Роль чутливості мітохондріальної пори до індукторів її відкриття та експресії bax в розвитку функціональних змін серця при старінні (автореферат)

Національна Академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

РУДИК ОЛена володимирівна

УДК 612.13+ [612.17+576.311.347] (591.139)

Роль чутливості мітохондріальної пори до індукторів її відкриття та
експресії bax в розвитку функціональних змін серця при старінні

03.00.13 – Фізіологія людини та тварин

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології кровообігу

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України, доктор медичних наук, професор

Сагач Вадим Федорович,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Завідувач відділом фізіології кровообігу

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор кафедри біохімії

Матишевська Ольга Павлівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Доктор медичних наук, завідувач відділом гіпоксичних станів

Маньковська Ірина Микитівна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа : Науково-дослідний Інститут геронтології АМН

України

Захист відбудеться “16” травня 2006 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.
Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024 , м. Київ, вул.
Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “13” квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За даними ВООЗ на сьогодні серед людей похилого віку
спостерігаються ускладнення перебігу хвороб серцево-судинної системи
[Lee et al., 1995], що часто призводить до розвитку інших залежних від
віку патологічних станів. В роботах Фролькіса [Frolkis et al., 1991] та
інших [Headrick et al., 2003; Lesnefski et al., 1994] продемонстровано,
що старіння супроводжується зниженням властивої міокарду резистентності
до ішемічно-реперфузійних ушкоджень. Причини втрати подібної
толерантності серцевим м’язом до ішемії на сьогодні є недостатньо
зрозумілими. Донедавна найбільш обґрунтованою й послідовною у
трактуванні залежних від віку змін організму вважалась вільнорадикальна
теорія, згідно якої основним ушкоджуючим фактором клітинних змін при
старінні є генеровані мітохондріями вільні радикали [Harman, 1962].
Протягом останнього десятиріччя основні положення цієї теорії суттєво
доповнені. З’ясовано, що дисбаланс між продукцією активних форм кисню та
азоту і антиоксидантними системами захисту клітини призводить до
хронічного оксидативного стресу [Лю, 2001], що спостерігається при
старінні. Сформульовано „кальцієву гіпотезу старіння”, згідно якої в
основі важливих проявів цього фізіологічного процесу є зміни кальцієвого
гомеостазу в результаті порушення функціонування одного з кальцієвих
депо – мітохондрій [Костюк та ін., 2005].

Останніми дослідженнями доведено, що зміна проникності внутрішньої
мембрани мітохондрій, пов’язана з відкриттям мітохондріальної пори (МП)
(mitochondrial permeability transition pore, MPTP) – мультибілкового
мегаканалу неспецифічної проникності – відіграє ключову роль у
порушеннях різних клітинних функцій [Crompton et al., 2002]. Відомо, що
індукція МП є однією з ланок патогенезу таких станів, як
ішемічно-реперфузійні ушкодження серця та мозку, діабет, хвороба
Паркінсона тощо [Duchen, 2004]. Серед причин розвитку МП-залежної
мітохондріальної дисфункції розрізняють: оксидативний стрес,
навантаження кальцієм, порушення біосинтезу оксиду азоту (NO),
виснаження енергетичних запасів клітини тощо. Важливим фактором впливу
на індукцію МП є проапоптотичний білок сімейства Bcl-2 Вах. Ряд
експериментальних робіт вказує на те, що Вах може спричиняти клітинну
смерть шляхом транслокації з цитозолю в мітохондрії [Capano et al.,
2006] і/або подальшої його взаємодії з компонентами МП [Borner, 2003].

На сьогодні недостатньо дослідженим залишилось питання про зміни
чутливості МП до її індукторів з віком, а також молекулярні механізми
залежних від віку клітинних змін, пов’язаних із функціонуванням
мітохондрій серця, як можливих причин втрати міокардом стійкості до
ішемії при старінні. З іншого боку, ведеться пошук нетоксичних речовин з
потенційно інгібуючим щодо появи МП ефектом. Дослідження впливу,
зокрема, антиоксидантів, являє значний інтерес для корекції залежних від
віку функціональних змін серця. Такий інтерес обумовлений тим, що деякі
геропротектори з антиоксидантною дією, зокрема, гормон епіфізу
мелатонін, можуть, ймовірно, виступати і у ролі прямих інгібіторів
відкриття МП [Andrabi et al., 2004]. Недостатньо вивченим у
попередженні залежних від віку функціональних змін мітохондрій є також
явище гіпоксичного прекондиціонування, яке широко використовують для
комплексної адаптивної перебудови організму та поліпшення стану,
зокрема, серцево-судинної системи у хворих різного віку [Колчинская и
др., 2003].

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової програми Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАНУ
„Вивчення ролі ендотеліальних факторів та вільних радикалів кисню в
реактивності серцево-судинної системи”, № 0103U003285 і “Дослідження
молекулярних механізмів – проявів функціонування геному, що зумовлюють
специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та
патології”, № 0102U002472.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у з’ясуванні залежної
від віку чутливості мітохондрій до індукторів відкриття МП, ролі МП у
розвитку постішемічних реперфузійних змін серця при старінні, а також
пошуку можливих шляхів попередження появи МП. Для досягнення мети були
поставлені наступні завдання:

В експериментах на ізольованому серці дослідити зміни його скоротливої
функції, відкриття МП та експресію мРНК bax в дорослих і старих щурів за
умов ішемії-реперфузії. Провести аналіз впливу перфузії мелатоніном на
відкриття МП та відновлення скоротливої функції серця у відповідь на
ішемію-реперфузію у тварин різного віку.

В дослідах на ізольованих мітохондріях серця дорослих і старих щурів
дослідити чутливість МП до індукторів: Са2+, феніларсиноксиду (ФАО) та
тертбутилгідропероксиду (t-BuOOH). Дослідити роль NO в зміні проникності
мітохондріальних мембран при старінні. Визначити вміст пероксиду водню,
супероксидного радикала та дієнових кон’югатів в мітохондріях серця
дорослих і старих щурів.

Дослідити в умовах in vitro на ізольованих мітохондріях серця щурів та в
культурі клітин фібробластів людини дію мелатоніна щодо утворення МП за
умов моделювання оксидативного стресу.

Проаналізувати показники скоротливої функції серця за умов
ішемії-реперфузії, чутливість МП до Са2+ і ФАО, експресію мРНК bax в
серці, вміст пероксиду водню, супероксидного радикала, дієнових
кон’югатів та активність NO-синтаз (NOS) в мітохондріях серця старих
щурів після курсового введення їм мелатоніна.

Дослідити відкриття МП під дією ФАО, експресію мРНК bax, вміст пероксиду
водню, супероксидного та гідроксильного радикалів в серці старих щурів
після інтервальних гіпоксичних тренувань (ІГТ).

Об’єкт дослідження: Ізольоване серце дорослих (5-6 міс.) і старих (24-27
міс.) щурів. Ізольовані мітохондрії серця дорослих і старих щурів.
Культура клітин фібробластів людини.

Предмет дослідження: Параметри кардіодинаміки, експресія мРНК, індукція
та інгібування мітохондріальної пори.

Методи дослідження: фізіологічні – перфузія ізольованого серця за
методом Лангендорфа; біофізичні – спектрофотометричні дослідження
набухання мітохондрій/реєстрації мітохондріального фактора, конфокальна
мікроскопія; біохімічні – визначення вмісту показників вільнорадикальних
процесів та активності NO-синтаз; молекулярно-генетичні – полімеразна
ланцюгова реакція у варіанті зворотної транскрипції.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані нові дані про залежну
від віку зміну чутливості мітохондрій до індукторів відкриття МП та роль
МП в розвитку змін функції серця при старінні. Продемонстровано, що
пригнічення скоротливої функції серця з віком супроводжується
збільшенням проникності мітохондріальних мембран клітин міокарду. Вперше
виявлено, що мітохондрії серця старих тварин характеризуються підвищеною
чутливістю до таких індукторів відкриття МП як Са2+, ФАО та t-Вuooh.
Вперше встановлено, що підвищення чутливості МП до Са2+ відбувається за
рахунок зниження активності NOS в мітохондріях серця старих щурів.
Показано, що при старінні в серці спостерігається посилена експресія
мРНК проапоптотичного білка bax.

Вперше на ізольованих мітохондріях серця щурів різного віку та в
культурі клітин фібробластів людини показано, що мелатонін попереджає
відкриття МП за умов оксидативного стресу. Встановлено, що курсове
введення старим щурам мелатоніна виявляє коригуючу щодо відновлення
скоротливої функції серця дію; зменшує вміст супероксидного радикалу та
дієнових кон’югатів; пригнічує чутливість МП до Са2+ та ФАО; знижує
базальний рівень експресії мРНК bax. Вперше продемонстровано, що
внаслідок проведення ІГТ старих щурів знижується чутливість МП до ФАО та
зменшується вміст пероксиду водню і гідроксильного радикала в серці.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані в даній роботі
результати мають цінне теоретичне значення. Розкриття одного з
механізмів втрати толерантності міокардом до ішемії при старінні, а
саме, обумовленого індукцією неспецифічної проникності мітохондріальних
мембран, в певній мірі доповнює вільнорадикальну теорію старіння.

Важливе практичне значення мають отримані в роботі експериментальні
результати щодо ролі гормону епіфіза, антиоксиданта мелатоніна в
корекції роботи серця старих щурів. Ці результати створюють підґрунтя
для розширення області застосування даного препарату у геронтологічній
практиці. Використані в роботі методичні підходи щодо реєстрації МП
можуть бути враховані при розробці лікарських препаратів з
кардіопротекторною дією.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук,
проведено експериментальні дослідження, аналіз та обробка отриманих
результатів, сформульовано висновки роботи. Дослідження по визначенню
вмісту вільних радикалів і активності NOS проводили за участі ст.н.с.
Інституту біохімії НАНУ, к.б.н. А.В. Коцюруби. Експерименти на
конфокальному мікроскопі проводились автором на кафедрі біофізики
факультету біотехнології Ягелонського університету, в лаб. д-ра Єжи
Добруцького.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були
представлені на конференції, присвяченій 30-річчю Інституту молекулярної
біології та генетики НАНУ (Київ, 2003); на Третій Всеросійській з
міжнародною участю школі-конференції по фізіології кровообігу (Москва,
2004); на Workshop in cardiovascular physiology “Signal transduction in
cardio-vascular system” (Варшава, 2004); на IV національному Конгресі
патофізіологів України (Чернівці, 2004); на VI і VII наукових
конференціях „Актуальні проблеми старіння” (Київ, 2005 і 2006); на
Всеросійській з міжнародною участю конференції „Експертні системи
інтегральної оцінки стану організму здорових і хворих” (Нальчик, 2005);
на 25-th Annual Scientific Sessions, European Section of the
International Society for Heart Research (Тромсо, 2005); на 4-th
Conference on Mitochondrial Physiology – MiP2005 (Шрьокен, 2005); на IV
Всеросійській з міжнародною участю конференції „Механізми функціонування
вісцеральних систем” (Санкт-Петербург, 2005); на HYPERLINK
«http://www.biph.kiev.ua/forum/viewtopic.php?p=498» міжнародній
школі-конференції „Системная биология и биоинженерия ” (Звенігород,
2005); на HYPERLINK «http://physinst.web.med.uni-muenchen.de/dpg06/»
Joint Meeting of The German Society of Physiology and The Federation of
European Physiological Societies (Мюнхен, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 15 роботах, з
яких 5 – статті у наукових фахових виданнях, 10 – тези доповідей на
наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі списку скорочень,
вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів
дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних
джерел з 234 найменувань. Роботу викладено на 156 сторінках та
ілюстровано 39 рисунками і 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ роботи

Матеріал та методи досліджень

Досліди проводили на дорослих і старих щурах-самцях лінії Вістар з
дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами.

Реєстрація показників скоротливої функції ізольованого серця. Тварин
наркотизували за допомогою уретану (120 мг/кг). Серце, вилучене шляхом
розтину грудної порожнини, перфузували ретроградно за методом
Лангендорфа розчином Кребса-Хензеляйта (t=370C; pH 7,4), насиченим
карбогеном (95%О2 і 5%СО2), при постійному перфузійному тиску. Після
стабілізації серця (20хв) проводили ішемію на 30хв шляхом повного
перекривання перфузійного потоку з наступною реперфузією впродовж 40хв.
Про стан скоротливої функції міокарду судили за зміною значень тиску, що
розвиває лівий шлуночок (ТРЛШ), максимальної швидкості його приросту та
спаду (dP/dtmax i dP/dtmin). Для порівняння значень обох вікових груп
зміну ТРЛШ, dP/dtmax і dP/dtmin, які реєстрували в мм рт.ст і мм
рт.ст.хсек-1 відповідно, виражали у відсотках. Коронарний потік
вимірювали за об’ємом розчину, що відтікає від ізольованого серця за
1хв.

Реєстрація відкриття МП в ізольованому серці. Для відбору проб для
спектрофотометричного аналізу відвідний силіконовий катетер поміщали в
надсічений легеневий стовбур. Мітохондріальний фактор, який, як було
показано [Сагач та ін., 2003], може слугувати маркером відкриття МП,
реєстрували спектрофотометрично (л=230-260 нм) у перфузійному розчині,
що відтікав від серця, до і після ішемії протягом 1-3, 5, 10 і 20-ої хв
реперфузії. Величину МФ оцінювали за показником різниці між значенням
його оптичної густини при л=245 і 235 нм.

Дослідження відкриття МП в ізольованих мітохондріях. Мітохондрії
виділяли методом диференційного центрифугування, як описано [Костерін та
ін., 1995], в нашій модифікації. Вміст білка в суспензії мітохондрій
визначали за методом Лоурі [Lowry et al., 1951]. Для дослідження
відкриття МП за допомогою реєстрації набухання мітохондрій останні
(0,5мг/мл) поміщали в інкубаційне середовище ізотонічного складу (рН
7,4) і за допомогою спектрофотометра реєстрували зниження величини
оптичної густини суспензії мітохондрій при л=520 нм за 5хв до і через
15хв після їх набухання за умов дії індукторів. В якості контролю
використовували суспензію нативних мітохондрій в інкубаційному
середовищі за відсутності індукторів із реєстрацією величини оптичної
густини протягом 20хв. МП індукували водним розчином СаСl2 чи розчинами
ФАО (Sigma), t-BuOOH (Fluka). Зміни оптичної густини мітохондрій на
20-ій хвилині набухання після дії на них індукторів МП виражали в Д%
відносно величини оптичної густини на 1-ій хвилині набухання.

Для дослідження відкриття МП за допомогою реєстрації вивільнення МФ з
мітохондрій в інкубаційне середовище (pH 7,2) вводили розчини СаСl2 і
ФАО, дія яких тривала 10хв, після чого мітохондрії центрифугували при
11000хg протягом 20хв. В надосадовій вимірювали оптичну густину в
діапазоні л=230–260 нм. Для підтвердження того, що і набухання
мітохондрій, і вивільнення МФ відбуваються внаслідок відкриття МП, пробу
перед додаванням відповідного індуктора додатково інкубували протягом
5-10 хв з класичним інгібітором відкриття МП – циклоспорином А (ЦсА,
Fluka) (10-5 моль/л), а також – в окремій серії – з мелатоніном (Sigma)
(10-5 моль/л).

Визначення експресії мРНК bax в серці щурів. РНК виділяли з міокарду
щурів методом кислої фенольної екстракції за допомогою комерційної
тест-системи “РИБО-золь” (ЦНДІ епідеміології, Росія). Зворотну
транскрипцію проводили, використовуючи фермент M-MLV-ревертазу та
випадкові гексануклеотиди з набору реагентів “РЕВЕРТА-R-100”.
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили з використанням комерційної
тест-систем “АмпліСенс-200-1” та олігонуклеотидних праймерів (смисловий
5’ – GTT TCA TCC AGG ATC GAG CAG – 3’ і антисмисловий 5’ – CAT CTT CTT
CCA GAT GGT GA – 3’) за описаною методикою [Shimizu et al., 1999] на
термоциклері “АМПЛИКОН-24”. Про зміни рівня експресії судили за зміною
інтенсивності флуоресценції смуг на електрофореграмах, отриманих за
допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі, забарвленому бромистим
етидієм. Візуалізацію та обробку даних проводили за допомогою відео-тест
системи (“VITRAN”, Росія).

Дослідження мітохондріального мембранного потенціалу. Культивовані
клітини фібробластів людини MSU 1.1 навантажували протягом 45хв
флуоресцентним мітохондріальним потенціометричним барвником,
тетраметилродаміновим етиловим естером (10-7 моль/л) (ТМРЕ, Molecular
Probes). На лазерному скануючому конфокальному флуоресцентному
мікроскопі Bio-Rad MRC 1024 досліджували ефект ЦсА та мелатоніна на
t-BuOOH-індуковані, залежні від мітохондріального мембранного потенціалу
(Дшm), зміни загальної інтенсивності флуоресценції ТМРЕ.

Визначення показників вільнорадикальних процесів та активності
NO-синтаз. В гомогенаті тканин та мітохондріях серця щурів визначали
вміст пероксиду водню (Н2О2) [Huwiler et al,, 1984], супероксидного
радикала (О2??) [Kuthan et al., 1982], гідроксильного радикала (·ОН)
[Conte et al., 1996], дієнових кон’югатів (ДК) [Гаврилов и др., 1988] та
активність NO-синтаз [Moncada et al., 1991] за допомогою стандартних
біохімічних методик.

Результати досліджень

Дослідження змін скоротливої функції серця, відкриття МП і експресії
мРНК bax за умов ішемії-реперфузії у дорослих і старих щурів. В
експериментах на ізольованому серці виявлено, що 40-хвилинна реперфузія
після 30-хвилинної ішемії серця дорослих і старих щурів призводить до
загального пригнічення показників скоротливої функції серця: зниження
ТРЛШ, dP/dtmax, dP/dtmin і величини коронарного потоку. Однак у старих
тварин ці зміни є більш вираженими, ніж у дорослих. Зокрема, ТРЛШ в
серці старих щурів достовірно відрізнявся від такого дорослих тварин
протягом усіх часових проміжків періоду реперфузії (рис.1, А).

Зміни значень dP/dtmax і dP/dtmin при реперфузії ізольованого серця
старих щурів мали тенденцію до більш вираженого зниження у порівнянні з
дорослими тваринами, однак достовірні відмінності спостерігались лише на
початку реперфузійного періоду. Зокрема, зміна dP/dtmax на 5-ій хв
реперфузії ізольованого серця становила 55±7% відносно вихідного рівня
для дорослих і до 24±9% для старих щурів, що достовірно менше такої у
дорослих тварин (Рис.1, Б). Значення dP/dtmin на 5-ій хв реперфузії
ізольованого серця дорослих щурів становило 48±8%, в той час як в старих
тварин такий показник був майже вдвічі менший і становив лише 23±8%
відносно вихідного рівня (див. рис.1, Б). Встановлено, що реперфузія
після ішемії серця дорослих щурів призводить до відкриття МП, свідченням
чого була поява у перфузаті, що відтікав від серця, МФ, який
реєструвався протягом 10хв з максимумом на 3-ій хв реперфузії (рис.1,
В). Так, величина абсолютного значення різниці оптичної густини проби МФ
при л=245 і 235 нм на 3-ій хв реперфузії ізольованого серця дорослих
щурів становила 0,06±0,02, натомість для старих щурів таке значення
зменшувалось майже в 9 разів, у порівнянні з таким у дорослих і
становило 0,007±0,004. Величина МФ в сироватці крові старих щурів
(0,19±0,04, n=8) перевищувала таку для дорослих майже вдвічі (0,1±0,01,
n=11).

Аналіз експресії Bax показав, що в серці дорослих щурів мРНК bax до
ішемії експресується незначним чином, рівень його експресії збільшується
в процесі реперфузії (Рис. 2 А, В). Натомість, в серці старих щурів
вихідний рівень експресії мРНК bax, тобто до ішемії, значно підвищений,
ніж у серці дорослих тварин, і залишається таким протягом всього періоду
реперфузії (Рис. 2 Б, В).

Вивчення впливу перфузії мелатоніном на скоротливу функцію серця щурів
та відкриття МП при ішемії-реперфузії. Попередня перфузія мелатоніном
(2х10-5 моль/л; 15хв) до початку ішемії сприяла більш ефективному
відновленню ТРЛШ і dP/dt при реперфузії ізольованого серця щурів різного
віку. Так, зміна ТРЛШ на 40-ій хвилині реперфузії ізольованого серця
після перфузії мелатоніном становила 73±5% і 76±6% відносно вихідного
рівня, в той час як такий показник для контрольних тварин становив 61±4%
і 44±6% для дорослих і старих щурів відповідно (рис. 3, А, Б). Зміни
dP/dtmax на 40-ій хвилині реперфузії серця, попередньо перфузованого
мелатоніном, становили 79±6% і 90±6% відносно вихідного рівня, на
відміну від серця, яке не перфузували препаратом, і для якого цей
показник становив всього 54±6% і 50±11% для дорослих і старих щурів
відповідно (рис.3, В, Г). Зміна dP/dtmin ізольованого серця дорослих
щурів після попередньої перфузії мелатоніном на 40-ій хвилині реперфузії
у 1,7 разів перевищувала контрольне значення (48±8%) і становила 81±5%
відносно вихідного рівня. Аналогічно, зміна dP/dtmin на 40-ій хвилині
реперфузії серця старих щурів після попередньої перфузії мелатоніном,
становила 89±8%, в той час як для контрольних тварин dP/dtmin – лише
43±9% відносно вихідного рівня (Рис.3, В, Г). Показано, що за
попередньої перфузії мелатоніном ізольованого серця дорослих щурів вміст
МФ у відтікаючому від серця розчині за умов ішемії-реперфузії значно
знижувався.

Дослідження чутливості ізольованих мітохондрій серця дорослих і старих
щурів до індукторів МП. З огляду на те, що втрата серцем стійкості до
ішемії при старінні може бути обумовлена порушенням проникності мембран
мітохондрій, логічно було на наступному етапі з’ясувати, чи існують
відмінності у чутливості ізольованих мітохондрій серця дорослих і старих
щурів до різних індукторів МП. Раніше нами було встановлено, що
вивільнення МФ корелює зі ступенем набухання мітохондрій серця щурів за
однієї й тієї ж концентрації індуктора відкриття МП [Сагач та ін.,
2003]. Таким чином, обидва параметри можна використовувати для оцінки
неспецифічної проникності мітохондріальних мембран і чутливості
мітохондрій до різних індукторів МП.

Нами встановлено, що Са2+ (10-7-10-3 моль/л) спричиняє дозозалежне
набухання мітохондрій серця дорослих і старих щурів з максимумом його
дії в концентрації 10-4 моль/л. При цьому, величина набухання
мітохондрій серця старих щурів у 1,5-2 рази перевищувала таку для
мітохондрій серця дорослих тварин (рис.4, А). Показано, що концентрація
Са2+, за якої відбувалося вивільнення фактора з мітохондрій серця старих
щурів, була на два порядки меншою, порівняно з дорослими тваринами, і
становила 10-4 моль/л для дорослих і 10-6 моль/л для старих тварин. У
всіх випадках попередня інкубація мітохондрій з ЦсА за умов дії Са2+
(10-4 моль/л) попереджала їх набухання і вивільнення МФ, що є прямим
доказом причетності МП до цих двох процесів. Таким чином, мітохондрії
серця старих щурів потребують меншого навантаження кальцієм для
Са2+-індукованого вивільнення МФ, і, відповідно, є більш чутливими до
даного індуктора МП.

В експериментах з використанням індуктора МП модифікатора
сульфгідрильних груп ФАО (10-7-10-4моль/л) спостерігали дозозалежне
набухання мітохондрій. Відмінність полягала у величині набухання
мітохондрій серця старих щурів порівняно з такою для дорослих тварин
(Рис.4, Б). Показано, що максимальне вивільнення МФ з мітохондрій серця
дорослих тварин спостерігалося при дії ФАО в концентрації 10-5 моль/л
(лmax=240-245нм) (Рис. 5, А). Однак, при дії ФАО спектр поглинання
вивільнення МФ із серця старих щурів характеризувався не одним, а двома
максимумами при двох довжинах хвиль: лmax=230 нм (І-ий пік) та
лmax=240-245 нм (ІІ-ий пік) (Рис.5, Б). З одного боку, ефект ФАО
спостерігали вже при концентрації 10-7 моль/л, що може говорити про
підвищення чутливості МП до ФАО в серці старих щурів. З іншого –
відсутність чіткого дозозалежного впливу ФАО на вивільнення фактора з
мітохондрій серця старих щурів теж може свідчити про порушення бар’єрних
властивостей мітохондріальних мембран при старінні. Останнє спостерігали
навіть у відсутності індукторів відкриття МП, що супроводжувалось певною
мірою вивільненням з мітохондрій МФ. Встановлено, що ЦсА практично
повністю попереджав вивільнення другої (ІІ-ий пік, лmax=240-245нм), але
не першої (І-ий пік, лmax=230нм) компоненти спектру поглинання
ФАО-індукованого вивільнення МФ із серця старих щурів. Ці результати
узгоджуються з висновком про часткове інгібування ЦсА ФАО-індукованого
набухання мітохондрій серця старих щурів, що спостерігали, і можуть
свідчити про те, що в мітохондріях серця старих тварин поряд з
утворенням класичної МП має місце індукція неспецифічної, ЦсА-нечутливої
проникності.

Органічний пероксид t-BuOOH вважається модифікатором сульфгідрильних
груп безпосередньо транслокази аденінових нуклеотидів – одного з білків,
що формують МП з внутрішньої мітохондріальної мембрани [Zoratti et al.,
2005]. Нами встановлено дозозалежний ефект дії t-BuOOH (10-7-10-4
моль/л) на набухання мітохондрій серця щурів (Рис.4, В). Максимум дії
t-BuOOH спостерігався при концентрації 10-4 моль/л для дорослих і 10-5
моль/л для старих щурів. Це вказує на підвищену чутливість МП до дії
цього індуктора в серці старих щурів, на відміну від дорослих, і ще раз
підтверджує попередньо висунуте нами припущення щодо особливостей
пороутворення в мітохондріях серця щурів з віком.

Дослідження показників вільнорадикальних процесів в серці дорослих і
старих щурів. Знайдено, що в серці як дорослих, так і старих щурів вміст
О2?? в мітохондріях значно перевищує такий в гомогенаті міокарду як за
фізіологічних умов, так і при старінні. Однак в мітохондріях серця
старих щурів вміст О2?? становить 137,2±18,4 нмоль/хв*мг білка, що майже
втричі перевищує такий в мітохондріях серця дорослих тварин (47,1±7,5
нмоль/хв*мг білка). Вміст Н2О2 в гомогенаті і мітохондріях серця старих
щурів приблизно однаковий і становить 23,75±3,93 і 24,03±2,66 пмоль/мг
білка відповідно, що достовірно перевищує вміст Н2О2 в гомогенаті
(4,38±0,5 пмоль/мг білка) і мітохондріях серця дорослих щурів (12,16±1,6
пмоль/мг білка). Вміст ДК в гомогенаті та мітохондріях дорослих щурів
становить 3,26±0,49 і 3,6±0,25 нг/мг білка відповідно. Вміст ДК
достовірно підвищується в гомогенаті (17,71±2,83 нг/мг білка) і
мітохондріях (38,12±2,55 нг/мг білка) серця старих тварин, що свідчить
про посилення процесів ПОЛ з віком. Зроблено висновок про інтенсифікацію
в серці щурів з віком вільнорадикальних процесів за рахунок збільшення
вмісту супероксидного радикалу та пероксиду водню, а також одного з
проміжних продуктів ПОЛ – дієнових кон’югатів – в мітохондріях серця
старих щурів.

R

T

V

////o//ee//////////////////

R

T

Z

v

x

z

?

°

„ ?

@

D

¬

???????D

¬

??????????????????l?Ѓ??

„?`„?

> збільшувала величину набухання мітохондрій серця дорослих і старих
щурів при використанні Са2+ не лише в концентрації 10-4 моль/л, але й в
діапазоні концентрацій 10-7-10-3 моль/л. Введення в інкубаційне
середовище донора NO нітропрусиду натрію (10-4 моль/л) після додавання
L-NAME відновлювало типове Са2+-індуковане набухання мітохондрій серця
дорослих і старих щурів. Експериментальні результати, отримані на
ізольованих мітохондріях, були підтверджені біохімічними дослідженнями з
визначення активності сNOS та iNOS. Знайдено, що активність iNOS
незначним чином підвищується в мітохондріях серця старих щурів і
становить 2,58±0,33 нмоль/хв*мг білка, у порівнянні з дорослими –
1,73±0,24 нмоль/хв*мг білка. В той час як активність сNOS достовірно
знижується в мітохондріях серця старих щурів у порівнянні з дорослими і
становить 3,64±0,27 і 1,84±0,26 пмоль/хв*мг білка відповідно. Отже,
збільшення чутливості відкриття МП до Са2+ відбувається, ймовірно, за
рахунок зменшення вироблення NO мітохондріальною ізоформою NOS, яка,
згідно даних літератури, є сNOS [Brookes, 2004].

Дослідженя впливу in vitro мелатоніна на утворення МП. Однією з
ключових ланок процесу фізіологічного старіння організму є накопичення
та тривала токсична дія вільних радикалів, які в свою чергу є
індукторами відкриття МП. Антиоксидант мелатонін є менш токсичним у
порівнянні з імуносупресантом ЦсА. На ізольованих мітохондріях серця
старих щурів нами встановлено, що попередня обробка in vitro суспензії
мітохондрій розчином мелатоніна (10-5 моль/л) за умов моделювання
оксидативного стресу за допомогою ФАО зменшувала на 60% величину
ФАО-індукованого набухання мітохондрій серця старих щурів порівняно з
такою за відсутності мелатоніна. Показано, що ЦсА-чутливий пік спектра
поглинання вивільнення МФ з мітохондрій серця старих щурів, також
попереджався мелатоніном. Однак, на відміну від ЦсА, преінкубація
мітохондрій з мелатоніном попереджала появу не лише ІІ-го, але і І-го
піка спектра поглинання ФАО-індукованого вивільнення МФ, що свідчить про
його виражений захисний ефект щодо мітохондрій серця старих щурів.
Преінкубація з мелатоніном (10-5 моль/л) також виявляла захисну дію щодо
t-BuOOH-індукованого набухання мітохондрій серця дорослих і старих
щурів.

В дослідах з використанням конфокальної скануючої лазерної мікроскопії
показано, що моделювання in vitro оксидативного стресу на фібробластах
людини MSU 1.1 з додаванням t-BuOOH (5х10-3 моль/л) призводило до
достовірного, у порівнянні з контролем, зниження протягом 30хв
інтенсивності флуоресценції флуоресцентного барвника ТМРЕ (на
53,8%±3,6%), спричинене колапсуванням Дшm в більшості мітохондрій.
Показано, що преінкубація клітин з ЦсА або мелатоніном попереджала
t-BuOOH-індуковане розсіювання Дшm в середньому на 30% і 28% відповідно.

Вивчення скоротливої функції серця за умов ішемії-реперфузії,
чутливості МП, експресії мРНК bax та показників вільнорадикальних
процесів в серці старих щурів після курсового введення їм мелатоніна.
Курсове протягом 14 днів введення старим щурам мелатоніна (1,5 мг/кг)
виявило коригуючий ефект щодо відновлення значень ТРЛШ, dP/dtmax і
dP/dtmin та коронарного потоку при реперфузії ізольованого серця після
його ішемії. Величина Са2+-індукованого (10-4 моль/л) набухання
мітохондрій серця старих щурів після курсу мелатоніна зменшувалася майже
вдвічі, у порівнянні з такою контрольних старих тварин, яким не вводили
мелатонін, і наближалася до такої серця дорослих тварин. Крім того, у
старих щурів, яким вводили мелатонін, спостерігали зменшення величини
ФАО-індукованого набухання мітохондрій серця, не менше, як на 1-2
порядки. ЦсА повністю інгібував ФАО-індуковане набухання мітохондрій
серця старих щурів після курсового введення їм мелатоніна. Цього не
спостерігали в мітохондріях серця контрольних старих тварин, для яких
характерне часткове інгібування ЦсА ФАО-індукованого відкриття МП. Крім
того, курсове введення мелатоніна зменшувало базальний рівень експресії
мРНК bax в серці старих щурів (Рис.6).

Встановлено, що вміст О2?? в мітохондріях серця старих щурів після
курсового введення їм мелатоніна достовірно зменшувався (57,0±6,8
нмоль/хв*мг білка), порівняно з контролем (137,2±18,5 нмоль/хв*мг білка)
(p?0,01). Крім того, вміст ДК достовірно зменшувався в мітохондріях
серця старих щурів після курсового введення їм мелатоніна і становив
лише 13,75±1,82 нг/мг білка, в той час як для старих тварин цей показник
становив 38,2±2,55 нг/мг білка. Величина активності сNOS в мітохондріях
серця старих щурів після курсу мелатоніна становила 6,47±0,42
пмоль/хв*мг білка, у порівнянні з таким показником для мітохондрій серця
старих щурів – 1,84±0,26 пмоль/хв*мг білка. Це майже вдвічі перевищує
величину активності с-NOS в мітохондріях серця дорослих щурів. Зміни
активності іNOS в мітохондріях серця старих щурів після курсового
введення їм мелатоніна не були достовірні.

Вивчення ФАО-індукованого відкриття МП та показників вільнорадикальних
процесів в серці старих щурів після ІГТ. Досліджували ефект гіпоксичного
прекондиціонування, яке моделювали за допомогою ІГТ старих щурів 5 разів
на день з використанням газової суміші, що містила 10% кисню в азоті,
впродовж 10 хв з 10-хв інтервалом протягом 7 діб. Показано, що у старих
щурів після ІГТ величина набухання мітохондрій серця за умов дії ФАО
(10-5 моль/л) достовірно зменшувалась і наближалась до такої у дорослих
тварин. Характер спектра поглинання МФ з мітохондрій серця старих щурів
після ІГТ як за відсутності ФАО (контроль), так і за умов його дії,
також був подібним до такого мітохондрій серця дорослих тварин. В
результаті ІГТ відновлювалась дозозалежна дія ФАО на МП-залежне
вивільнення МФ, якої не спостерігалося в серці старих нетренованих
тварин. Після ІГТ також спостерігали відновлення захисної дії ЦсА щодо
ФАО-індукованого відкриття МП в серці старих щурів.

Результати біохімічних досліджень показали, що після ІГТ спостерігається
достовірне зменшення вмісту Н2О2 та ·ОН в гомогенаті серця старих щурів
(9,18±1,95 пмоль/мг білка і 1,74±0,09 ДE*102/30хв*мг білка відповідно),
у порівнянні з такими в серці старих нетренованих тварин (23,75±3,93
пмоль/мг білка і 3,69±0,81 ДE*102/30хв*мг білка відповідно), і
наближується до такого в серці дорослих щурів. Натомість, вміст О2?? в
групі старих щурів після ІГТ незначним чином підвищується порівняно зі
старими тваринами і становить 2,38±0,46 нмоль·хв/мг білка, в той час як
в серці старих щурів вміст О2?? складає 1,73±0,33 нмоль·хв/мг білка.
Таким чином, ІГТ виявляли захисний ефект щодо ФАО-індукованого утворення
МП в серці старих щурів, який полягав головним чином у відновленні
чутливості їх мітохондрій до такої, яка притаманна для дорослих тварин,
а також у послабленні інтенсивності вільнорадикальних процесів.

Аналіз та узагальнення результатів досліджень

Нами досліджено чутливість МП до індукторів відкриття та роль МП в
розвитку змін скоротливої функції серця при старінні. Порівнюючи
експериментальні результати досліджень впливу ішемії–реперфузії, як
одного з індукторів відкриття МП, на діяльність ізольованого серця
дорослих і старих щурів, стає очевидним, що в обох випадках відбувається
порушення скорочувальної активності міокарду, однак в серці старих щурів
ці зміни є більш вираженими і достовірно відрізняються від таких у
дорослих тварин. Це супроводжується, з одного боку підвищенням вихідного
рівня експресії мРНК bax в серці старих щурів, з іншого – достовірним, у
порівнянні з дорослими тваринами, зменшенням при реперфузії серця старих
щурів величини МФ, який являється маркером відкриття МП. З одного боку,
відсутність МФ у перфузійному розчині у дослідах на ізольованому органі
могла б свідчити про пригнічення індукції неспецифічної проникності,
пов’язаної з відкриттям МП, в серці старих щурів. Однак спостерігали
більш виражені, у порівнянні з дорослими тваринами, у сторону погіршення
зміни скоротливої функції серця при старінні, а також збільшення
величини МФ в крові старих тварин, що очевидно свідчить про протилежне.
В результаті досліджень in vitro, проведених на мітохондріях,
ізольованих із серця щурів, було зроблено висновок, що мітохондрії серця
старих тварин характеризуються підвищеною чутливістю до таких індукторів
МП як Са2+ та окислювачі ФАО та t-Вuooh. Крім того, при старінні
спостерігається порушення бар’єрних властивостей мітохондріальної
мембрани, що призводить до постійного вивільнення з матриксу мітохондрій
ряду низькомолекулярних речовин, що входять до складу МФ. Це може
відбуватися як за рахунок появи в мітохондріях серця старих тварин поряд
з класичною МП неспецифічної, ЦсА-нечутливої пори, так і в результаті
додаткових димерних пор, утворених білком Вах.

Однією з причин підвищення чутливості МП до Са2+, згідно наших даних,
є, ймовірно, зменшення рівня NO в мітохондріях серця старих щурів в
результаті зниження активності конститутивної ізоформи мітохондріальної
NO-синтази. Підвищення чутливості МП до індукторів з віком може
розвиватися і в результаті оксидативного стресу, пов’язаного зі
збільшенням вмісту Н2О2 та О2?? в мітохондріях серця старих щурів, а
також інтенсифікації процесів ПОЛ, про що свідчить збільшення вмісту ДК
в мітохондріях серця при старінні.

Виявлений нами факт ефективного попередження МП-залежних проявів
мітохондріальної дисфункції за умов оксидативного стресу в дослідах in
vitro за допомогою не лише класичного інгібітора відкриття МП ЦсА, але й
мелатоніна, дозволяє надалі використовувати мелатонін як речовину, що
має властивості потенційного інгібітора МП.

Курсове введення старим щурам мелатоніна в нашій роботі виявило
загальний коригуючий ефект щодо відновлення скоротливої функції серця,
нормалізації проникності мітохондріальних мембран, внаслідок чого
знижується чутливість мітохондрій серця до індукторів МП, зменшення
вмісту одного з факторів підвищеної чутливості при старінні – О2?? та
ДК, зниження загального рівня експресії мРНК bax в серці та підвищення
активності ферменту cNOS в мітохондріях серця старих щурів після курсу
мелатоніна.

Зменшення експресії мРНК проапоптотичного агента bax в серці старих
щурів після курсу мелатоніна, в той час як його експресія є початково
підвищеною у порівнянні з дорослими тваринами, безумовно є проявом
позитивної коригуючої дії мелатоніна на серце старих щурів. Це
насамперед свідчить про те, що в серці старих щурів після курсового
введення мелатоніна зменшується кількість апоптотичних клітин, а також
тих клітин, що потенційно можуть вступити на шлях програмованої
клітинної загибелі, і тим самим, погіршувати фізіологічний стан старого
серця в умовах впливу на нього різних несприятливих факторів, серед яких
найголовнішим є ішемія-реперфузія. З іншого боку, розглядаючи bax як
один із компонентів МП, можна припустити, що ймовірність відкриття МП,
як і підвищена чутливість МП до індукторів її відкриття при старінні,
теж зменшується після курсового введення мелатоніна. Ці результати
можуть бути підставою для рекомендацій стосовно використання препарату
мелатоніна для довготривалої корекції підвищеної чутливості МП в серці,
зокрема при старінні, а також при патологічних станах, пов’язаних із
розвитком оксидативного стресу, загалом.

Дані, отримані в нашій роботі, дозволяють запропонувати наступну схему
розвитку втрати міокардом резистентності до ішемії з віком та способів
її корекції (Рис. 7).

Рис.7. Механізми розвитку втрати толерантності серцем до ішемії при
старінні та способи її корекції.

Ці результати доповнюють сучасні уявлення про значення утворення
мітохондріальної пори в розвитку функціональних змін серця; розкривають
один із механізмів втрати толерантності серцем до ішемії при старінні та
обґрунтовують участь у регуляції відкриття МП таких факторів як NO,
вільнорадикальних процесів, а також білка сімейства Bcl-2 Bax.

Висновки

Вперше досліджено залежну від віку чутливість мітохондрій до індукторів
відкриття МП та роль МП в розвитку змін скоротливої функції серця при
старінні. Встановлена роль оксиду азоту, вільнорадикальних процесів та
експресії bax у підвищенні проникності мітохондріальних мембран при
старінні; продемонстрована здатність мелатоніна попереджати утворення МП
за умов моделювання оксидативного стресу.

Встановлено, що зміни скоротливої функції ізольованого за Лангендорфом
серця щурів за умов його ішемії-реперфузії при старінні носять більш
виражений характер, супроводжуються відкриттям МП і, відповідно,
збільшенням проникності мітохондріальних мембран. Показано, що в серці
старих щурів вихідний рівень експресії мРНК bax підвищений.

Вперше встановлено, що мітохондрії серця старих щурів характеризуються
підвищеною чутливістю до індукторів МП – Са2+, ФАО і t-BuOOH. Підвищення
чутливості мітохондрій супроводжується зниженням активності сNOS і
високим вмістом пероксиду водню, супероксидного радикала та дієнових
кон’югатів в мітохондріях серця старих щурів.

Показано, що преінкубація in vitro мітохондрій серця дорослих і старих
щурів та фібробластів людини з мелатоніном попереджає утворення МП за
умов моделювання оксидативного стресу за допомогою ФАО та t-BuOOH.
Попередня перфузія мелатоніном ізольованого серця дорослих і старих
щурів сприяє прискоренню відновлення скоротливої функції серця у
відповідь на ішемію-реперфузію.

Встановлено, що двотижневе курсове введення in vivo старим щурам
мелатоніна сприяє більш ефективному відновленню роботи серця при його
ішемії-реперфузії, нівелює порушення коронарного потоку, знижує
чутливість МП до Са2+ і ФАО, зменшує вміст супероксидного радикала і
дієнових кон’югатів та рівень експресії мРНК bax в міокарді, а також
підвищує активність сNOS в мітохондріях серця.

Показано, що інтервальні гіпоксичні тренування старих щурів знижують
чутливість МП до ФАО і зменшують вміст пероксиду водню та гідроксильного
радикала в серці, але не впливають суттєво на експресію мРНК bax.

Зміни скоротливої функції міокарду за умов його ішемії-реперфузії при
старінні є наслідком підвищеної чутливості мітохондрій серця старих
щурів до індукції МП за дії Са2+ та окислювачів. Протекторний щодо
відкриття МП ефект мелатоніна може бути використаний для корекції
функціональних порушень серця при старінні організму.

Перелік праць, опублікованих за темою дисертації

Статті

Сагач В.Ф., Вавілова Г.Л., Рудик О.В., Струтинська Н.В. Вивільнення
неідентифікованих речовин мітохондріального походження – показник
відкриття РТР мітохондрій серця щурів // Фізіол. журнал. – 2003. – Т.49.
— №5.

Сагач В.Ф., Вавілова Г.Л., Струтинська Н.А., Рудик О.В. Старіння
підвищує чутливість до індукторів мітохондріальної пори в серці щурів //
Фізіол. журнал. – 2004. – Т.50., №2. — С. 49-63.

Г.Л. Вавілова, Н. А Струтинська, О.В. Рудик, В. Ф. Сагач. Вивчення
чутливості феніларсиноксид-індукованого відкриття мітохондріальної пори
в серці старих щурів та за умов впливу на них інтервальних гіпоксичних
тренувань.// Клін. і експ. патологія, — 2004. – T.3, №2, част 1,
С.67-69.

Рудик О.В., Вавілова Г.Л., Струтинська Н.А., Коцюруба А.В., Сагач В.Ф.
Чутливість феніларсиноксид-індукованого відкриття мітохондріальної пори
в серці старих щурів та за умов впливу на них інтервальних гіпоксичних
тренувань.// Фізіол.журнал. – 2004. – Т.50, №5. – С.29-37.

Рудык Е.В., Вавилова Г.Л., Сагач В.Ф., Коцюруба А.В. Интервальные
гипоксические тренировки снижают некоторые показатели оксидативного
стресса и чувствительность к индукторам митохондриальной поры в сердце
старых крыс. // Сб.трудов “Экспертные системы интегральной оценки
состояния организма здоровых и больных” (Нальчик-Москва). – 2005. —
Т.ІІ. – C.43-46.

тези

Rudyk O.V., Sagach V.F. Expression of Bcl-2 family proteins and MPT-pore
opening in cardiomyocytes of old rats // in book: Conference for young
scientists and PhD students of molecular biology and genetics (dedicated
to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniv. of
IMBiG, NASU (Kyiv). – 2003. – P.256.

Е.В. Рудык, Н.А. Струтинская, Г.Л. Вавилова, В.Ф. Сагач. Повышение
чувствительности митохондриальной поры к индукторам и усиление
экспрессии мРНК bax в сердце старых крыс. // В кн. “Третья Всероссийская
с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения.
Тезисы докладов” (Москва). – 2004. — C.92.

OV. Rudyk, VF. Sagach, GL. Vavilova. m-RNA bax expression and increased
sensitivity of the mitochondrial permeability transition pore in old rat
heart. // In book: Workshop in Cardiovascular Physiology “Signal
transduction in cardio-vascular system” (Warsaw). – 2004. – P.93.

Рудик О.В., Струтинська Н.А. Вплив мелатоніна на чутливість до
індукторів відкриття мітохондріальної пори в серці дорослих та старих
щурів. // Тези VI конф. мол. вчених “Актуальні проблеми старіння”. –
2005. – C.146-147.

Rudyk O.V., Sagach V.F., Vavilova G.L., Strutyns’ka N.A. Increased
sensitivity of MPT-opening in old RAT heart. // J Mol Cell Cardiol. –
2005. – Vol.38. – P.1062.

VF Sagach, OV Rudyk, GL Vavilova, NA Strutynska // Increased sensitivity
of MPT-pore opening in old rat heart. in book “Mitochondrial physiology.
The many faces and functions of an organelle”, MIP 2005, 4-th Conference
on Mitochondrial Physiology, Schroecken, Vorarlberg, Austria, P.111.

Г.Л.Вавилова, Е.В. Рудык, Т.В.Серебровская и др. Влияние разных режимов
интервальных гипоксических тренировок на чувствительность
ФАО-индуцированного открытия митохондриальной поры в сердце взрослых и
старых крыс // Тезисы в сб.трудов “Механизмы функционирования
висцеральних систем” (Санкт-Петербург). – 2005. – С.49-50.

Е.В.Рудык, В.Ф. Сагач. Влияние ишемии-реперфузии на функциональное
состояние сердца, открытие митохондриальной поры и экспрессию мРНК bax
при старении. // Тезисы в сб.трудов “Системная биология и биоинженерия”
(Москва). – 2005. – С. 157-158.

Рудик О.В. Протекторний ефект мелатоніна щодо зміни експресії мРНК bax
і чутливості мітохондіальної пори до індукторів її відкриття при
старінні. // Тези VIІ конф. мол. вч. “Акт. проблеми геронтології та
геріатрії”. – 2006. – с.164-165.

OV Rudyk, GL Vavilova, VF Sagach. Heart ischemic intolerance with
aging: role of the mitochondrial permeabіlіty transition, NO and bax
expression // Acta Physiologica. – 2006. – Vol.186., Suppl. – P. 202.

АНОТАЦІї

Рудик О. В. Роль чутливості мітохондріальної пори до індукторів її
відкриття та експресії bax в розвитку функціональних змін серця при
старінні. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.13 – Фізіологія людини та тварин. – Інститут
фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України. – Київ, 2006 р.

Дисертацію присвячено дослідженню залежних від віку змін чутливості
мітохондріальної пори (МП) серця до індукторів її відкриття.
Встановлено, що більш виражені порушення скоротливої функції
ізольованого за Лангендорфом серця за умов ішемії-реперфузії при
старінні є наслідком підвищеної чутливості мітохондрій серця старих
щурів до індукторів МП – Са2+ та окислювачів і зростанням вихідного
рівня експресії мРНК bax в серці. Це супроводжується зниженням
активності конститутивної ізоформи NO–синтази і розвитком оксидативного
стресу в мітохондріях серця старих щурів. Мелатонін запобігає відкриттю
МП in vitro за умов моделювання оксидативного стресу. Двотижневе
введення старим щурам мелатоніна сприяє більш вираженому відновленню
функціональних показників ізольованого серця у відповідь на ішемію та
реперфузію, знижує чутливість МП до Са2+ і феніларсиноксиду (ФАО),
зменшує експресію мРНК bax в серці і вміст супероксидного радикала і
дієнових кон’югатів, а також підвищує активність конститутивної ізоформи
NO–синтази в мітохондріях. Показано, що інтервальні гіпоксичні
тренування старих щурів знижують чутливість МП до ФАО та зменшують вміст
пероксиду водню і гідроксильного радикала в серці. Протекторний щодо
відкриття МП ефект мелатоніна може бути використаний для корекції
функціональних порушень серця при старінні організму.

Ключові слова: ізольоване серце, скоротлива функція, мітохондріальна
пора, індуктори, інгібітори, старіння, оксид азоту, оксидативний стрес,
мелатонін, корекція.

Рудык Е. В. Роль чувствительности митохондриальной поры к индукторам ее
открытия и экспрессии bax в развитии функциональных изменений сердца
при старении. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.13 – Физиология человека и животных. – Институт
физиологии им А.А. Богомольца НАН Украины.–Киев, 2006 г.

Диссертация посвящена исследованию зависимых от возраста изменений
чувствительности митохондриальной поры (МП) сердца к индукторам ее
открытия. Установлено, что более выраженные нарушения сократительной
функции изолированного по Лангендорфу сердца в условиях его ишемии и
реперфузии при старении является следствием повышенной чувствительности
митохондрий сердца старых крыс к индукторам МП – Са2+ и окислителям, а
также увеличения исходного уровня экспрессии мРНК bax в сердце. Это
сопровождается снижением активности конститутивной изоформы NO–синтазы и
развитием оксидативного стресса в митохондриях сердца старых крыс.
Мелатонин предупреждает образование МП in vitro в условиях моделирования
оксидативного стресса. Двухнендельное введение старым крысам мелатонина
способствует более выраженному восстановлению функциональных показателей
изолированного сердца в ответ на ишемию и реперфузию, снижает
чувствительность МП к Са2+ и фениларсиноксиду (ФАО), уменьшает уровень
экспрессии мРНК bax в сердце, содержание супероксидного радикала и
диеновых коньюгатов, а также повышает активность конститутивной изоформы
NO–синтазы в митохондриях. Показано, что интервальные гипоксические
тренировки старых крыс снижают чувствительность МП к ФАО и уменьшают
содержание перекиси водорода и гидроксильного радикала в сердце.
Протекторный относительно открытия МП эффект мелатонина может быть
использован для коррекции функциональных нарушений сердца при старении
организма.

Ключевые слова: изолированное сердце, сократительная функция,
митохондриальная пора, индукторы, ингибиторы, старение, оксид азота,
оксидативний стресс, мелатонин, коррекция.

Rudyk O.V. Role of sensitivity of mitochondrial permeability transition
pore opening and bax expression in the development of functional changes
in heart with aging. – Manuscript.

Thesis for the candidate’s degree by the speciality – 03.00.13 –
human’s and animal’s physiology. — Bogomolets Institute of Physiology of
the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The Thesis deals with an exploration of age-dependent changes of
sensitivity of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP)
opening, role of MPTP in the development of heart ischemic intolerance
with aging and finding the possible ways of prevention the MPTP-opening
in rat heart.

At first, on the Langendorf’s isolated Wistar rat heart was shown that
old rat heart (24-27 months) is characterized by more pronounced drop of
PLV, dP/dtmax and dP/dtmin during 40-min reperfusion after 30-min
ischemia compared to adult hearts (5-6 months). We have demonstrated
that more pronounced injury of isolated old rat heart under ischemia and
reperfusion was accompanied by the increased mitochondrial permeability
and sensitivity of MPTP-opening to Са2+, phenilarsin oxide (PAO),
tertbutylhydroperoxide (t-BuOOH). On isolated old rat heart we observed
significant decrease of value of mitochondrial factor as compared to
adult animals. This factor is releases after ischemia during reperfusion
on isolated rat heart and is a marker of MPTP-opening. While, the value
of mitochondrial factor in blood serum of old rat was twice as much as
for adult ones.

Increased sensitivity of MPTP-opening consist in increasing of swelling
amplitude of mitochondria isolated from the old rat heart under certain
concentration of inductor and also in twice decreasing of given
inductor’s concentration necessary for MPTP-dependent mitochondrial
swelling and mitochondrial factor release from old rat heart
mitochondria in compare to adult ones. Increased sensitivity partially
arises from the reduction of NO- content due to half decreasing in
activity of the constitutive isoform NO-synthase. It was accompanied by
the increased hydrogen peroxide, superoxide anion and dien conjugates
content in old rat heart mitochondria and increased m-RNA bax expression
in old rat heart.

Further, in experiments in vitro was shown that hormone of pineal gland
and antioxidant melatonin prevented PAO and t-BuOOH-induced MPTP-opening
in adult and old rat heart mitochondria. Preliminary perfusion of
isolated adult and old rat heart lead to better restoration of the
contractility of isolated heart and prevented MPTP-dependent
mitochondrial factor release under ischemia and reperfusion. Preliminary
incubation of human fibroblasts MSU 1.1 with melatonin prevented
t-BuOOH-induced dissipation of the mitochondrial membrane potential as
in response to the classical inhibitor of the MPTP-opening cyclosporine
A. Two-week’s in vivo course of intraperitoneal injection of melatonin
(1,5 mg/kg weight) to old rats contributed to rehabiliting of old heart
ischemic tolerance, improves function of coronary vessels, decreased
sensitivity of the MPTP-opening to Ca2+, PAO and m-RNA bax expression in
rat heart. It was accompanied by reduced oxidative stress which consists
in decrease of superoxide anion and dien conjugates content and increase
in activity of mitochondrial NO–synthase in mitochondria from old rat
heart after course of injection of melatonin.

In the experiments with modeling of the hypoxic preconditioning by the
intermittent hypoxic training (IHT) of old rats was shown that IHT
decreased sensitivity of the MPTP-opening to PAO and reduced hydrogen
peroxide and hydroxyl radical content in rat heart, but had no
significant effect on the m-RNA bax expression. It was concluded, that
one of the causes of heart ischemic tolerance loss with aging namely
more pronounced heart malfunction under ischemia-reperfusion are
dysfunction of mitochondrial permeability and the increased sensitivity
of the MPTP-opening to Са2+ and oxidant in rat heart. Protective as for
MPTP-opening effect of melatonin could be used for correction of heart
malfunction with aging.

Key words: isolated heart, contractility, mitochondrial permeability
transition pore, inductors, inhibitors, aging, nitric oxide, oxidative
stress, melatonin, correction.

PAGE 14

Корекція ІГТ

Без корекції

СТАРІННЯ

(серце)

Втрата ішемічної

толерантності:

— зменшення ТРЛШ;

— зменшення dP/dtmax;

— зменшення dP/dtmin;

Відновлення

ішемічної

толерантності :

— збільшення ТРЛШ;

— збільшення dP/dtmax;

— збільшення dP/dtmin;

Корекція

мелатоніном

Проникність

мітохондріальної мембрани

апоптозу

Проникність

мітохондріальної мембрани

Чутливість МП до Са2+;

ФАО; t-BuOOH

Чутливість МП до

Са2+; ФАО; t-BuOOH

АФК (Н2О2, О2??)

ПОЛ (ДК)

мРНК bax

а ктивність

mtNOS

мРНК bax

АФК (Н2О2, О2-)

ПОЛ (ДК)

Активність

mtNOS

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *