри хімії

СТОЛЯР Оксана Борисівна,

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира
Гнатюка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СОЛОГУБ Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин

доктор біологічних наук, професор

АРСАН Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідувач відділу екотоксикології

Провідна установа – Київський національний університет імені Тараса
Шевченка Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться „ 13 ” вересня 2005 р. о ____ годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології
тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38

Автореферат розісланий „ 12 ” серпня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За умов комплексного забруднення, властивого
природним водоймам, вимірювання гідрохімічних показників, як і
визначення вмісту токсиканта в організмі, не може бути достатнім
критерієм для оцінки небезпеки забруднення (Линник П. Н., 1999;
Брагинский Л. П., Линник П. Н., 2003). Тому актуальною задачею є пошук
чутливих і адекватних біомаркерів стану водойм.

До перспективних біохімічних маркерів відносять металотіонеїни –
низькомолекулярні термостабільні білки (ТБ) з високим вмістом цистеїну
(Kagi J. H. R., Schaffer A., 1988), що беруть участь у гомеостазі цинку
і міді та детоксикації кадмію (Klaassen C. D. та ін., 1999; Maret W.,
2000; Brouwer M. та ін., 2003). Металотіонеїни рекомендують
використовувати для біотестування забруднення водойм кадмієм, міддю,
цинком та ртуттю (Roesijadi G., 1994). Поряд з цим, металотіонеїни – це
білки гострого стресу, які індукуються різноманітними чинниками, у тому
числі активними формами кисню (АФК) (Pearce М. та ін. 2000). Тому
перспективним є, очевидно, їх дослідження за дії органічних
забруднювачів, багато з яких, або продуктів їх перетворення, мають
прооксиданту дію (Lam P. K. S., Wu R. S. S., 2003).

Разом з тим, методологічне підґрунтя для використання металотіонеїнів як
біомаркерів забруднення води не сформоване. Мало досліджено питання про
видову специфічність відповіді металотіонеїнів, не визначені критерії
ефективності функції металотіонеїнів (Столяр О.Б., 2004). Вивчення
металотіонеїнів здебільшого здійснюється за впливу гостротоксичних
концентрацій металів протягом короткого часу і, переважно, на морських
видах (Roesijadi G., 1994; Viarengo A. та ін., 1999).

На етапі іонообмінної хроматографії (ІОХ) металотіонеїни здатні
утворювати дві молекулярних форми – МТ-1 і МТ-2 (Kagi J. H. R., Schaffer
A., 1988). У низці досліджень виявлено відмінності їх властивостей
залежно від природи індуктора (Brouwer M. та ін., 1992; Dallinger R. та
ін., 2004). Тому ми вважали за доцільне порівняти властивості окремих
молекулярних форм металотіонеїнів та показники
антиоксидантно-прооксидантного стану (АПС) у представників еволюційно
віддалених видів прісноводних тварин, які належать до одного біотопу, за
впливу на організм поширених забруднювачів водного середовища у
екологічно реальних концентраціях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у межах науково-дослідних тем держбюджетної тематики
Тернопільського національного педагогічного університету імені
Володимира Гнатюка “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних
екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” № держреєстрації
0101UO00303 (2001-2003 рр.) та „Молекулярні адаптації гідробіонтів до
токсикантів та розробка системи критеріїв оцінки якості води і рівня
токсичності у водних екосистемах” № держреєстрації 0101UO00303
(2004-2006 рр.), в яких автор досліджував властивості металотіонеїнів та
активність ферментів антиоксидантного захисту в тканинах коропа за дії
іонів важких металів.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було порівняти властивості
молекулярних форм металотіонеїнів та показники стану антиоксидантного
захисту у представників еволюційно віддалених видів – коропа (Cyprinus
carpio L.) та рака (Astacus leptodactylus Eschscholtz), які належать до
одного біотопу, за впливу на організм іонів важких металів – поширених
забруднювачів середовища, а також фенолу.

Завдання:

Виділити молекулярні форми металотіонеїнів з тканин коропа і рака та
дослідити їх склад.

Дослідити вплив іонів важких металів (міді, цинку, марганцю, свинцю)
поокремо і в суміші та фенолу на хроматографічну поведінку, спектральні
властивості та склад металів металотіонеїнів тканин коропа і рака.

Визначити ефективність металозв’язуючої функції металотіонеїнів за умов
забруднення на підставі порівняння вмісту металів у металотіонеїнах та
інших компонентах тканин.

Визначити активність ізоформ супероксиддисмутази (СОД) (Cu,Zn-СОД та
Mn-СОД), утворення продуктів окисної деструкції ліпідів і білків у
тканинах коропа і рака за дії на організм забруднювачів.

Здійснити порівняльний аналіз металозв’язуючої функції металотіонеїнів
коропа і рака. З’ясувати наявність зв’язку між цією функцією та
показниками антиоксидантно-прооксидантного стану у тканинах коропа і
рака.

Розробити рекомендації з застосування молекулярних форм металотіонеїнів
коропа і рака у біомоніторингу водойм.

Об’єкт дослідження – металозв’язуюча функція молекулярних форм
металотіонеїнів прісноводних тварин.

Предмет дослідження – участь і ефективність молекулярних форм
металотіонеїнів та системи антиоксидантного захисту коропа та рака в
адаптації до забруднення водного середовища іонами важких металів та
фенолом.

Методи дослідження – хроматографічні, спектрофотометричні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено порівняльне дослідження
молекулярних форм металотіонеїнів коропа і рака за дії на організм іонів
важких металів та фенолу. Вперше показано, що вплив усіх досліджуваних
чинників у екологічно сумісних концентраціях у коропа викликає зменшення
вмісту міді в МТ-2, яке узгоджується із пригніченням активності
Cu,Zn-СОД у тканинах. Встановлено, що металотіонеїни рака збільшують
акумуляцію цинку за стабільного вмісту міді за дії всіх досліджених
чинників. Виявлено, що металотіонеїни зябер коропа і рака значно
чутливіші, ніж металотіонеїни печінки (гепатопанкреасу) до дії
досліджених токсикантів. Доведено наявність кореляції між змінами вмісту
цинку в МТ-2 та утворенням ТБК-активних продуктів у тканинах обох видів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть
бути використані як біонормативні показники при розробці рекомендацій з
оцінки якості рибної продукції та рівня токсичності водного середовища.
Одержані результати і теоретичні узагальнення використовуються у
викладанні курсів “Молекулярна і біологічна хімія”, “Екологічна
біохімія”, “Молекулярні основи процесів життєдіяльності” в підготовці
студентів та магістрів спеціальностей “хімія, біологія, екологія і
географія” в Тернопільському національному педагогічному університеті
імені Володимира Гнатюка.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно опрацьовано літературні
джерела, проведено більшість біохімічних і фізико-хімічних досліджень та
здійснено їх статистичну обробку. За участю наукового керівника
проведено аналіз результатів наукового експерименту. Амінокислотний
аналіз металотіонеїнів виконано у лабораторії “Якості та безпеки
сільськогосподарської продукції” Національного аграрного університету,
м. Київ.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на
конференціях: 8-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих
вчених, Пущіно, Росія, 2004; Міжнародній науково-практичній конференції
“Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”, Львів, 2004; VIII
Міжнародній науковій екологічній конференції “Актуальні проблеми
збереження стійкості живих систем”, Бєлгород, 2004; Міжнародній науковій
конференції “Сучасні проблеми фізіології і біохімії водних організмів”,
Петрозаводськ, 2004; щорічних звітних наукових конференціях магістрантів
та викладачів хіміко-біологічного факультету ТДПУ, Тернопіль, 2001 –
2004 р.р., конгресах: 41-му конгресі Європейських товариств токсикології
“Eurotox 2003”, Флоренція, 2003; Установчому конгресі Українського
товариства клітинної біології, Львів, 2004; 4-му Міжнародному симпозіумі
„Biometals Symposium (IBS-4)”, Гарміш-Партенкірхен, 2004, 42-му конгресі
Європейських товариств токсикології “Eurotox 2005”, Краків, 2005.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 праць, у тому
числі 8 – статті у фахових виданнях (з них – 1 одноосібна), 7 –
матеріали і тези доповідей на з’їздах, симпозіумах і конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 170 сторінках
комп’ютерного набору, складається зі вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів досліджень, 7 розділів, присвячених викладу
отриманих результатів, аналізу та узагальнення, висновків, списку
використаної літератури. Робота містить 65 рисунків, 42 таблиці.
Бібліографічний список складає 300 джерел, з них 251 латиною. Загальний
обсяг ілюстрацій і таблиць – 44 сторінки, списку використаних джерел –
31 сторінка.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано масив літературних даних щодо ролі
металотіонеїнів та показників АПС у біотестуванні забруднених водойм.
Застосування металотіонеїнів як біомаркерів забруднення ґрунтується на
здатності чисельних чинників індукувати ці стресорні білки. У результаті
аналізу встановлено, що не вироблені однозначні критерії ефективності
функції окремих молекулярних форм металотіонеїнів та не з’ясовано їх
взаємозв’язок із показниками АПС за екстремального впливу на організм.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводились на дворічках
коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) масою 200 – 250 г (140
екземплярів) та дорослих особинах рака вузькопалого (Astacus
leptodactylus Eschscholtz) живою масою 50?5 г та довжиною тіла 10?1 см
(80 екземплярів). Тварин адаптували до лабораторних умов протягом 7 діб
у басейнах об’ємом 2 м3.

Експериментальні умови створювали в басейнах об’ємом 200 л, в яких
утримували тварин у кількості 10 особин. Воду відстоювали і змінювали
щодві доби. Температура води коливалась в межах 10 ? – 18 ?С залежно від
сезону. Тварин годували гранульованим кормом для риб.

У кожному лабораторному досліді одна група була контрольною, іншій
(іншим) у воду додавали солі важких металів або фенол. Вміст у воді Cu2+
(CuSO4) в розрахунку на катіон складав 0,01 або 0,2 мг/л; Zn2+ (ZnSO4) –
0,1 або 2,0 мг/л ; Mn2+ (MnCl2) – 0,13 або 2,6 мг/л; Pb2+ (Pb(NO3)2) –
0,01 або 0,2 мг/л, фенолу – 0,002 мг/л. При дослідженні дії суміші іонів
вміст компонентів складав Cu2+ – 0,01 мг/л, Zn2+ – 0,1 мг/л, Mn2+ – 0,13
мг/л, Pb2+ – 0,01 мг/л. Вміст внесених аніонів був значно нижчим, ніж їх
дозволений вміст у рибогосподарських водоймах (Воробьев В.И., 1979) та
ніж такий, що викликає осадження іонів. Період інкубації становив 14
діб, що вважається найбільш оптимальним для аклімації гідробіонтів до
дії екстремальних факторів (Хлебович В.В., 1981).

Для аналізу використовували у коропа передню долю печінки і зяброві
дуги, а у рака – гепатопанкреас та зябра. Всі процедури з виділення і
обробки зразків проводились на холоді. Всі реактиви були кваліфікації
“хч”.

Металотіонеїни одержували із термостабільного екстракту тканин шляхом
двоступеневої очистки: гель-фільтрації на сефадексі G-75 та ІОХ на
ДЕАЕ-целюлозі. Визначали амінокислотний склад металотіонеїнів на
амінокислотному аналізаторі ААА Т 339М. Апоформу металотіонеїнів
одержували шляхом їх інкубації в 100 мМ розчині ЕДТА протягом 48 год.
при температурі 4 ?С (Мелконян В.З. и др., 1984). Вміст SH-груп у
фракції металотіонеїнів визначали за (Торчинский Ю.М., 1977).

Вміст білків у тканині визначали методом Лоурі та ін. (1951). У тканинах
тварин визначали загальну активність СОД [КФ 1.15.1.1] (Чевари С. и др.,
1991) та активність Mn-СОД (Floreany M. та ін., 2002). Оцінювали
інтенсивність перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) за утворенням
ТБК-активних продуктів в умовах активації перекисних процесів
(Тимирбулатов Р.А., Селезнев Е.Н., 1981) та вмістом окисних модифікацій
білків (Мещишен І.Ф., 1998).

Вміст металів у тканині, розчині ТБ, їх фракціях та молекулярних формах
металотіонеїнів вимірювали після спалювання зразків у перегнаній
нітратній кислоті на полум’яному атомно-адсорбційному спектрофотометрі
С-115 („Ломо”) (міді, цинку, марганцю і заліза) та на графітовому
спектрофотометрі S-600 („Селмі”) (свинцю та кадмію).

Вміст металотіонеїнів у тканині обчислювали за формулою (Das К. та ін.,
2002), модифікованою нами із врахуванням одновалентного стану міді в
металотіонеїнах: m(MT)=[(?Zn+ ?Cd)/7+?Cu/12)]·M(MT) (мкг/г тканини), де
? – кількість металу у фракції, нмоль/г тканини; М(МТ) – молярна маса
металотіонеїнів (6,8 кДа) (Kagi J.H.R., Shaffer A., 1988), враховуючи,
що ці білки зв’язують по сім іонів Zn2+ або Cd2+ або 12 іонів Cu+ на
молекулу. Проводили кореляційний аналіз взаємозалежності диференційних
спектрів ТБ (Дёрффель К., 1994). Для одержання диференційних спектрів
показники кожного УФ-спектру подавали у вигляді (Dd-Dk)/Dk, де Dd –
оптичне поглинання дослідного зразку, а Dk – контрольного зразку при
однаковій довжині хвилі. Статистичну обробку експериментальних даних
здійснювали за Г. Ф. Лакіним (1990), використовуючи пакет програм
Statistica v5.5 і Exell для Windows-2000.

Результати досліджень та їх обговорення

Металотіонеїни коропа та рака. Склад та властивості. При розподільчій
хроматографії ТБ тканин коропа та рака у всіх досліджуваних випадках
виявляється дві фракції (рис. 1) з Mr близько 60 та 7 кДа. У білках
фракції з Мr біля 7 кДа виявлено ознаки наявності метал-тіолатних
кластерів (смуга поглинання з максимумом 254 нм), які втрачаються при
переході білка в апоформу, та відсутність в їх складі ароматичних груп
(відсутність смуги поглинання при 280 нм).

Б

Рис. 1. Профілі елюції ТБ тканин коропа (А) та рака (Б) при
гель-фільтрації на сефадексі G-75 в 0,01 М трис-HCl буфері, рН 8,0.
Горизонтальною лінією виділені проби, об’єднані для ІОХ, стрілками
указано об’єм елюції маркерів: 1,1 Ve/Vo – 67 кДа, 2,1 Ve/Vo –12,3 кДа,
2,5 Ve/Vo – 5,8 кДа

У результаті ІОХ металотіонеїнів тканин коропа та рака було виділено дві
молекулярних форми – МТ-1 та МТ-2 (рис. 2), що є типовою ознакою
тваринних металотіонеїнів. МТ-1 обох досліджуваних видів елююється при
0,27 – 0,28 М NaCl, а для МТ-2 відзначений різний об’єм елюції: 0,36 М
NaCl для коропа та 0,42 М NaCl для рака. Для металотіонеїнів коропа в
контролі характерне домінування МТ-2, що відзначене і в інших хребетних
(Das K., 2002), а у рака – МТ-1, як і у деяких безхребетних та
одноклітинних (Саванина И.Б. та ін., 1995; Столяр О.Б., 2004).

Спектральні ознаки металотіонеїнів краще виражені у МТ-2 обох видів
(рис. 3).

Головними металами у складі металотіонеїнів обох видів у контролі є цинк
і мідь. Згідно співвідношення їх кількості металотіонеїни коропа
належать до Zn-MT, а рака – Zn,Cu-MT. Свинець у складі металотіонеїнів
обох видів не виявляється. Різний склад металів та відмінності спектрів
для МТ-1 і МТ-2 відзначені й іншими авторами (Kito H. та ін., 1982; Das
К. та ін. 2002).

Б

Рис. 2. Профілі елюції металотіонеїнів печінки (гепатопанкреасу) (1) і
зябер (2) коропа (А) та рака (Б), одержані при ІОХ на ДЕАЕ-целюлозі в
лінійному градієнті NaCl в 0,01 М трис-HCl буфері, рН 8,0

Властивості металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії іонів міді. У
коропа за дії обох концентрацій міді проявляється загальна тенденція до
збільшення співвідношення об’ємів виходу МТ-1/МТ-2, найкраще виражена
у зябрах. Металотіонеїни коропа не здатні акумулювати надлишок міді (за
виключенням МТ-2 печінки за дії 0,2 мг/л). Найбільш вразливою формою,
яка втрачає специфічні спектральні ознаки і здатність зв’язувати цинк і
мідь, є МТ-2, особливо в зябрах (рис. 4,5).

Металотіонеїни тканин рака за дії міді підтримують її стабільний рівень
або акумулюють надлишок, що узгоджується із збільшенням інтенсивності
поглинання при 260 нм (рис. 5 В).

У рака активність Cu,Zn-СОД значно вища, ніж у коропа, тоді як
активність Mn-СОД у обох видів подібна. Досліджувані види гідробіонтів
істотно відрізняються за здатністю до ініціації пероксидації ліпідів у
тканинах. Це узгоджується з відомою оберненою залежністю між
інтенсивністю ПОЛ та розміром тварин (Hamza-Chaffai A. та ін., 2003). За
дії міді найбільш чутливим показником АПС у тканинах коропа була
активність Cu,Zn-СОД. Показники АПС у рака порівняно з коропом були
значно стабільніші, особливо активність Cu,Zn-СОД, що узгоджується і з
більшою стабільністю функції металотіонеїнів цього виду (табл. 2,3).

Властивості металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії іонів цинку. У
тканинах коропа за дії цинку істотно зростає об’єм виходу МТ-1, а у
зябрах ще й зменшується МТ-2. За дії 2,0 мг/л цинку в УФ-спектрах МТ-2
проявляється плече при 225 нм, характерне для Zn-MT. Зміни вмісту
металів у металотіонеїнах тканин коропа носять концентраційно-залежний
характер та не відповідають змінам загального вмісту металів у тканинах.
Найбільше ураження цинк- та мідь-зв’язуючої функції спостерігається у
МТ-2 зябер за дії 0,1 мг/л цинку. За дії 2 мг/л цинку збільшується
здатність металотіонеїнів коропа до акумуляції цинку, міді та марганцю.

Б

Рис. 3. УФ-спектри молекулярних форм металотіонеїнів тканин коропа (А)
та фракцій ТБ тканин рака (Б) у контрольних тварин

У рака за дії 0,1 мг/л цинку у гепатопанкреасі та металотіонеїнах обох
тканин зростає вміст діючого металу. Металотіонеїни підтримують
стабільний рівень міді, незважаючи на зменшення її загального вмісту у
тканині. У спектрі МТ-2 гепатопанкреасу посилюються специфічні
спектральні ознаки.

За дії цинку у коропа і рака спостерігається різний характер змін АПС,
причому рак зазнає більш істотного ураження. Визначення показників АПС
показало, що за дії 0,1 мг/л цинку у печінці коропа паралельно із
пригніченням активності Cu,Zn-СОД, а у зябрах – ще й Mn-СОД, зменшується
утворення ТБК-активних продуктів. У гепатопанкреасі рака відмічено
чотирикратне зростання інтенсивності ПОЛ, зменшення вмісту
фенілгідразонів на тлі стабільної активності обох ізоформ СОД.

Таблиця 1

Вміст металів, нмоль/г тканини, у молекулярних формах металотіонеїнів
коропа та рака, М?m, n=3

метал Короп

Рак

печінка

зябра

гепатопанкреас

зябра

МТ-1

МТ-2

МТ-1

МТ-2

МТ-1

МТ-2

МТ-1

МТ-2

Cu 11,3?0,3 40,7?0,9 10,0?0,6 40,7?1,8 28,3?3,2 28,7?2,6 30,8 17

Zn 131,7?0,3 170,7?1,9 100,0?12,0 403,1?26 68,3?5,0 71,7?1,5 45,2 36

Mn 1,7?0,2 10,7?0,9 4,5?0,1 28,0?0,6 58,7?5,0 18,3?2,1 28,1 26

Cd 1,8?0,1 10,3?2,6 1,5?0,3 8,9?0,8 0,5?0,0 1,4?0,2 0,3 0,6

Властивості металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії іонів марганцю.
За дії марганцю у коропа спостерігається збільшення об’єму виходу МТ-1
та зменшення об’єму МТ-2. У спектрах МТ-1 здебільшого проявляється
значний гіперхромний ефект з максимумом біля 260 нм, а у спектрі МТ-2 –
гіперхромний ефект у ближньому ультрафіолеті (рис. 5).

Б

Г

Рис. 4. Вміст металів у металотіонеїнах печінки (А) та зябер (Б) коропа;
гепатопанкреасу (В) та зябер (Г) рака (%, відхилення від контролю) за
дії металів та фенолу на організм, 1 – МТ-1, 2 – МТ-2

За дії 0,13 мг/л марганцю на організм у зябрах коропа зростає вміст
цинку та зменшується вміст міді на тлі стабільного вмісту марганцю. Для
молекулярних форм металотіонеїнів коропа характерне зменшення
мідь-зв’язуючої функції за дії 0,13 мг/л металу та цинк-зв’язуючої – за
дії обох концентрацій марганцю (рис. 4).

У рака істотно зростає загальний вміст цинку у гепатопанкреасі, а також
в ТБ обох тканин, особливо у металотіонеїнах. В УФ-спектрі МТ-1
відзначено гіперхромний ефект у ближньому ультрафіолеті. Отже, дія
марганцю на металотіонеїни коропа і рака проявляється по різному.

Таблиця 2

Активність ізоформ СОД тканин коропа та рака у контролі та за дії важких
металів та фенолу на організм, M?m, n=5-6

Група тварин Активність Cu,Zn-СОД, у.о./ мг білка

Активність Mn-СОД,у.о./ мг білка

короп

рак

короп

рак

печінка

зябра

гепатопанкреас

печінка

зябра

гепатопанкреас

контроль 0,19±0,01 0,48±0,04 1,20?0,17 0,66±0,12 0,82±0,08 0,77?0,08

мідь 0,14±0,01* 0,17±0,06* 1,05?0,07 0,67±0,06 0,86±0,05 0,89?0,23

цинк 0,07±0,01** 0,07±0,02* 1,23?0,22 0,57±0,05 0,53±0,07* 0,72?0,08

марганець 0,09±0,01** 0,33±0,01* 1,52?0,08 0,60±0,05 0,39±0,11*
0,41?0,04*

свинець 0,14±0,01* 0,27±0,03* 3,31?0,84* 0,41±0,05* 0,73±0,11 1,77 ?
0,42*

суміш 0,04±0,01** 0,14±0,02* 1,98?0,33* 0,59±0,02 0,24±0,04* 0,90 ? 0,30

фенол 0,13±0,03* 0,10±0,02* 1,10±0,15 0,59±0,02 0,46±0,04* 0,33±0,06*

Примітка. Тут і далі: *,** – зміни порівняно з контролем вірогідні
(*–p<0,05, **– p<0,01) Високочутливим показником АПС за дії марганцю є СОД. У печінці коропа зменшується активність Cu,Zn-СОД, а у зябрах ще й Mn-СОД, хоча інтенсивність ПОЛ не зазнає істотних змін. Пригнічення Mn-СОД у гепатопанкреасі рака супроводжується посиленням ПОЛ. АБВ Рис. 5. Типові зміни диференційних УФ-спектрів молекулярних форм металотіонеїнів печінки (А) та зябер (Б) коропа і гепатопанкреасу рака (В) за дії екологічно-сумісних концентрацій металів та фенолу на організм А Б Рис. 6. Вміст металів у молекулярних формах металотіонеїнів печінки (А) та зябер (Б) коропа (%, відхилення від контролю) за 20-кратного перевищення екологічно реального вмісту металів у воді, 1 – МТ-1, 2 – МТ-2 ? Ue oe ? Ue x ??????x z oe O $ O $ O O O O O O O ???$???ох досліджуваних концентрацій свинцю зростає гетерогенність металотіонеїнів та зменшується об’єм виходу МТ-2 в обох тканинах. Збільшення вмісту цинку в МТ-2 печінки за дії 0,01 мг/л свинцю (рис. 4), та в МТ-1 за дії 0,2 мг/л свинцю (рис. 6) узгоджується із змінами спектру. Втрата ознак кластерної структури у МТ-2 зябер збігається із значним зменшенням вмісту в них цинку та міді. У рака істотно зростає вміст міді та цинку та зменшується марганцю у гепатопанкреасі. Вміст свинцю зростає у зябрах з 5,30?0,05 до 28,8?2,4 нмоль/г тканини. Відзначено зменшення об’єму виходу МТ-1 і МТ-2 та вмісту в них металів. В УФ-спектрах фракцій у середньому ультрафіолеті змін не виявлено. За дії свинцю у тканинах тварин обох видів прооксидантні процеси не активуються. У тканинах коропа зменшується активність Cu,Zn-СОД. У рака в гепатопанкреасі активність обох ізоформ СОД зростає. За дії свинцю спостерігається узгодженість між значним зростанням вмісту незв’язаної з металотіонеїнами форми міді у тканині та активності Mn-СОД, що є специфічною ознакою хронічного отруєння міддю у ракоподібних (Brouwer M. та ін., 1992). Властивості металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії суміші іонів металів. За дії суміші металів металотіонеїни коропа не беруть участі в акумуляції надлишку цинку, який виникає в зябрах, та частково втрачають мідь у печінці та, особливо, в зябрах, де загальний вміст цього металу зменшується. Зміни вмісту металів у МТ-1 зябер за дії суміші корелюють з відповідними змінами за дії міді (r=0,96; p = 0,03) та цинку (r=0,99; p = 0,02). Для диференційних спектрів МТ-1 тканин коропа за сумісної та окремої дії металів спостерігаються подібні прояви, причому найбільша відповідність відзначена з спектрами за окремої дії марганцю (r>0,83;
p<0,01). Таблиця 3 Інтенсивність окисної деструкції ліпідів та білків тканин коропа та рака за дії важких металів та фенолу на організм, M?m, n=5-6 Група тварин Утворення ТБК-активних продуктів, мкмоль/г тканини Утворення фенілгідразонів, мМ/г білків, 370 нм короп рак коропа рак печінка зябра гепатопанкреас печінка гепатопанкреас контроль 26,5±2,0 17,9±1,3 35,3?4,3 2,0±0,3 18,6?2,0 мідь 16,6±1,5* 25,8±1,7* 28,2?1,7 2,8±0,5 12,0?1,5* цинк 14,5±0,4* 12,7±0,8* 152,7?13,6* 1,8±0,1 9,5?0,8* марганець 24,5±1,4 14,6±0,4 75,4?9,4* 0,5±0,1* 12,3?1,7* свинець 17,3±0,6 20,1±0,7 47,0?7,6 1,2±0,1* 24,0?5,9 суміш 27,8±0,6 15,1±0,3 87,8?5,3* 1,0±0,3 13,4?0,5* фенол 37,7±2,8* 26,5±2,4* 48,5±2,8* – 13,4±1,0 Примітка. а Дані Столяр О.Б. У гепатопанкреасі рака надлишок цинку в основному акумулюється високомолекулярною фракцією ТБ. Мідь та марганець вибірково акумулюється металотіонеїнами, особливо МТ-2, а надлишок міді у зябрах – термолабільними сполуками. Металотіонеїни зябер функціонують менш ефективно у зв’язуванні металів, ніж за окремої їх дії. Сумісний вплив металів, порівняно з окремою їх дією, у коропа посилює акумуляцію цинку у МТ-1 печінки та міді у МТ-1 зябер, а у рака – міді та марганцю в МТ-2 гепатопанкреасу. У тканинах коропа за дії суміші металів відбувається зменшення активності Cu,Zn-СОД, однак інтенсивність ПОЛ не змінюється. У рака спостерігається одночасне збільшення активності Cu,Zn-СОД та інтенсивності ПОЛ і зменшення продуктів окисної деструкції білків. Узагальнення характеру змін, яких набувають досліджувані показники АПС двох видів за дії окремих металів та суміші, показує, що між ними немає узгодженості. Так, посилення пероксидації ліпідів може поєднуватися як із зменшенням, так і з збільшенням активності СОД. Властивості металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії фенолу. За даними хроматографії та спектральних характеристик, ТБ зябер коропа зазнають істотніших змін деструктивного характеру за дії фенолу, ніж печінки. Вміст міді у МТ-2 обох тканин коропа різко зменшується. Найсуттєвіші зміни вмісту цинку спостерігаються у термолабільних компонентах, причому у печінці відзначено його зменшення, а у зябрах – збільшення. Диференційний УФ-спектр МТ-2 зябер набуває ознак апоформи, як і за дії міді та цинку (r ?0,8; p<0,01). У рака за дії фенолу зростає вміст міді у гепатопанкреасі та його високомолекулярній фракції ТБ і зменшується вміст цинку та заліза у зябрах. Співвідношення об’ємів виходу МТ-1/МТ-2, особливо у зябрах, зростає за рахунок зменшення об’єму виходу МТ-2. У МТ-2 тканин рака зростає металозв’язуюча здатність в основному за рахунок неспецифічних редокс-активних металів – міді, марганцю та заліза. В УФ-спектрах ТБ тканин рака відзначені різнотипні зміни у ближньому ультрафіолеті. Ураження функції металотіонеїнів у коропа виражено значно більше, ніж у рака, що узгоджується із даними токсичних тестів щодо чутливості відповідних класів тварин до фенолу (De Graeve G. M. та ін., 1980). Посилення пероксидації ліпідів є спільною ознакою впливу фенолу на організм коропа та рака. При цьому величина ураження не узгоджується із специфічними відмінностями активності ферментів, метаболізму міді і цинку, характерними для цих двох видів. Вважають, що поділ металотіонеїнів на МТ-1 і МТ-2, який ґрунтується виключно на їх хроматографічній поведінці, не може бути вагомою підставою для встановлення їх структурної або функціональної гомології (Hamer D.H., 1985). Разом з тим, їх аналіз дозволив виявити такі закономірності впливу чужорідних речовин, які при дослідженні загальних металотіонеїнів виражені значно слабше (Столяр О.Б., 2004). Очевидно, диференційована відповідь молекулярних форм металотіонеїнів нівелюється при вивченні загальної фракції металотіонеїнів. Наші результати дозволяють зробити узагальнення про залежність відповіді організму на вплив іонів металів більшою мірою від філогенетичних особливостей ступеня досконалості регуляції гомеостазу міді і цинку за участю металотіонеїнів, ніж від природи чинника. Для металотіонеїнів коропа найбільш чутливим показником дії різних металів є здатність МТ-2 втрачати мідь узгоджено із зменшенням активності Cu,Zn-СОД за відносної стабільності цинк-зв’язуючої функції. Металотіонеїни рака підтримують стабільний вміст міді, проте мають здатність до гіперакумуляції цинку за дії різних чинників, що супроводжується збільшенням чутливості до оксидативного ураження. Проведене дослідження показало, що окремі форми металотіонеїнів, одержані хроматографічно, є чутливими біомаркерами впливу важких металів та фенолу на організм. Їх коректне використання потребує врахування здатності цих білків підтримувати гомеостаз певного металу, специфічного для цього виду тварин. Висновки Отримані результати доповнюють і розширюють уявлення про участь молекулярних форм металотіонеїнів коропа та рака вузькопалого у зв’язуванні металів за дії на організм іонів міді, цинку, марганцю, свинцю окремо та в суміші, а також фенолу. З’ясовано специфічний для кожного виду характер змін вмісту міді та цинку в цих формах, спільний для впливу більшості досліджених чинників. Показано наявність зв’язку між здатністю металотіонеїнів зв’язувати мідь та цинк та активністю ізоформ супероксиддисмутази, а також інтенсивністю пероксидації ліпідів у тканинах. Металотіонеїни з тканин коропа Cyprinus carpio L. і рака вузькопалого Astacus leptodactylus Eschscholtz при ІОХ на ДЕАЕ-целюлозі розподіляються на дві молекулярні форми МТ-1 та МТ-2. У коропа домінантною формою є МТ-2, а у рака – МТ-1. За складом металів металотіонеїни коропа належать до Zn-МТ, а МТ рака – до Zn,Cu-МТ. У коропа за окремої та сумісної дії на організм іонів міді, цинку, марганцю, свинцю (0,01, 0,1, 0,13 і 0,01 мг/л відповідно), а також фенолу (0,002 мг/л) протягом 14 діб спостерігається зменшення цинк- і мідь-зв’язуючої функції МТ-2 печінки (у середньому на 30% та 50% відповідно) і, особливо, зябер (у середньому на 80% та 60% відповідно). Відзначено, що зміни загального вмісту металів у тканинах у більшості випадків неузгоджені із такими в складі металотіонеїнів, причому, для цинку та міді відзначено антагоністичний характер змін. За дії на коропа іонів міді, цинку, марганцю, свинцю у концентраціях 0,2, 2,0 2,6 і 0,2 мг/л відповідно у печінці спостерігаються металоспецифічні зміни стану металотіонеїнів. У зябрах відбувається зменшення металозв’язуючої функції МТ-2 за впливу всіх досліджуваних чинників, крім цинку, за дії якого її змін не виявлено. У металотіонеїнах рака та в загальному у гепатопанкреасі вміст міді за дії всіх досліджуваних чинників залишається відносно стабільним або зростає. Спостерігається істотне зростання вмісту цинку у металотіонеїнах та у тканині. Селективність молекулярних форм металотіонеїнів по відношенню до акумуляції металів у рака не виявлена. Порівняння активності ізоформ СОД у коропа та рака показало, що у раків активність Cu,Zn-СОД вища, ніж у коропа, тоді як активність Mn-СОД у обох видів подібна. За дії всіх досліджуваних чинників активність Cu,Zn-СОД у коропа зменшується узгоджено із зменшенням вмісту міді у МТ-2. Активність Cu,Zn-СОД у рака та Mn-СОД у печінці коропа не зазнає змін за дії більшості досліджуваних чинників. Короп і рак істотно відрізняються за здатністю до прооксидантних змін у тканинах. У коропа з досліджуваних чинників лише дія міді у зябрах та фенолу в обох тканинах посилюють перекисне окиснення ліпідів, тоді як у рака такий вплив мають цинк, марганець, суміш металів та фенол. Спостерігається кореляція між змінами інтенсивності перекисного окиснення ліпідів та вмісту цинку у МТ-2 обох видів тварин (r = 0,84; р = 0,001). Зміни окисної деструкції ліпідів, білків та активності ізоформ СОД відбуваються неузгоджено. Практичні рекомендації На підставі узагальнення одержаних результатів рекомендуємо критерії для оцінки ступеня забруднення водного середовища важкими металами та фенолом: пригнічення функції хроматографічної форми МТ-2 та активності Cu,Zn-СОД у коропа як неспецифічні біомаркери забруднення водного середовища важкими металами та фенолом; посилення перекисного окиснення ліпідів у рака як неспецифічний біомаркер забруднення водного середовища; обчислення диференційних спектрів молекулярних форм металотіонеїнів як селективний і чутливий метод характеристики їх стану за впливу на організм іонів важких металів. Список публікацій за темою дисертації 1. Фальфушинська Г.І. Металотіонеїни прісноводних тварин як біомаркери забруднення водного середовища йонами важких металів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2004. – Вип. 35. – С. 84 – 88. 2. Фальфушинська Г.І., Столяр О.Б., Касянчук М.М. Металотіонеїни як біомаркери забруднення водного середовища йонами купруму та цинку // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія “Біологія”. – 2003. – №1 (20). – С. 94 – 97. (Дисертант брала участь у плануванні та постановці експерименту, написанні статті, особисто виділила металотіонеїни, провела їх реконструкцію та спектральний аналіз). 3. Аналіз металозв’язуючої здатності металотіонеїнів за їх УФ-спектрами / Фальфушинська Г.І., Демків І.Я., Столяр О.Б., Флекей П.П. // Медична хімія. – 2003. – Т. 5, № 4. – С. 39 – 41. (Дисертанту належить планування експерименту, участь у його виконанні та написанні статті). 4. Фальфушинська Г.І., Касянчук М.М., Столяр О.Б. Кумуляція міді, цинку, марганцю і свинцю в металотіонеїнах та інших клітинних компонентах тканин рака за забруднення ними водного середовища // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія “Біологія”. – 2003. – №3–4 (22). – С. 105 – 109. (Дисертант брала участь у плануванні та постановці експерименту, написанні статті, особисто виділила металотіонеїни, провела їх реконструкцію та спектральний аналіз). 5. Аналіз диференційних спектрів металотіонеїнів рака за дії на організм іонів важких металів / Фальфушинська Г.І., Столяр О.Б., Хоменчук В.О., Вахівська Н.Й., Меть О.І. // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія “Біологія”. – 2004. – №1–2 (23). – С. 102 – 103. (Дисертант брала участь у плануванні та постановці експерименту, написання статті, виділені металотіонеїнів, проведенні їх реконструкції та спектрального аналізу). 6. Фальфушинська Г.І., Столяр О.Б. Селективність відповіді молекулярних форм супероксиддисмутази та металотіонеїнів коропа на вплив фенолу // Біологія тварин. – 2004. – Т 6, №1-2. – С. 207 – 212. (Дисертанту належить участь у плануванні експерименту, особисто провела експериментальні дослідження). 7. Фальфушинська Г.І., Столяр О.Б., Галантюк С.І. Дослідження взаємодії металотіонеїнів коропа з фенолом // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія “Біологія”. – 2004. – №3–4 (24). – С. 103 – 106. (Дисертанту належить участь у плануванні та постановці експерименту, визначенні спектральних властивостей металотіонеїнів, участь в аналізі результатів, написанні статті). 8. Столяр О. Б., Фальфушинська Г. І., Арсан В. О. Металзв’язуюча функція металотіонеїнів та стан антиоксидантного захисту зябер коропа за забруднення води іонами важких металів // Доп. НАН України. – 2005. – №8. – С. 191 – 195. (Дисертанту належить участь у плануванні експерименту, особисто провела експериментальні дослідження, участь в аналізі результатів). 9. Stolyar O., Falfushynska H. The metallothioneins UV-spectra analysis as a tool for the estimation of the metals toxicity for freshwater animals // 41-th congress of the European Societies of Toxicology – Eurotox-2003. – Abstracts, Florence (Italy), September 28 - October 1, 2003. – P. 632. 10. The ability of the metallothioneins of the freshwater animals to form the “Hormesis”-type answer on the metals poisoning / Stolyar O., Grubinko V., Myhayliv R., Mishchuk O., Falfushynska H., Mudra A. // The Organizer Congress of Ukrainian society of cell biology. – Abstracts, Lviv 25-28 april 2004. – P. 46. 11. Фальфушинська Г., Демків І., Стoляр О. Селективність відповіді ізоформ металотіонеїнів та cупероксиддисмутази рака на збільшення вмісту іонів важких металів у воді // Установчий конгрес Українського товариства клітинної біології. – Тези доп., Львів, 25-28 квітня, 2004. – С. 77. 12. Оценка состояния антиоксидантной защиты пресноводных животных при действии на организмы смеси ионов тяжелых металлов / Фальфушинская Г.И., Мыхайлив Р.Л., Демкив И.Я., Мищук Е.В. // 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Тезисы конф., Пущино, 17-21 мая, 2004. – С. 55. 13. Столяр О.Б., Фальфушинская Г.И., Мудра А.Е. Влияние фенольного загрязнения воды на антиоксидантную защиту и функцию металлотионеинов тканей карпа // Международная научная конференция “Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов”, Тезисы конф. Петрозаводск, 6-9 сентября, 2004. – С. 132. 14. Фальфушинская Г.И., Мудра А.Е., Столяр О.Б. Селективность действия ионов тяжелых металлов на систему антиоксидантной защиты гепатопанкреаса рака узкопалого Astacus leptodactylus // VIII Международная научная экологическая конференция “Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем”, Тезисы конф. Белгород, 27-29 сентября, 2004.– С. 223 – 224. 15. Falfushynska H.I., Stolyar O.B. Copper-binding function of metallothioneins in carp tissues as non specific biomarker for water contamination // 42-th congress of the European Societies of Toxicology – Eurotox-2005. – Abstracts, Krakow (Poland), 11-14 September, 2005. – P. 22-13. Анотація Фальфушинська Г.І. Роль металотіонеїнів коропа (Cyprinus carpio L.) та рака (Astacus leptodactylus Eschscholtz) в адаптації організму до забруднення водного середовища. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2005. Дисертація присвячена дослідженню властивостей молекулярних форм металотіонеїнів тканин коропа та рака за дії на організм іонів важких металів, їх суміші та фенолу. Металотіонеїни досліджуваних видів відрізняються за співвідношенням об’ємів виходу МТ-1 і МТ-2, одержаних на етапі іонообмінної хроматографії, складом металів та спектральними властивостями. Залежно від філогенетичних особливостей, металотіонеїни формують різну відповідь до дії стресорних чинників: МТ-2 коропа втрачають мідь узгоджено із зменшенням активності Cu,Zn-СОД за відносної стабільності цинк-зв’язуючої функції, а металотіонеїни рака підтримують стабільний вміст міді, проте мають здатність до гіперакумуляції цинку. Дія свинцю в обох видів викликає найбільш істотне пригнічення функції металотіонеїнів. Відзначено кореляцію між змінами вмісту цинку в МТ-2 та інтенсивністю ПОЛ в тканинах тварин. Аналіз УФ-спектрів металотіонеїнів адекватно відображає функціональний стан цих білків. Ключові слова: короп, рак, мідь, цинк, марганець, свинець, фенол, молекулярні форми, металотіонеїни, антиоксидантний захист. Аннотация Фальфушинськая Г.И. Роль металлотионеинов карпа (Cyprinus carpio L.) и рака (Astacus leptodactylus Eschscholtz) в адаптации организма к загрязнению водной среды. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия, Институт биологии животных УААН, Львов, 2005. Диссертация посвящена исследованию свойств молекулярных форм металлотионеинов тканей карпа и рака при действии на организм ионов тяжелых металлов, их смеси и фенола. Металлотионеины исследованных видов отличаются по соотношению объемов выхода МТ-1 и МТ-2, полученных на этапе ионообменной хроматографии, составом металлов и спектральными свойствами. В зависимости от филогенетических особенностей, металлотионеины формируют различный ответ к действию стресорных факторов: МТ-2 карпа утрачивают медь согласовано с уменьшением активности Cu,Zn-СОД при относительной стабильности цинк-связывающей функции, а металлотионеины рака поддерживают стабильное содержание меди, но имеют способность к гипераккумуляции цинка. Действие свинца в обеих видов вызывает наиболее существенное угнетение функции металлотионеинов. Отмечено корреляцию между изменениями содержания цинка в МТ-2 и интенсивности ПОЛ в тканях организмов. Анализ УФ-спектров металлотионеинов адекватно отражает функциональное состояние этих белков. Ключевые слова: карп, рак, медь, цинк, марганец, свинец, фенол, молекулярные формы, металлотионеины, антиоксидантная защита. Summary Falfushynska H.I. The role of carp (Cyprinus carpio L.) and crayfish (Astacus leptodactylus Eschscholtz) metallothioneins in the adaptation of organism to water pollution. – Manuscript. Thesis for a candidate’s degree in the field of biological science in speciality 03.00.04 – biochemistry, Institute of animal biology UAAS, Lviv, 2005. The thesis is devoted to the investigation of metallothioneins’ molecular forms properties in carp and broad-fingered crayfish tissues under the heavy metals, its mix and phenol action on the organism. In the first time the higher sensitive of metallothioneins’ chromatographic molecular forms in difference from common fraction of these proteins have been shown. We have revealed the species’ specifically metallothioneins molecular forms pattern changes under the same pollutant action. The objective of the present study was to perform the comparative analysis of the effects of waterborne copper, zinc, manganese and lead ions or its mix in environmentally realistic concentrations (0.01, 0.1, 0.12 and 0.01 mg/l respectively) and phenol (0.002 mg/l) during 14 days on carp and crayfish metallothioneins properties. Metallothioneins -contained fraction of both organisms after gel-filtration of the thermostable solution, has apparent molecular masses of 7 kDa, characteristic spectral features – high level of absorption in the middle UV, indicative the presence of characteristic metals-thiolate clusters, forms apothioneins after incubation with EDTA and was shown to comprises of two distinct proteins under the anion-exchange chromatography. The comparison of the metallothioneins of carp’s and crayfish’s tissues shows the difference of the ratio of MT-1/MT-2: 0.6 and 1.8 respectively. The contents Zn:Cu in carp metallothioneins were 10:1, except liver MT-2 (4:1), and in crayfish near 2:1. According to metals content carp’s metallothioneins reveale to be Zn-MT, thus crayfish’s – Zn,Cu-MT. The characteristic features of UV-spectra are optimally expressed in MT-2 of both organisms. Under the experimental condition the elution profile of carp metallothioneins has been changed, but in crayfish’s – in most cases is close to control value. In carp the metal treatment provoked the significant decrease of MT-2 value, especially in presence of higher concentration of toxicants. The differences in mainly metals binding to metallothioneins among species were observed. Under the effect of investigated causes in the carp’s metallothioneins, especially in MT-2, the copper content is sharply reduced accordingly to decrease of Cu,Zn-SOD activity. Among the isoproteins the role of MT-1 in metals binding is increased, except lead action, but participation of main fraction – MT-2 is significantly decreased. In crayfish’s metallothioneins the copper content maintains at the rather stable level except mixed-metal action, than it is enhanced, but zinc content is significantly elevated, particularly after manganese effect, in correlation with the activation of lipid peroxidation in the tissue. The differential UV-spectra adequately indicate the functional changes of metallothioneins. The hyperchromic effect in the middle UV was accompanied with the rose of metals content in metallothioneins. The hypochromic effect in the middle UV (as apothionein’s UV-spectra) was associated with the remove of metals from proteins. The metallothioneins’ behaviour seems to be a function of their evolutionary state more than effected metal’s kind. The greatest differences among species’ MTs were observed in its copper binding capacity. They be explained on the specificity of copper metabolic function in these species. The lead action provokes general for both species oppression of metallothioneins’ function. The ecologically realistic concentrations of toxicants are the most appropriate for metallothioneins as biomarkers of stress. Key words: carp, crayfish, copper, zinc, manganese, lead, phenol, molecular forms, metallothioneins, antioxidant defence.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *