Роль алельного поліморфізму генів ендотеліальної no-синтази та протеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань: молекулярно-генетичні аспекти (ав

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Досенко Віктор Євгенович

УДК 616.12:575.113.2+577.152.1

Роль алельного поліморфізму генів ендотеліальної no-синтази та
протеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань:
молекулярно-генетичні аспекти

14.03.04 — патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ — 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі експериментальної кардіології Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (м. Київ)

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор, академік НАН України

Мойбенко Олексій Олексійович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу експериментальної кардіології;

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент
АМН України

Горовенко Наталія Григорівна,

Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупіка,
завідувач кафедри медичної генетики;

доктор медичних наук, професор,

Французова Стела Борисівна,

Науково-дослідний лабораторний центр Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця,

головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та
експериментальної фармакології;

доктор медичних наук, професор

Братусь Віктор Васильович,

Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України,

головний науковий співробітник відділу патофізіології

Провідна установа — Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П.Комісаренка АМН України

Захист відбудеться «26» вересня 2006 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,
4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано «23»серпня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Одним із найважливіших факторів ендогенної
кардіопротекції є ендотеліальна NO-синтаза (eNOS) – фермент, що
каталізує утворення оксиду азоту (NO) з аргініну. Вивченню NO в останні
роки присвячено тисячі досліджень, результатом яких стало зґясування
ролі цієї молекули в нормальному функціонуванні практично усіх систем та
органів, а також у патогенезі ряду захворювань (Мойбенко О.О. та ін.,
1997, 2004; Сагач В.Ф. та ін., 1997; Alderton W.P. et al., 2001;
Furchgott R.F. et al., 1983; Knowles R.G. and Moncada S., 1994(.
Особливе значення NO має у розвитку серцево-судинних захворювань, які є
визначальною причиною смертності в усіх цивілізованих країнах світу
(Доповідь ВООЗ, 2003(. Доведено, що монооксид азоту приймає безпосередню
участь в регуляції судинного тонусу, попередженні адгезії тромбоцитів та
інших процесах, порушення яких призводить до ініціації та прогресування
атеросклерозу (Братусь В.В. та ін., 2005; Napoli C. et al., 2006;
Moncada S. et al., 1991; Schulz R. et al., 2005(.

Алельний поліморфізм гена eNOS, за даними багатьох досліджень, має
велике значення у формуванні спадкової схильності до атеросклерозу,
ішемічної хвороби серця (ІХС), артеріальної гіпертензії тощо (Agema
W.R.P. et al., 2004; Casas J.P. et al., 2004; Nakayama M. et al., 2005;
Wang X.L., Wang J., 2000(. Серед 15-ти алельних варіантів цього гена
виділено три варіанти поліморфізму, що найчастіше зустрічаються у хворих
на серцево-судинні захворювання, і вважаються вагомими факторами-ризику
останніх. Це трансверсія Т-786?С у промоторі гена eNOS, трансверсія
G894?T в 7-му екзоні, що призводить до заміни глутаміну на аспарагін у
298 положенні білка eNOS та тандемні повтори варіабельної кількості 4-го
інтрону (4b/4a) (Сolombo M.G., 2002; Hibi K. et al., 1998; Tanus-Santos
J.E. et al., 2005; Wang X.L. et al., 2000(. Слід зазначити, що частота
різних варіантів гена eNOS в українській популяції раніше не
досліджувалася, а про значення алельного поліморфізму цього гена в
патогенезі різних клінічних варіантів ішемічної хвороби серця, зокрема
такого небезпечного як гострий коронарний синдром (ГКС), майже нічого не
відомо.

З іншого боку, роль протеасомного протеолізу в патогенезі
серцево-судинних захворювань також активно вивчається останніми роками
(Goldberg А.L. et al., 2005; Herrmann J. et al., 2004; Kukan M., 2004(.
Встановлено, що протеасомне розщеплення внутрішньоклітинних білків має
суттєве значення в регуляції обміну ліпопротеїдів, експресії молекул
клітинної адгезії, апоптозі гладеньком’язевих та ендотеліальних клітин,
тобто у процесах, які мають принципове значення в атерогенезі (Drexler
H.C. et al., 2000; Dupre D.J. et al., 2003; Kikuchi J. et al., 2000;
Viera O. et al., 2000(. Отримані дані про можливість застосування
інгібіторів протеасоми для попередження формування неоінтими після
денудації артерії, рестенозу артеріальних судин після балонної
дилятації, ішемічно-реперфузійних ушкоджень та інсультів (Herrmann J. et
al., 2004; Meiners S. et al., 2002; Okamoto H. et al., 1998; Wojcik C.
and di Napoli M., 2004(. У генах, що кодують каталітичні субодиниці
імунопротеасоми (LMP2 та LMP7) описано полиморфізм поодиноких
нуклеотидів (SNP) і тривають спроби встановити вплив алельного
поліморфізму вказаних генів на ймовірність розвитку тих чи інших
захворювань (Deng G.Y., 1995; Kawaguchi Y. et al., 2005; Maksymowych
W.P. et al., 1994(. Даних про роль алельного поліморфізму генів LMP2 и
LMP7 в патогенезі серцево-судинних захворювань немає.

Вивчення механізмів фенотипової реалізації алельних варіантів різних
генів при поліморфізмі поодиноких нуклеотидів є однією з найактуальніших
задач медичної генетики та патофізіології. Слід підкреслити, що це
питання не вирішено як стосовно гена NO-синтази, так і генів
імунопротеасоми. Найважливішими факторами, що визначають ефективність
роботи NO-синтази в клітині, є рівень транскрипції гена, інтенсивність
пострансляційної модифікації та швидкість протеолітичної деградації
цього ферменту. Строк напівжиття білка NOS досить короткий (15-20
годин), він може фосфорилюватися (за тирозиновим, сериновим залишкам або
за залишком треоніна) і цей фермент може окислюватися під дією як
монооксиду азоту (який він сам синтезує), так і інших окисників
(супероксиданіон радикалу, перекису водню) (Alderton W.P. et al., 2001(.
Отже, є усі підстави вважати, що протеасомний протеоліз грає важливу
роль в регуляції активності продукції оксиду азоту, а вивчення звґязку
між убіквітин-залежним протеолізом та активністю NO-синтаз у клітині є
вельми актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках наукової тематики відділу експериментальної кардіології
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Дослідження ролі
нових ендогенних біорегуляторів в розвитку патологічних процесів в
серцево-судинній системі; розробка та впровадження нових методів
лікування гострого інфаркту міокарда” (№ держреєстрації 0199U004033),
“Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності
серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі; розробка
методів їх корекції” (№ держреєстрації 0102U000827), “Дослідження
ендогенних механізмів кардіопротекції при захворюваннях серця” (№
держреєстрації 0105U003233) та наукової програми НАН України
“Дослідження молекулярних механізмів – проявів функціонування геному, що
зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в
нормі та патології” (№ держреєстрації 0102U002472).

Метою дослідження було визначення ролі алельного поліморфізму гена
ендотеліальної NO-синтази і генів імунопротеасоми в патогенезі
серцево-судинних захворювань та доведення участі протеасомного
протеолізу в регуляції активності NO-синтази.

Задачі дослідження:

1. Дослідити частоту алельного поліморфізму промотору (Т-786?С), 7-го
екзону (G894?T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази
та генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7), у хворих на
серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів.

2. Розробити метод визначення функціонального значення алельного
поліморфізму гену ендотеліальної NO-синтази та генів, що кодують
субодиниці імунопротеасоми.

3. Оцінити інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази за
рівнем матричної РНК в тромбоцитах, ізольованих від генотипованих за
промотором, 7-м екзоном та 4-м інтроном осіб.

3. Визначити активність продукції NO тромбоцитами людей з певними
генетичними варіантами ендотеліальної NO-синтази для доведення
патогенетичного зв’язку між алельним поліморфізмом та функціональними
властивостями ендотеліальної NO-синтази.

4. Оцінити експресію генів LMP2 та LMP7 за рівнем матричної РНК в
лейкоцитах, ізольованих від генотипованих за цими генами осіб.

5. Визначити хімотрипсиноподібну та трипсиноподібну активність
протеасоми в лейкоцитах людей з певними генетичними варіантами
імунопротеасоми.

6. Вивчити вплив протеасоми та її інгібіторів на активність
рекомбінантної ендотеліальної NO-синтази та активність цього ферменту в
ізольованих тромбоцитах.

7. Розробити метод визначення РНК-азної активності протеасоми та
дослідити протеасомну деградацію матричної РНК різних ізоформ
NO-синтази.

8. Вивчити механізми кардіопротекторної дії кверцетину та його
водорозчинного аналогу “Корвітину”, що реалізуються через вплив на
активність протеасомного протеолізу.

Об’єкт дослідження – алельний поліморфізм генів ендотеліальної
NO-синтази, субодиниць імунопротеасоми та їх функціональне значення.

Предмет дослідження – ДНК та РНК, виділені з венозної крові хворих на
гострий коронарний синдром, артеріальну гіпертезію та крові практично
здорових осіб, неонатальні кардіоміоцити щурів, ізольовані тромбоцити та
лейкоцити людей та кролів.

Методи дослідження: виділення ДНК та РНК з клітин крові, полімеразна
ланцюгова реакція із наступним аналізом довжини рестрикційних
фрагментів, зворотна транскрипція із полімеразною ланцюговою реакцією,
ізоляція клітин крові, виділення та культивування кардіоміоцитів,
визначення активності ендотеліальної NO-синтази та протеасоми за
розробленою методикою, визначення різних видів клітинної смерті із
застосуванням флуоресцентних барвників.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на сучасному методичному
рівні отримано інформацію про розподіл різних алельних варіантів
промотору, 7-го екзону та 4-го інтрону гена ендотеліальної NO-синтази у
хворих на гострий коронарний синдром та артеріальну гіпертензію в
українській популяції. Встановлено, що поліморфізм промотору вказаного
гена має найбільше значення порівняно з іншими варіантами поліморфізму у
формуванні схильності до розвитку гострого коронарного синдрому.
Поліморфізм 7-го екзону при цьому значно частіше визначається у
підлітків хворих на артеріальну гіпертензію. Вперше досліджено частоту
алельного поліморфізму генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми, у
хворих на серцево-судинні захворювання.

Із застосуванням розробленого методу встановлено функціональне значення
алельного поліморфізму різних варіантів генів ендотеліальної NO-синтази
та субодиниць імунопротеасоми.

Вперше доведено звґязок між активністю ендотеліальної NO-синтази та
протеасомним протеолізом, що реалізується за рахунок протеасомної
деградації ендогенного інгібітору ендотеліальної NO-синтази в
ізольованих тромбоцитах, рекомбінантної еNOS за умов in vitro та
здатності протеасоми руйнувати РНК різних ізоформ NO-синтаз.

Описано нові молекулярні механізми кардіопротекторної дії кверцетину та
його водорозчинного аналогу “Корвітину”, що реалізуються за рахунок
пригнічення протеасомної активності в культивованих кардіоміоцитах та у
лейкоцитах крові за умов in vivo. При цьому біофлавоноїди попереджуть
некротичну та апоптотичну загибель кардіоміоцитів при моделюванні
аноксії-реоксигенації.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження були
спрямовані на з’ясування значення алельного поліморфізму генів, що
кодують ендотеліальну NO-синтазу та субодиниці імунопротеасоми, в
патогенезі серцево-судинних захворювань. Встановлені факти дозволяють
оцінювати ризик виникнення гострого коронарного синдрому та артеріальної
гіпертензії, диференційовано підходити до терапії цих захворювань з
урахуванням генотипу певного хворого та проводити запобіжні заходи для
попередження виникнення важких ускладнень зазначених захворювань.
Генотипування людей за алельними варіантами гена ендотеліальної
NO-синтази може бути використано для скринінгу хворих на серцево-судинні
захворювання та їх ранньої діагностики.

Встановлене функціональне значення певних алельних варіантів гена
ендотеліальної NO-синтази дозволяє зробити висновок про виняткове
значення поліморфізму промотору гена ендотеліальної NO-синтази у
недостатності продукції монооксиду азоту в організмі людини, що є
важливим фактором патогенезу найбільш поширених серцево-судинних
захворювань.

Здатність кверцетину та його водорозчинного аналогу “Корвітину”, який
вже впроваджено у клінічну практику, пригнічувати активність протеасоми
дозволяє краще зрозуміти механізми кардіопротекторної дії біофлавоноїдів
та рекомендувати їх для застосування в якості інгібіторів протеасоми.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз літературних
джерел, поставлено задачі дослідження, налагоджено та розроблено нові
функціонально-генетичні методи, виконано необхідні експериментальні
дослідження, статистично оброблено, проаналізовано та узагальнено
отримані результати. Деякі експерименти були проведені разом із
співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, які
є співавторами опублікованих робіт.

Діагностика захворювань та відбір хворих для генотипування було
проведено у відділенні реанімації та інтенсивної терапії Інституту
кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України під керівництвом професора
О.М. Пархоменка та в клініці кафедри педіатрії №4 Національного
медичного університету ім. О.О.Богомольця під керівництвом д.м.н.
М.В.Хайтовича.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено на
семінарах cектору нейрофізіології Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця (2004, 2005), Конгресі товариства патофізіологів України
(м. Чернівці, 2004 р.); спільному засіданні Київського обласного
товариства патофізіологів та сектору вісцеральних систем Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця (26 січня 2006 р.); IV Міжнародному
конгресі патофізіологів (м. Будапешт, June 29 — July 5, 2002 р.); V
Міжнародному конгресі патофізіологів (м. Пекін, June 29 — July 5, 2006
р.); 59 Harden конференції європейського товариства молекулярної
біології “The ubiquitin proteasome system in health and disease”,
(Cirencester, 6-10 Sept., 2004); конференціях Міжнародного товариства по
вивченню серця (Dresden, 2004; Tromso, 2005; Manchester, 2006);
конференції Скандинавського товариства з досліджень у кардіоторакальній
хірургії (10-12 лютого 2005 р.); Європейських конференціях по апоптозу
(Chania, 17-20 Sept. 2004 та Budapest, 1-4 Oct., 2005), науковій
конференції “Міжнародне наукове співробітництво – в імґя миру та
розвитку” (10 листопада 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 40 робіт, у тому
числі 27 статей у наукових журналах.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й
узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних
джерел із 514 найменувань. Робота викладена на 310 сторінках, містить 19
таблиць та проілюстрована 59 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідження було залучено 265 хворих на гострий коронарний синдром
віком від 40 до 83 років (середній вік 58.5 ( 0.7 роки), яких було
госпіталізовано у відділення реанімації та інтенсивної терапії Інституту
кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України; 84 підлітка з первинною
артеріальною гіпертензією, що проходили лікування в клініці кафедри
педіатрії №4 Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця та
104 практично здорових донори (Київський міський центр крові), в яких
відсутність серцево-судинної патології підтверджували шляхом збору
анамнестичних даних, електрокардіографічного дослідження та вимірювання
артеріального тиску. Контрольна група та група хворих на гострий
коронарний синдром не відрізнялися за віком і співвідношенням чоловіків
та жінок (P>0.05 за (2-критерієм). Також проведено досліди на 35
статевозрілих кролях породи шиншила (маса — 2580.0 ( 95.0 г) віком від 4
до 8 місяців та кардіоміоцитах, виділених із шлуночків 40 щурів лінії
Віcтар (маса — 51.0 ( ?4.4 г) віком від 2 до 3 діб.

Генетичні методи визначення алельного поліморфізму. Венозну кров
набирали в стерильних умовах у моновети об’ємом 2,7 мл з калієвою сіллю
етилендіамінтетраоцтової кислоти (11.7 мМ) в якості антикоагулянту
(“Sarstedt”, Німеччина), заморожували та зберігали при температурі
-20(С. ДНК виділяли з цільної крові із використанням наборів DIAtom DNA
Prep (“Isogene”, Росія). Т-786(С поліморфізм промотору визначали
методом полімеразної ланцюгової реакції з наступним аналізом довжини
рестрикційних фрагментів (PCR-RFLP) за Ghilardi G. et al. (2002) із
модифікаціями. Для цього ампліфікували ділянку промотору гена eNOS за
допомогою пари специфічних праймерів: прямий – 5`-CAC CTG CAT TCT GGG
AAC TGTA-3` та зворотній — 5`-GCC GCA GTA GCA GAG AGAC-3`. Праймери
синтезовано фірмою “Синтол” (Росія). Для ампліфікації брали 30-50 нг ДНК
і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного РСR-буферу, 1,5 мМ
сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 пМ
кожного з праймерів і 0.5 ОД Taq-полімерази (“АмпліСенс”, Росія), об’єм
доводили до 25 мкл деіонізованою водою. PCR проводили в термоциклері
“Applied Biosystems 2700” (“PerkinElmer”, США). Ампліфікація фрагменту
промотору складалася з 35 циклів: денатурація — 94(С (1 хв),
гібридизація праймерів — 63(С (50 cек) та елонгація — 74(С (1 хв). У
подальшому 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37(С протягом 18
годин з 5 ОД рестриктази PdiI (“Ферментас”, Литва) в буфері Y+/Tango. За
наявності в –786 положенні промотору тимідину рестрикція не
відбувається, а при заміні на цитозин PdiI розщеплює ампліфіковану
ділянку промотору (розмір 125 пар основ) на два фрагменти – 95 та 30 пар
основ (рис. 1). Ампліфікати після рестрикції розділяли в 2,5 %
агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Візуалізація ДНК
після горизонтального електрофорезу (160 V протягом 40 хв) проводилася
за допомогою трансілюмінатору (“Біоком”, Росія) та відеосистеми ViTran
(Росія).

Рис. 1. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту промотору гена
eNOS при рестрикції PdiI. M – маркер молекулярної маси (п.о. — пари
нуклеїнових основ), смужки 1 — 4, 7, 8, 10 відповідають Т/С-генотипу, 5,
6 – С/С-генотипу, 9 та 11 – Т/Т-генотипу

Алельний поліморфізм 7-го екзону гена eNOS (G894(T поліморфізм) також
визначали із використанням методу PCR-RFLP (Hibi K. et al., 1998(.
Послідовність нуклеотидів у специфічних для гена eNOS праймерах була
наступною: прямий – 5`-TCC CTG AGG AGG GCA GGC – 3` і зворотній — 5`-TGA
GGG TCA CAC AGG TTC CT-3`. Ампліфікація фрагменту 7-го екзону складалася
з 35 циклів: денатурація — 94(С, 1 хв, гібридизація праймерів — 64(С, 1
хв і елонгація — 74(С, 1 хв.

Рис. 2. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту 7-го екзону гена
eNOS при використанні рестриктази Eco24I. M – маркер молекулярної маси
(п.о. — пари нуклеїнових основ), доріжки 2, 3, 6 — 8 відповідають
G/T-генотипу, 5 – T/T-генотипу, 1 та 4 –G/G-генотипу.

Для визначення поліморфізму поодиноких нуклеотидів 7-го екзону 6-10 мкл
продукту ампліфікації інкубували при 37(С протягом 20 годин з 8 ОД
рестриктази Ecо24I (“Ферментас”, Литва) в буфері Y+/Tango; або 5 ОД
рестриктази MboI в буфері R+. Якщо в 894 положенні гена eNOS знаходився
гуанідин, то ампліфікат, що складався з 457 пар основ, розщеплювався
рестриктазою Ecо24I на два фрагменти – 137 і 320 пар основ. У разі
заміни G894(T сайт рестрикції для Ecо24I втрачається, а для рестриктази
MboI, навпаки, з’являється і утворюється два фрагменти вказаного розміру
(рис. 2).

Для визначення поліморфізму 4-го інтрону гена eNOS використовували пару
специфічних праймерів: прямий – 5`-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3` і
зворотній — 5`-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3` (Wang J. et al., 2002(.
Програма ампліфікації була наступною: денатурація — 94(С (1 хв),
гібридизація праймерів — 60(С (1 хв) та елонгація — 74(С (1 хв), разом
35 циклів. Після цього проводився горизонтальний електрофорез (150 V
протягом 50 хв) та візуалізація ДНК (рис. 3).

Рис. 3. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту 4-го інтрону гена
eNOS. M – маркер молекулярної маси (п.о. — пари нуклеїнових основ),
смужки 2, 4-6, 8, 9, 11 відповідають 4b/4b-генотипу, 1, 3, 10 –
4b/4a-генотипу, 7 – 4a/4a-генотипу.

Методика PCR-RFLP дозволила визначити і Arg60(His поліморфізм гена LMP2
(Vinasco J. et al., 1998 із модифікаціями(. Для цього ампліфікували
ділянку вказаного гена за допомогою пари специфічних праймерів: прямий —
5`-CTT GAA CCA GGG AGG CGA AGT TTG-3` і зворотній — 5`-CAG CTG AAC CAG
AGA GTG CAT AGT-3`. Ампліфікація фрагменту гена LMP2 складалася з 35
циклів: денатурація — 94(С (1 хв), гібридизація праймерів — 63(С (30
cек) и елонгація — 74(С (1 хв).

Рис. 4. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту гена LMP2 при
рестрикції Hin6I. M – маркер молекулярної маси (п.о. — пари нуклеїнових
основ), доріжки 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 відповідають Arg/Arg-генотипу, 3, 5
– Arg/His -генотипу, 7 и 10 – His/His -генотипу.

Далі 6 мкл продукту ампліфікації фрагменту гена інкубували при 37(С
протягом 18 годин з 2 ОД рестриктази Hin6I (“Ферментас”, Литва) в буфері
Y+ або з 2 ОД рестриктази Alw21I в буфері О+ (Ферментас”, Литва). Якщо в
гені LMP2 знаходився гуанідин, то ампліфікат, який складався з 228 пар
основ, розщеплювався рестриктазою Hin6I на два фрагменти – 199 и 29 пар
основ. У разі заміни гуанідину на аденін сайт рестрикції для Hin6I
втрачається, а для рестриктази Alw21I – з’являється і утворюється два
фрагменти вказаного розміру (рис. 4), що візуалізувалися після
горизонтального електрофорезу (160 V протягом 40 хв).

Алельний поліморфізм гена LMP7 (Lys145(Gln поліморфізм) також визначали
шляхом ампліфікації фрагменту із наступною рестрикцією (Vinasco J. et
al., 1998 із модифікаціями(. Послідовність нуклеотидів у специфічних
праймерах була такою: прямий (sense) – 5`-СGG ACA GAT CTC TGG GTG CT-3`
і зворотній (antisense) — 5`-CTT CCC TAC TGC CCC AAG CT-3`. Ампліфікація
фрагменту гена LMP7 складалася з 38 циклів: денатурація — 94(С, 1 хв,
гібридизація праймерів — 63(С, 35 c та елонгація — 74(С, 1 хв.

Рис. 5. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту гена LMP7 при
застосуванні рестриктази Mva1269I. M – маркер молекулярної маси (bp —
пари нуклеїнових основ), доріжки 1, 2, 4 — 9 відповідають
Lys/Lys-генотипу, 3 – Lys/Gln –генотипу.

Для визначення SNP гена LMP7 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при
37(С протягом 20 годин із 5 ОД рестриктази HindIII (“СибЭнзим”, Росія)
або з 2 ОД рестриктази Mva1269I в буфері R+. Більш розповсюджений
алельний варіант гена LMP7 с цитозином (розмір ампліфікату — 193 пар
основ) розщеплювався рестриктазою HindIII на два фрагменти – 179 та 14
пар основ. У разі заміни цитозину на аденін ампліфікат розрізався
рестриктазою Mva1269I на два фрагменти вказаного розміру (рис. 5).

Для визначення інерційно-делеційного поліморфізму 16-го інтрону гена
ангіотензин-пертворюючого ферменту використовували пару специфічних
праймерів: прямий — 5`-СTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3` та зворотній —
5`-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3`. Програма ампліфікації була
наступною: денатурація — 94(С (1 хв), гібридизація праймерів — 58(С (1
хв) та елонгація — 74(С (1 хв), разом 30 циклів (Alvarez R. et al.,
2001(. Отримані ампліфікати розділяли в 1,5 % агарозному гелі (175 V
протягом 15 хвилин) в присутності бромистого етидію. За наявності 287
пар основ в 16-му інтроні вказаного гену утворюється ампліфікат більшої
молекулярної маси, що повільніше рухається в електричному полі, а при
делеції зазначеної кількості пар нуклеїнових основ – утворюється продукт
полімеразної ланцюгової реакції меншої молекулярної маси. Якщо в геномі
є обидва алелі (І та D) візуалізується дві смужки, що відповідають
ампліфікатам фрагментів інтрону гена АПФ у гетерозиготному стані.

Методика сепарації окремих видів клітин крові. Для виділення
тромбоцитів венозну кров набирали в стерильних умовах у моновети об’ємом
2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (11.7 мМ) в
якості антикоагулянту (“Sarstedt”, Німеччина), а для попередження
адгезії та агрегації тромбоцитів використовували апіразу (1 ОД/мл).
Після трьох циклів центрифугування тромбоцити ресуспензували в буфері
Тіроде наступного складу (137 мМоль NaCl, 12 мМоль NaHCO3, 2 мМоль KCl,
0.34 мМоль Na2HPO4, 1 мМоль MgCl2, 5.5 мМоль глюкози, 5 мМоль HEPES
(N-2-гідроксиетилпіперазин-N`-2-етансульфонова кислота), pH 7.3), що
містив 0.35% сироваткового альбуміну бика (Oury C. et al., 2002(.
Підрахунок кількості тромбоцитів проводили в камері Горяєва.

Для виділення моноцитів, лімфоцитів та нейтрофільних гранулоцитів
стабілізовану венозну кров розводили 0.9% розчином хлористого натрію в
співвідношенні 1:1, після чого нашаровували на заздалегідь підготовлений
градієнтний розчин перкола, який складався з 4 шарів з відносною
густиною 72%, 63%, 54%, 45%. Відмивання клітин від перкола проводилося
шляхом центрифугування протягом 5 хв при 800 g (моноцити і лімфоцити) і
850 g (нейтрофільні гранулоцити) з подальшим відбором осаду і його
ресуспензуванням в розчині Хенкса. Підрахунок кількості лейкоцитів
проводили в камері Горяєва.

Зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція (RT-PCR).
Виділення РНК із тромбоцитів та моноцитів проводили із використанням
набору Trizol RNA-prep (Isogen, Росія) для виділення тотальної РНК. Для
оцінки експресії гена eNOS в тромбоцитах проводили зворотну транскрипцію
із використанням RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Fermentas, Литва), застосовуючи 500 нг загальної РНК та олігомерний
(dT)18 праймер. Отриману одноланцюгову ДНК використовували як матрицю
для полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням наступної пари
праймерів: прямий — 5`-TCC CTG AGG AGG GCA GGC-3` та зворотній — 5`-TGA
GGG TCA CAC AGG TTC CT-3`. Ампліфікація фрагменту 7-го екзону гена eNOS
складалася з 35 циклів: денатурація — 94(С, 1 хв, приєднання праймерів —
64(С, 1 хв і елонгація — 74(С, 1 хв. Для контролю за якістю виділення
РНК та порівняння інтенсивності експресії гену еNOS паралельно
ампліфікували фрагмент гену (-актину – одного із house-keeping генів
(Шsterbш R. et al., 2003(.

Для оцінки експресії генів LMP2 та LMP7 в моноцитах також проводили
зворотну транскрипцію проводили із використанням RevertAid™ H Minus
First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), застосовуючи 300 нг
загальної РНК та олігомерний (dT)18 праймер. Отриману одноланцюгову ДНК
використовували для полімеразної ланцюгової реакції (PCR) із
застосуванням наступних пар праймерів: 5′-CTT GAA CCA GGG AGG CGA AGT
TTG-3′ і — 5′-CAG CTG AAC CAG AGA GTG CAT AGT-3′ (для оцінки експресії
LMP2) та 5′-СGG ACA GAT CTC TGG GTG CT-3′ і 5′-CTT CCC TAC TGC CCC AAG
CT-3′ (для оцінки експресії LMP7). Ампліфікація фрагментів генів
складалася з 38 циклів: денатурація — 94(С, 1 хв, приєднання праймерів —
63(С, 1 хв і елонгація — 74(С, 1 хв. Для контролю за якістю виділення
РНК та порівняння інтенсивності експресії генів імунопротеасоми
паралельно ампліфікували фрагмент гену (-актину.

Біохімічні дослідження. Для визначення активності eNOS використовували
флуориметричну детекційну систему (FCANOS-1, Sigma), в основу якої
покладено принцип флуоресценції триазолофлуоресцеїна, що утворюється
після взаємодії NO з 4,5-діамінофлуоресцеїном, який, в свою чергу,
утворюється з 4,5-діамінофлуоресцеїна діацетату (DAF-2А) під дією
внутрішньоклітинних естераз. Довжина хвиль збудження/поглинання
становила 492/515 нм. Інгібітор NOS діфеніленйодоній хлорид (100 мкМоль)
пригнічував реакцію, що підтверджувало специфічність вимірювання
активності NOS. Активність ферменту виражали в одиницях флуоресценції
(UF) за хв на 106 клітин.

Протеолітичну активність протеасоми (хімотрипсиноподібну,
трипсиноподібну та пептидилглютамил пептидгідролазну) в клітинах крові
визначали за інтенсивністю гідролізу специфічних флуорогенних субстратів
— сукциніл-лейцин-лейцин-валін-тирозин-7-амідо-4-метилкумарину
(LLVT-AMC), бoк-лейцин-серин-треонін-аргінін-7-амідо-4-метилкумарину
(LSTA-AMC) та CBZ-Leu-Leu-Glu-7-амідо-4-метилкумарин (LLG-AMC)
відповідно (спектрофлуориметр Hіtachі-4000). Довжина хвилі
збудження/емісії (Ex/Em) становила 360/440. При визначенні активності
протеасоми в моноцитах після преінкубації із субстратом протягом 1
хвилини при температурі 37°С до проби (300 мкл) додавали 3 мкл сапоніну
(10 мг/мл) для пермеабілізації клітинних мембран. Гідроліз субстрату
спостерігався тільки після додавання сапоніну. Реакційний буфер (0.025 М
Трис HCl, pН 7.5) для визначення протеолітичної активності протеасоми
містив у кінцевій концентрації 6 мкМ LLVT-AMC, або LSTA-AMC, або
LLG-AMC. Для підтвердження специфічності протеасомного гідролізу
використовували селективний інгібітор протеасоми — класто-лактацистин
бета-лактон у концентрації 5 мкМ. Відсоток пригнічення активності
гідролізу відповідних субстратів під дією зазначених інгібіторів
трактували як активність протеасоми і виражали в нМ
7-аміно-4-метилкумарину на 106 клітин за 1 хв. Активність протеасоми в
ізольованих кардіоміоцитах щура визначалася наступним чином: клітини
диспергували за допомогою скребка та озвучували з максимальною
інтенсивністю протягом трьох хвилин за використання ультразвукового
диспергатору УЗДН А. Нелізовані клітини та ядра клітин видалялися
центрифугуванням при 3000 g протягом 10 хв. Супернатант інкубували в
буфері наступного складу: 25 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитіотреїтола и
6 мкМ відповідного флуорогенного субстрату. Через 30 хв (для
трипсиноподібної активності) або за 60 хв (для інших типів активності)
інкубації з 6 мкМ відповідних флуорогенних субстратів проводилася
реєстрація флуоресценції продуктів гідролізу (довжина хвилі
збудження/еміссії — 360/440) з використанням вільного
7-аміно-4-метилкумарину як стандарту.

Для визначення РНК-азної активності протеасоми виділяли РНК з міокарда
лівого шлуночка мишей та щурів за допомогою набору Trizol RNA-Prep
(“Isogene”, Росія). 150-200 нг тотальної РНК змішували з протеасомною
фракцією ІІ (PF II) в концентрації – 0.25 мг/мл або з комбінацією двох
рибонуклеаз (RNase A/T1 Mix, “Fermentas”, Литва). Концентрація
рибонуклеази А в пробі становила 0.12 мг/мл, а рибонуклеази Т1 – 1.5 ОД.
Специфічний інгібітор протеасоми класто-лактацистин (-лактон (4 мкМ)
додавали або безпосередньо перед інкубацією, або за 2 години до
додавання РНК. В окремих дослідах для попередження деградації РНК
додавали в проби олігонуклеотид 5`-GTG CCT TTG GGC TCC TCC AAG GTG-3`
(концентрація — 0.26 мкг/мкл), що відповідає послідовності нуклеотидів в
РНК індуцибельної NO-синтази (iNOS). Об’єм проб доводили до 5 мкл
деіонізованою водою.

Таблиця 1.

Послідовність нуклеотидів у праймерах, температура їх гібридизації, та
розмір ампліфікатів генів (в парах нуклеїнових основ) специфічних для
серця миші актину, легких ланцюгів міозину та генів різних ізоформ
NO-синтази щура ( HYPERLINK
«http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term
=%22Park+CO%22%5BAuthor%5D» \o «Click to search for citations by this
author.» Park C.O . et al., 2001; Rudnicki M.A. et al., 1990(.

Ген Праймери TєC гібриди-зації Розмір ампліфікату, пар основ

Актин прямий — 5`-tgt tac gtc gcc ttg gat ttt gag-3`,

зворотній — 5`-aag aga gag aca tat cag aag c-3` 63єC 300 п.о.

Легкі ланцюги міозину прямий — 5`-gcc aag aag cgg ata gaa g-3`,

зворотній — 5`-ctg tgg ttc agg gct cag tc-3` 63єC 300 п.о.

iNOS прямий – 5`-gga gga cca cct cta tca gga ag -3`

зворотній -5`-gtg cct ttg ggc tcc tcc aag gtg-3` 58.5єC 361 п.о.

eNOS прямий – 5`-gct gcg gcg cct gga aag aa-3`

зворотній — 5`-gcc cat gca cgg aca gca gca caat-3` 58.5єC 437 п.о.

nNOS прямий — 5`-gaa ctg gga ggg gag agg att ctg-3`

зворотній-5`-cac gag gtc ctc gtg gtt gcc gg -3` 58.5єC 398 п.о.

У подальшому усі проби інкубували протягом 60 хв при 36(С, а після цього
проводили зворотну транскрипцію за використання RevertAid™ H Minus First
Strand cDNA Synthesis Kit (“Fermentas”, Литва) із застосуванням
випадкового гексамерного (random hexamer) праймера. В окремих дослідах
для виключення можливості протеасомної деградації зворотної
транскриптази PF II додавали безпосередньо перед проведенням зворотної
транскрипції. Отриману одноланцюгову ДНК використовували як матрицю у
полімеразній ланцюговій реакції (PCR) для ампліфікації фрагментів генів,
що кодують специфічні для сердця миші актин і легкі ланцюги міозину, а
також генів, що кодують NO-синтази щура — ендотеліальну, індуцибельну та
нейрональну (nNOS). Гени актину та легких ланцюгів міозину було обрано з
огляду на високий рівень їх експресії в клітинах серця. Інформацію про
послідовність нуклеотидів в праймерах, температуру їх гібридизації та
розмір ампліфікатів в парах основ (п.о.) наведено в табл. 1.

Для визначення впливу протеасомного протеолізу на активність еNOS в
ізольованих тромбоцитах застосовували протеасомну фракцію ІІ (PF II) з
ретикулоцитів кроля (Sigma). Вказана фракція містить ферменти, що беруть
участь в убіквітинізації (Е1, Е2), 20S і 26S протеасому. Таким чином, за
наявності убіквітину і АТФ будь-який білок кроля, який може підлягати
убіквітин-залежному протеасомному протеолізу, після взаємодії з PF II
повинен руйнуватися за участі протеасоми. Тромбоцити (7 – 7,5 х 106)
виділяли як вказано вище, озвучували з максимальною інтенсивністю
протягом трьох хвилин за допомогою ультразвукового диспергатору УЗДН А
та інкубували з PF II (концентрація – 0,5 мг/мл) при 36єС протягом 60
хв. В окремих дослідах інтактні тромбоцити піддавали впливу Н2О2 (1 мМ)
протягом 30 хв, після чого клітини осаджували центрифугуванням (900 g),
видаляли супернатант і ресуспензували в буфері Тіроде. Далі проводили
інкубацію з PF II аналогічно до описаного вище. Для вивчення
специфічності дії PF II використовували метильований убіквітин (8 мкМ),
який приєднуючись до білка, попереджує утворення поліубіквітинового
ланцюжка, та інгібітор протеасоми – класто-лактацистин (-лактон (20
мкМ). Також проводилися експерименти з визначення впливу різних
концентрацій (10 та 20 мкМ) класто-лактацистин (-лактону, MG132 (20 мкМ)
та кверцетину (20 мкМ) на активність еNOS у неозвучених тромбоцитах.
Тривалість інкубації становила 60 хв при 36(С, після чого визначалася
активність еNOS як вказано вище. В контрольні проби додавали відповідний
обґєм диметилсульфоксиду – речовини, у якій були розчинені як інгібітори
протеасоми, так і кверцетин.

Для дослідження впливу біофлавоноїду кверцетину на пурифіковану 20S
протеасому та 26S протеасому з протеасомної фракції ІІ за умов in vitro
використовували пурифіковану 20S протеасому (ICN, США) та протеасомну
фракцію II (PF II) з ретикулоцитів кроля (Sigma, США). 20S протеасому
(2.5 мкг) інкубували протягом 30 хв при 36(С з різними концентраціями
(5, 10 та 20 мкМ) класто-лактоцистина (-лактона або кверцетину, а потім
додавали специфічні флуорогенні субстрати для визначення трьох видів
активності протеасоми. PF II (2,5 мкг) піддавали впливу вказаних речовин
у тій самій концентрації за аналогічних умов з наступним визначенням
інтенсивності гідролізу флуорогенних субстратів.

Дослідження впливу протеасомної фракції ІІ на активність рекомбінантної
еNOS. Для визначення можливості руйнування протеасомою ендотеліальної
NOS було проведено експерименти in vitro із використанням рекомбінантної
еNOS бика (Sigma, США) та протеасомної фракції II (Sigma, США).
Визначення активності еNOS проводили із використанням
4,5-діамінофлуоресцеїна діацетату (DAF-2А) (Sigma, США) в 50 мМ HEPES
буфері (pH 7.4), що містив наступні компоненти: оксигемоглобін (5 мкМ),
хлорид кальцію (1 мМ), кальмодулін (20 мкг/мл), НАДФН (0.1 мМ),
L-аргінін (50 мкМ), тетрагідробіоптерин (12 мкМ) та дітіотреїтол (170
мкМ). Перед визначенням активності еNOS фермент (0.5 ОД) піддавали
протягом 20 хвилин дії протеасомної фракції II (концентрація – 0,5
мг/мл) в 50 мМ HEPES буфері (pH 7.4) із додаванням дітіотреїтолу (170
мкМ). Після цього визначали активність рекомбінантної еNOS бика за
інтенсивністю флуоресценції через 10 хвилин після додавання DAF-2А (8
мкМ). Довжина хвиль збудження/поглинання становила 492/515 нм.
Активність ферменту виражали в одиницях флуоресценції (UF) за 1 хв.
Інгібітор NOS діфеніленйодоній хлорид (50 мкМоль) пригнічував реакцію,
що підтверджувало специфічність вимірювання активності NOS. Для вивчення
залежності деградації еNOS від формування поліубіквитінового ланцюжка
використовували метильований убіквітин (8 мкМ), а для доведення ролі
активної протеасоми в цьому процесі застосовували інгібітор протеасоми –
MG132 (10 мкМ).

Методика виділення та культивування неонатальних кардіоміоцитів щура.
Неонатальні кардіоміоцити отримували з міокарду шлуночків дводенних
щурів шляхом ферментативного гідролізу за Reinecke H. et al. (1999) із
модифікаціями. Шлуночки відокремлювалися від передсердь, механічно
подрібнювалися ножицями, а отримані шматочки міокарда розміром 1-2 мм3
переносили у буферний сольовий розчин (рН 7.4) наступного складу: HEPES
— 20 мM/л, KCl — 5.4 мM/л, NaCl — 116.4 мM/л, глюкоза — 5.5 мM/л,
Na2HPO4 — 0.4 мM/л та K2HPO4 — 0.4 мM/л, що містив колагеназу ІІ типу
(95 ОД/мл) та панкреатин (0.6 мг/мл). Розчин попередньо оксигенувався
карбогеном. Кількість живих та загиблих клітин визначалася за допомогою
методу виключення 0.2 % розчину трипанового синього і становила 85-95 %
та 5-15 % відповідно. Клітини розміщували на скельця із щільністю 120
000 на 1 см2. Культивування проводилося при 37(С у газовому середовищі —
5% СО2 та 95% атмосферного повітря протягом 1 — 2 діб. Живильне
середовище складалося з наступних інгредієнтів: середовище Ігла в
модифікації Дюльбекко (DMEM), середовище 199 (співвідношення DMEM/199 —
4 : 1), теляча сироватка — 15%, Na2СО3 — 4.2 мМ/л, HEPES — 15 мМ/л та
антибіотики (стрептоміцин – 100 мкг/мл, гентаміцин – 0.05 мг/мл,
пеніцилін – 100 ОД/мл).

Моделювання аноксії-реоксигенації в культурі неонатальних кардіоміоцитів
щура. Аноксія-реоксигенація моделювалася шляхом подачі до клітин
безкисневої газової суміші 5% СО2 та 95% Ar протягом 30 хвилин із
наступною заміною живильного середовища та культивуванням клітин за
вихідних умов (5% СО2 та 95% атмосферного повітря) протягом 60 хвилин.
Аргон використовувався як інертний газ для виключення можливості
біологічного впливу азоту на культуру клітин.

Визначення різних видів клітинної смерті кардіоміоцитів при моделюванні
аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів. Кількість живих,
некротичних та апоптотичних клітин оцінювали цитологічно за допомогою
забарвлення кардіоміоцитів біс-бензимідом (Hoeсhst 33342) та пропідіум
йодидом в однаковій концентрації 8.75 мкМ/л. Перший з них проникає через
непошкоджену мембрану клітин і забарвлює ядерний хроматин, візуалізуючи
таким чином, живі та апоптотичні клітини (останні мають фрагментовані та
пікнотичні ядра). Пропідіум йодид не здатен проникати через плазматичну
мембрану і забарвлює лише ядра клітин з пошкодженою плазмолемою, тобто
некротичних. Для виявлення аутофагічних вакуолей застосовували
специфічний барвник – монодансилкадаверин в концентрації 50 мкМ
(прижиттєве забарвлення клітин). Специфічність забарвлення
підтверджували із застосуванням інгібітору аутофагії – N-3-метиладеніну
(100 мМ). Дані флуоресцентної мікроскопії по визначенню різних видів
клітинної смерті кардіоміоцитів також підтверджували із використанням
електронної мікроскопії.

Дослідження впливу інгібіторів протеасоми та біофлавоноїдів на
співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних
кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації. Інтактні кардіоміоцити
піддавали впливу різних концентрацій кверцетину (від 2.5 до 10 мкМ),
його водорозчинного аналогу “Корвітину” (від 2.5 до 10 мкМ) і
специфічного інгібітору протеасоми класто-лактацистин (-лактона (від 2.5
до 10 мкМ) протягом 90 хвилин. Після чого проводилося цитологічне
дослідження із застосуванням флуоресцентної мікроскопії чи визначення
активності протеасоми. В інших дослідах кверцетин (2.5 мкМ), “Корвітин”
(2.5 мкМ активної субстанції, тобто кверцетину) та специфічний інгібітор
протеасоми класто-лактацистин (-лактон (2.5 мкМ) додавалися в середовище
безпосередньо перед початком аноксії або одразу після аноксії (перед
реоксигенацією). Далі проводилося цитологічне дослідження із
застосуванням флуоресцентної мікроскопії.

Методика оцінки впливу “Корвітину” на протеасомну активність в
ізольованих моноцитах, лімфоцитах та нейтрофільних гранулоцитах крові
кроля. Із дотримання правил асептики та антисептики у кроля набирали
кров із крайової вени вуха та проводили розділення клітин у градієнтному
розчині перколу як описано вище. Одночасно внутрішньовенно вводили
розчин “Корвітину” (5 мг/мл) в розрахунку 5 мг на 1 кг маси тіла
тварини. Через 90 хв повторно брали кров з крайової вени вуха та
виділяли лейкоцити. Ізольовані клітини рахували в камері Горяєва,
пермеабілізували їхні мембрани додаванням сапоніну та руйнували їх за
допомогою ультразвукового диспергатору, а після цього проводили
біохімічні дослідження із визначення усіх трьох активностей протеасоми.

Методи статистичної обробки матеріалу. Отримані дані обробляли
статистично з використанням програми Excel 2000 та Оrigin 7.0. При цьому
вірогідність різниці середніх величин (Р<0.05) визначали за критерієм t Ст’юдента або (2-критерієм. Значення Р<0.05 вважали вірогідним. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Алельний поліморфізм гена ендотеліальної NO-синтази. Генотипування хворих за трьома сайтами ендотеліальної NO-синтази та порівняння отриманих даних із результатами рестрикційного аналізу в контрольній групі дозволило встановити, що частота певних варіантів цього гена є різною для промотору, екзону та інтрону (рис. 6, 7, 8). Рис. 6. Частота різних алельних варіантів промотору (Т-786?С) гена eNOS у практично здорових осіб (А) та хворих із гострим коронарним синдромом (Б). Так, співвідношення генотипів при аналізі Т-786(С поліморфізму промотору складає 49.4%, 34.7% та 15.9% відповідно (в групі практично здорових осіб (контроль) – 40.4%, 53.8%, 5.8%; Р=0.001 за (2-критерієм); при аналізі G894(T поліморфізму 7-го екзону – 34%, 58%, 8% (в контролі – 29%, 67%, 4%; Р>0.05), а при визначенні 4а/4b поліморфізму 4-го інтрону
– 64,5%, 31% и 4,5% (в контролі – 62,5%, 32,5%, 5%; Р>0.05). Важливо, що
розподіл вивчених алельних варіантів відповідав закону Харді-Вайнберга
(а2 + 2ab + b2 = 1, де а – частота нормальних алелей, а b – частота
варіантних).

Рис. 7. Частота різних алельних варіантів 7-го екзону гена eNOS у
практично здорових осіб (А) та хворих із гострим коронарним синдромом
(Б).

Достовірні відмінності при порівнянні з контрольною групою було
встановлено тільки по відношенню до поліморфізму промотору. В групі
донорів патологічний варіант С/С зустрічається в 2,7 рідше, ніж у хворих
із ГКС. Порівняти отримані дані із результатами інших дослідників
генетичних факторів ризику ГКС нам не вдавалося аж до 2004 року, коли
група корейських дослідників оприлюднила свої дані про частоту алельного
поліморфізму гена eNOS саме у хворих на цю форму ІХС (Park K.W. et al.,
2004(. Проте, наші дані не співпали – корейська та українська популяція
дуже відрізняються за розподілом алельних варіантів гена eNOS. Так,
частота Glu/Glu варіанту 7-го екзону у хворих на ГКС корейців становила
78%, Glu/Asp – 21.3%, а патологічного Asp/Asp – тільки 0.6%.

Достовірно відрізнялася у корейській популяції частота алельних
варіантів 4-го інтрону: генотип 4b/4b виявлено у 84.8% хворих на ГКС,
4b/4а – у 12.8%, а 4а/4а – у 2.4%. Поліморфізм промотору гена eNOS у
цьому дослідженні не вивчався.

Рис. 8. Частота різних алельних варіантів 4-го інтрону гена eNOS у
практично здорових осіб (А) та хворих із гострим коронарним синдромом
(Б).

Головний висновок, до якого всупереч переважній більшості робіт,
присвячених вивченню цього питання, приходять корейські вчені наступний
– наявність алелю 4а в генотипі зменшує ймовірність розвитку ГКС і може
розглядатися в якості протективного фактору в розвитку цієї форми ІХС.
Зовсім інші результати було оприлюднено у 2004 році італійськими
дослідниками (Fattini C. et al., 2004(. Вірогідність відмінності частоти
різних алельних варіантів промотору, 7-го екзону та 4-го інтрону була
встановлена по відношенню до усіх поліморфізмів, однак найбільшою вона
виявилася при порівнянні частоти алельних варіантів промотору у хворих
із ГКС і практично здорових осіб. Останній факт був особливо важливим з
огляду на результати отримані нами при дослідженні української популяції
хворих – саме патологічні варіанти за нашими даними збільшували
ймовірність розвитку ГКС. При порівнянні наших даних із отриманими
італійськими вченими також слід зазначити схожість у розподілі алельних
варіантів як промотору, так і 7-го екзону та 4-го інтрону гена eNOS. У
практично здорових осіб також переважають гетерозиготи за промотором та
7-м екзоном, а частка патологічних гомозигот значно збільшується у
хворих із ГКС.

Наші спільні з клініцистами спостереження за хворими на ГКС із
визначеним генотипом не співпадають із висновками, до яких прийшли
корейські кардіологи. За патологічного варіанту 4-го інтрону
(4а-поліморфізм) у корейців значно рідше спостерігалися повторні серцеві
“катастрофи” і перебіг захворювання був більш сприятливим. Наші
дослідження не дозволили встановити будь-який звґязок між поліморфізмом
4-го інтрону та ймовірністю розвитку чи особливостями перебігу ГКС.
Проте, результати тривалого спостереження за хворими (від 6 до 12
місяців) вказують, що розвиток щонайменше однієї події (смерть, інфаркт
міокарда, госпіталізація з приводу нестабільної стенокардії та ін.) до
так званого “комбінованого кінцевого пункту” як через 6, так і через 12
місяців спостереження реєструвалися вірогідно частіше у пацієнтів
гомозиготних за С-алелем промотору гена eNOS. При аналізі другого
“комбінованого кінцевого пункту” показано, що серед носіїв патологічного
С-алеля спостерігалася тенденція до більшої частоти несприятливих
коронарних подій протягом року спостереження. Важливо, що вплив генотипу
на прогресування захворювання був більш значним у групі курців. Тобто
нами було показано, що негативний вплив факторів тютюнопаління
найбільшою мірою реалізується за наявної генетичної схильності (Т-786(С
поліморфізму промотору гена eNOS).

Таблиця 2.

Частота різних алельних варіантів гена eNOS у дітей хворих на
есенціальну гіпертензію (EГ) та у практично здорових донорів.

Варіант

генотипу Промотор

T-786(C Екзон 7

G894(T Інтрон 4

4a/4b

Контроль

(n=84) EГ

(n=67) Контроль

(n=89) EГ

(n=84) Контроль

(n=84) EГ

(n=67)

AA, n (%)

Aa, n (%)

aa, n (%) 40 (48.2)

38 (45.8)

5 (6.0) 28 (41.8)

32 (47.8)

7 (10.4) 28 (31.5)

57 (64.0)

4 (4.5) 39 (46.4)

31 (36.9)

14 (16.7) 52 (62.7)

27 (32.5)

4 (4.8) 46 (68.7)

16 (23.9)

5 (7.5)

Вірогідність відмінності P=0.53 P=0.0006 P=0.45

Що стосується асоціації між алельним поліморфізмом промотору, 7-го
екзону та 4-го інтрону гена eNOS та артеріальною гіпертензією у дітей та
підлітків, то слід зазначити, що генетичні фактори розвитку есенціальної
гіпертензії у дитячому віці майже не досліджено, а про значення
алельного поліморфізму гена eNOS в патогенезі артеріальної гіпертензії у
дорослих нам вдалося знайти усього декілька робіт (Benjafield A.V.,
Morris B.J., 2000; Miyamoto Y. et al., 1998(. Нами вперше було показано
(таблиця 2), що Glu/Asp поліморфізм значно частіше зустрічається у дітей
та підлітків зі стійким підвищенням артеріального тиску і має більше
значення у розвитку артеріальної гіпертензії, навіть порівняно із
поліморфізмом 16-го інтрону гена ангіотензин-перетворюючого ферменту
(I/D поліморфізм).

Таким чином, нами було показано, що різні алельні варіанти гена eNOS
сприяють розвитку різних серцево-судинних захворювань – поліморфізм
промотору (T-786(C) асоціюється із ГКС у дорослих, а поліморфізм 7-го
екзону (G894(T) пов’язаний із виникненням артеріальної гіпертензії в
дитячому віці.

Експресія гена ендотеліальної NO-синтази та активність білка eNOS за
різних алельних варіантах промотору, 7-го екзону та 4-го інтрону.
Дослідження експресії гену eNOS та активності NO-синтази в тромбоцитах,
ізольованих від генотипованих за промотором, 7-м езоном та 4-м інтроном
осіб дозволили нам отримати нову інформацію про механізми фенотипової
реалізації різних алельних варіантів гена eNOS. Отримані дані свідчать
про те, що вміст РНК еNOS в тромбоцитах залежить від генотипу хворого
(рис. 9 та 10).

@

H

X

b

@

B

D

F

H

J

b

X

A

T

 h(e2ooooaaO?‚‚vvv

Oe0

Oe0

j

???????????З’ясувалося, що вміст матричної РНК еNOS найменший при С/С
генотипі промотору. У Т/Т гомозигот за сьомим екзоном вміст РНК менший,
ніж у нормальних гомозигот (G/G), однак перевищує такий у гетерозигот
(G/T). При поліморфізмі четвертого інтрону спостерігається протилежна
картина – вміст РНК у тромбоцитах людей з 4а/4а генотипом був вищим, ніж
у нормальних гомозигот та гетерозигот. У роботі Cattaruzza M. et al.
(2004) також було отримано дані про функціональну неповноцінність
промотору в разі заміни Т-786 на С. Кількість РНК еNOS та вміст білка
еNOS в ендотеліальних клітинах за звичайних умов культивування
відрізнявся у нормальних гомозигот (Т/Т), гетерозигот (Т/С) та
патологічних гомозигот (С/С) в незначній мірі, проте різко змінювався
при відтворенні тиску зсуву (shear stress). Аналогічні дані отримали
вчені при визначенні експресії гена eNOS в моноцитах: найменший рівень
спостерігався при С/С-генотипі промотору (Venturelli E. et al., 2005(.

Рис. 10. Рівень РНК eNOS в ізольованих тромбоцитах при різних алельних
варіантах промотору (А), 7-го екзону (Б) та 4-го інтрону (В) гену eNOS.
Середні дані, отримані при дослідженні 35 підлітків хворих на
артеріальну гіпертензію. * — P<0.05 порівняно з експресією гену eNOS при Т/Т генотипі промотору. Експресія генів в тромбоцитах, що були використані нами для вирішення цього питання, звісно, неможлива – ген еNOS транскрибується в кістковомозкових попередниках тромбоцитів (мегакаріоцитах). Однак, тромбоцити здатні використовувати РНК для синтезу білків на полісомах, а отже, зміни рівню РНК еNOS в цих клітинах також можуть впливати на рівень трансляції білка еNOS та його активність. При дослідженні активності еNOS в тромбоцитах нами було встановлено (рис. 11), що у носіїв С/С генотипу промотору NO-продукуюча здатність в 2.1 рази менша, ніж у нормальних гомозигот (Р=0.03), та у 2.9 рази нижча, ніж у гетерозигот (Р>0.05). Тобто, дані про експресію гену повністю
співпадають з напрямком змін активності еNOS при поліморфізмі промотору.
Активність еNOS при Т/Т варіанті 7-го екзону також менша, ніж у
нормальних гомозигот, однак різниця виявилася невірогідною. Аналогічна
ситуація спостерігається і при порівнянні активності еNOS за
поліморфізму інтрону. Активність ферменту була в 1.7 рази меншою у
носіїв генотипу 4а/4а порівняно із нормальними гомозиготами (P>0.05), та
у 1.9 рази меншою, ніж у гетерозигот (P>0.05). Позитивного зв’язку між
експресією гену еNOS та активністю ферменту еNOS при поліморфізмі
інтрону не спостерігається.

Рис. 11. Активність eNOS в ізольованих тромбоцитах при різних алельних
варіантах промотору (А), 7-го екзону (Б) та 4-го інтрону (В) гена eNOS.
* — P<0.05 порівняно з активністю eNOS при Т/Т генотипі промотору. Навпаки, на фоні підвищеної експресії в осіб з генотипом 4а/4а реєструвалася менша активність ферменту. Не виключено, що зчитування гену еNOS при цьому варіанті інтрону, дійсно, відбувається більш активно, проте РНК, що утворюється, є певною мірою дефектною і утворення більшої кількості молекул білка еNOS не відбувається, або цей білок має меншу каталітичну активність. Таким чином, отримані дані певною мірою пояснюють патогенетичне значення поліморфізму промотору гену еNOS. При порушенні коронарного кровообігу в індивідуумів з С/С варіантом промотору значно меншою мірою активується транскрипція гену eNOS, утворюється недостатня кількість молекул eNOS, яких не вистачає для синтезу додаткової кількості NO. Внаслідок цього судини розширюються меншою мірою, адгезія та агрегація тромбоцитів не попереджується і виявляються недостатніми інші механізми ангіо- та кардіопротекторної дії монооксиду азоту. Питання про функціональну реалізацію поліморфізму 7-го екзону та 4-го інтрону залишається відкритим та потребує проведення подальших досліджень. Алельний поліморфізм генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми. Робіт, присвячених ролі імунопротеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань нам знайти не вдалося, однак принципове значення цих мультикаталітичних комплексів у презентації внутрішьоклітинних антигенів та можливість експресії субодиниць імунопротеасоми в неімунних тканинах дали нам підстави сподіватися, що алельний поліморфізм генів LMP2 та LMP7 може мати значення в патогенезі ГКС чи артеріальної гіпертензії. Рис. 12. Частота алельних варіантів генів LMP2 (Arg60(His поліморфізм) та LMP7 (Lys145(Gln поліморфізм) у практично здорових індивідуумів (А) та у хворих із гострим коронарним синдромом (Б). Напротивагу до поліморфізму гену eNOS, генетична варіабельність генів LMP2 та LMP7 при захворюваннях людини вивчена надзвичайно мало, а при серцево-судинних захворюваннях не вивчалася зовсім. За даними генотипування розподіл частот різних алельних варіантів генів LMP2 і LMP7 був майже однаковим в контрольній групі та у хворих із ГКС (рис. 12). Співвідношення Arg/Arg, Arg/His і His/His варіантів при аналізі поліморфізму гена LMP2 становило 52%, 40.5% і 7.5% відповідно (в контролі – 53.8%, 38.7%, 7.5%; Р>0.05 за (2-критерієм). Алельні варіанти
гена LMP7 розподілилися наступним чином: Lys/Lys – 89.5%, Lys/Gln –
10.5%, Gln/Gln – 0% (в контролі – 93.8%, 6.2%, 0% відповідно; Р>0.05).
Отже, серед 360 генотипованих осіб не було жодної гомозиготи (Gln/Gln).
Це свідчить про те, що в українській популяції цей поліморфізм гена LMP7
зустрічається надзвичайно рідко. Отримані дані свідчать про те, що
розподіл частот алельних варіантів генів LMP2 і LMP7 не відрізняється в
контрольній групі та в групі хворих із ГКС. Перед усім результати
дослідження дозволяють зробити висновок про еволюційну консервативність
генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми. Попри те, що гени LMP2 і
LMP7 розташовані в надзвичайно варіабельній ділянці 6-ої хромосоми в
комплексі з генами, які кодують білки головного комплексу
гістосумісності, на сьогодні описано тільки по одному SNP. Ідентичність
розподілу алельних варіантів цих генів у хворих із ГКС та у практично
здорових осіб опосередковано свідчить про те, що імунні механізми не
грають провідної ролі в ініціації атеросклеротичного ураження коронарних
судин. Вочевидь, алельний поліморфізм інших генів, зокрема
ендотеліальної NO-синтази, значно більшою мірою впливає на ймовірність
розвитку серцево-судинних захворювань.

Експресія генів LMP2 та LMP7 та пептидазна активність протеасоми при
різних варіантах алельного поліморфізму LMP2 та LMP7. В результаті
проведених функціонально-генетичних досліджень нам вдалося встановити
значення алельного поліморфізму гена LMP2 у змінах пептидазної
(трипсиноподібної та хімотрипсиноподібної) активності протеасоми (рис.
13).

Рис. 13. Трипсиноподібна (А) та хімотрипсиноподібна (Б) активність
протеасоми в ізольованих моноцитах осіб із різними алельними варіантами
LMP2. 1 — Arg/Arg, 2 — Arg/His, 3 — His/His. АМС —
7-аміно-4-метилкумарин. * — P<0.05 порівняно з активністю при Arg/Arg генотипі. Так, трипсиноподібна активність протеасоми при генотипі Arg/Arg була вище, ніж при генотипі His/His та нижче порівняно з гетерозиготами. Хімотрипсиноподібна активність протеасоми відрізнялася у носіїв різних алельних варіантів аналогічним чином. Найбільша активність спостерігалася у гетерозигот, а найменша – у гомозигот His/His. Найбільш цікавим, на нашу думку, є те, що заміна амінокислоти в субодиниці протеасоми, що забезпечує пептидиглютаміл пептид-гідролазну активність, суттєво впливає на пептидазну (трипсино- та хімотрипсиноподібну) активність інших субодиниць. Це може свідчити про те, що ця заміна впливає на конформацію внутрішнього кільця протеасоми і здатність інших субодиниць імунопротеасоми розщеплювати відповідні субстрати змінюється. Також не виключено, що встановлені зміни активності залежать від процесів зборки чи деградації імунопротеасоми, спричинені заміною аргініну на гістидин. За даними Kisselev A.F. et al. (2003) специфічні інгібітори пептидилглютаміл пептид-гідролазного сайту ізольованої 20S-протеасоми втричі збільшують трипсиноподібну активність, однак не впливають на хімотрипсиноподібну. Одночасно субстрати (1-субодиниці (містять залишки кислих амінокислот) за алостеричним механізмом зменшують хімотрипсиноподібну активність, а гідрофобні субстрати (5-субодиниці за рахунок взаємодії з некаталітичними субодиницями протеасоми збільшують активність усіх пептидазних сайтів. Таким чином, є підстави вважати, що пептидилглютаміл пептидгідролазний сайт як конформаційно, так і функціонально впливає на активність інших субодиниць. Зважаючи на те, що пептидилглютаміл пептидгідролазна активність зменшується при формуванні імунопротеасоми, можна припустити, що заміна аргініну на гістидин в LMP2 при алельному поліморфізмі збільшує вказану активність, за рахунок чого зменшується трипсиноподібна активність мультикаталітичного протеїназного комплексу. Вплив протеасоми та її інгібіторів на активність ендотеліальної NO-синтази. Вивчення функціонального звґязку між протеасомним протеолізом та активністю продукції монооксиду азоту ендотеліальною NO-синтазою дозволило отримати нові дані з цієї проблеми. Зокрема, нам вдалося встановити, що протеасомний протеоліз може суттєво впливати на активність продукції NO ізольованими тромбоцитами, а саме збільшувати активність eNOS. При інкубації тромбоцитів із протеасомною фракцією ІІ із ретикулоцитів кроля (PF II) активність еNOS збільшувалася на 24,6% (Р=0,02). Метильований убіквітин і класто-лактацистин (-лактон значною мірою нівелювали цей ефект (рис. 14). Рис. 14. Активність ендотеліальної NO-синтази в ізольованих тромбоцитах кроля. 1 – контроль, 2 – інкубація з протеасомною фракцією II (PF II), 3 - інкубація з PF II при додаванні класто-лактацистин в-лактона, 4 - інкубація з PF II при додаванні метильованого убіквітина. * - P<0.05 порівняно з контролем. Рис. 15. Активність ендотеліальної NO-синтази в ізольованих тромбоцитах кроля. 1 – контроль, 2 – інкубація з протеасомною фракцією II після впливу на клітини перекису водню (1 мМ), 3 – вплив перекису водню (1 мМ) протягом 30 хв. * - P<0.05 порівняно з контролем. Таким чином, протеасомній деградації за вказаних умов, вочевидь, зазнає не власно еNOS, а якийсь негативний регулятор її активності. Ми припустили, що для запуску убіквітинізації і розщеплення протеасомою еNOS необхідна певна модифікация протеїну. В з’язку з цим ми попередньо інкубували тромбоцити з 1 мМ Н2О2, маючи на думці те, що окиснення білка еNOS ініціює процес убіквітинізації. Проте, активність еNOS в тромбоцитах, оброблених Н2О2, після інкубації із PF II зростала ще більшою мірою, перевищуючи контрольні значення на 51.3% (рис. 15). Результати наших дослідів добре узгоджуються з даними Govers R. et al. (2003), згідно до яких інгібітори протеасоми (класто-лактацистин бета-лактон та MG132) за 1 годину інкубації попереджують агоніст-індуковане підвищення активності еNOS в ендотеліальних клітинах. При цьому кількість білка еNOS та регулятора активності цього ферменту - кавеоліна-1 - не змінювалася. Результати дослідження дозволили припустити наявність інгібітору еNOS, відмінного від кавеоліна-1 в ендотеліальних клітинах. Отримані нами дані також підтверджують наявність в тромбоцитах інгібітору, що зазнає протеасомного протеолізу протягом однієї години інкубації. Серед можливих кандидатів на роль цього інгібітору, слід перед усім вказати на інші види кавеолінів (кавеолін-2 та 3). Ці гомологічні кавеоліну-1 білки також коекспресуються в плазматичній мембрані разом із еNOS та пригнічують її активність. Відносно кавеоліна-3 отримано дані про можливість його протеасомної деградації, бо інгібітори протеасоми сприяли накопиченню кавеоліна-3 в плазматичній мембрані (Galbiati F. et al., 2000(. У якості іншого негативного регулятора активності еNOS можна розглядати білок CHIP (carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein), який за рахунок ремоделювання молекулярного шаперона еNOS білка HSP90 переводить еNOS з розчинної форми у нерозчинну неактивну форму. Важливо, що CHIP виконує роль убіквітин-лігази для деяких “клієнтів” HSP90, однак, даних про убіквітинізацію еNOS під впливом CHIP досі не отримано. Таким чином, можна говорити, що CHIP також може підлягати протеасомній деградації і саме за рахунок цього підвищується активність еNOS за дії протеасомної фракції. У 2001-2002 роках було відкрито ще два білкових регулятора еNOS - NOSTRIN (eNOS traffic inducer) и NOSIP (eNOS interacting protein) (Zimmermann K. et al., 2002(. Обидва білки здатні пригнічувати активність еNOS за рахунок передислокації ферменту до субмембранних вакуолярних структур або за рахунок інших механізмів. Ці білки також можна внести до переліку претендентів на роль інгібітору, який зазнає протеасомної деградації. Протеасомна деградація рекомбінантної ендотеліальної NO-синтази. В результаті експериментів із рекомбінантною eNOS бика встановлено, що після інкубації із протеасомною фракцією ІІ, що містить усі компоненти для убіквітинізації та протеасомної деградації в принципі усіх внутрішньоклітинних білків ссавців, активність рекомбінантної eNOS вірогідно знижується на 9.4 % (Р<0.0001), а інгібітор протеасоми (MG132) попереджує падіння активності ферменту (рис. 16). Останній факт підтверджує, що саме протеолітична активність протеасоми забезпечує зменшення активності eNOS. Рис. 16. Активність рекомбінантної eNOS бика (eNOS (rec)) до та після інкубації із протеасомною фракцією ІІ (PF II), а також за впливу інгібітору протеасоми MG 132 та метильованого убіквітину (MeUb). Наведено дані пґяти окремих експериментів. * - Р<0.05 порівняно з вихідною активністю, ** - Р<0.05 порівняно з впливом тільки протеасомної фракції. Застосування метильованого убіквітину, що запобігає елонгації поліубіквітинового ланцюга, також зменшувало ступінь пригнічення активності рекомбінантної eNOS після інкубації із протеасомною фракцією. Таким чином, пригнічення активності рекомбінантної eNOS мало убіквітин-залежний характер, тобто під час інкубації із протеасомною фракцією відбувалася убіквітинізація та поліубіквітинізація рекомбінантного ферменту, а метильований убіквітин перешкоджав цьому процесу. Отримані дані дають підстави для висновку про можливість убіквітин-залежної протеасомної деградації ендотеліальної NO-синтази, принаймні за умов in vitro. Звичайно, безпосередньо екстраполювати цей факт на умови цілої клітини або організму не можна. Ступінь пригнічення протеасомною фракцією рекомбінантної eNOS була не такою вже значною – до 10% в різних серіях експерименту, що дозволяє припускати наявність більш ефективних, порівняно із протеасомним протеолізом, протеолітичних систем, які мають здатність більш еффективно розщеплювати цей фермент як за штучних умов, та і in vivo. Протеасомна деградація матричної РНК різних ізоформ NO-синтази. Важливим показником експресії будь-якого гена є стабільність інформаційних РНК (іРНК), що утворюється внаслідок транскрипції та сплайсингу. У роботах французьких дослідників було доведено, що протеасома має окрім трьох пептидазних ще й РНК-азну активність (Petit F. et al., 1997(. Застосувавши молекулу РНК вірусу табачної мозаїки, вони показали, що як ціла протеасома, так і окремі її субодиниці (zeta та iota) проявляють рибонуклеазну активність. В сучасних роботах припускається, що від активності протеасомного протеолізу залежить строк напівжиття молекул РНК, а врешті-решт рівень експресії певних білків у клітинах. Виходячи з вищенаведеного, та зважаючи на практично повну відсутність даних про можливість руйнування специфічних еукаріотичних РНК ми дослідили можливість протеасомної деградації РНК різних ізоформ NO-синтази. Застосування розробленого нами методу визначення РНК-азної активності протеасоми із використанням зворотної транскрипції з наступною полімеразною ланцюговою реакцією дозволило встановити, що 26S протеасома з PF II ефективно розщеплює РНК (рис. 17 та 18). Рис. 17. Вплив протеасомної фракції ІІ (PF II) на результати зворотної транскрипції з наступною амплификацією генів актину та легких ланцюгів міозину. 1 – інкубація РНК с PF II; 2 - інкубація РНК з PF II при додаванні класто-лактацистин (-лактона (4 мкмоль); 3 – інкубація РНК з класто-лактацистин (-лактоном (4 мкмоль); 4 – контрольна проба (тільки РНК). Інтенсивність протеасомної та РНКазної деградації РНК не відрізняються, тобто ефективність руйнування молекул РНК під дією протеасоми відповідає такій у РНКаз. Також результати дослідів вказали, що класто-лактацистин (-лактон пригнічує РНК-азну активність протеасоми тільки в разі достатньо довгої інкубації із PF II (протягом 2 годин), практично повністю попереджуючи деградацію РНК актину и міозину (Р=0.01). Важливо, що класто-лактацистин (-лактон не впливав на перебіг зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, бо інкубація цього інгібітору з РНК не впливала на кінцевий результат (яскравість ампліфікату). Рис. 18. Вплив протеасомної фракції ІІ (PF II) на результати зворотної транскрипції з наступною амплификацією гену легких ланцюгів міозину. 1 – контрольна проба (тільки РНК); 2 - інкубація РНК з PF II протягом 60 хв; 3 - інкубація РНК з комбінацією рибонуклеаз протягом 60 хв; 4 - інкубація РНК з PF II, що знаходилася протягом 2 годин при температурі 36(С; 5 - інкубація РНК с PF II, на яку протягом 2 годин впливав класто-лактацистин (-лактон (4 мкмоль); 6 – додавання PF II безпосередньо перед зворотною транскрипцією РНК. Також було встановлено, що компоненти PF II не впливають на процес зворотної транскрипції та ампліфікації, тому що додавання PF II безпосередньо перед початком зворотної транскрипції не змінювало кількість продукту полімеразної ланцюгової реакції. В експериментах з оцінкою впливу PF II на результати ампліфікації генів різних ізоформ NO-синтаз було отримано аналогічні результати (рис. 19) – інкубація РНК з PF II призводила до руйнування РНК і як наслідок не утворювалися ампліфікати відповідних генів (Р=0.01). Таким чином, за нашими результатами якоїсь специфічності або вибірковості у деградації РНК протеасомою не спостерігається. Рис. 19. Вплив протеасомної фракції ІІ (PF II) на результати зворотної транскрипції з наступною амплификацією генів різних ізоформ NO-синтази: iNOS (доріжки 1 – 3), eNOS (доріжки 4 – 6), nNOS (доріжки 7 – 9). 1, 4, 7 - контрольна проба (тільки РНК); 2, 5, 8 - інкубація РНК з PF II протягом 60 хв; 3, 6, 9 - інкубація РНК з PF II протягом 60 хв при додаванні олігонуклеотиду 5`-gtgcctttgggctcctccaaggtg-3`. М – маркер молекулярної маси. Наша спроба попередити руйнування певних РНК із застосуванням олігонуклеотиду, що відповідає послідовності нуклеотидів у РНК iNOS, виявилася невдалою – деградація РНК відбувалася так само інтенсивно (рис. 19). Слід визнати, що вивчення РНКазної активності протеасоми знаходиться на початковому рівні. Досі остаточно не з’ясовано, які саме субодиниці протеасоми забезпечують здатність цього макромолекулярного комплексу до руйнування РНК. В роботі Petit F. та співав. (1997) наводяться докази того, що некаталітичні (по відношенню до білків) (-субодиниці протеасоми (zeta та iota) відповідають за РНКазну активність, а перша з них виявляється в клітинах переважно (60-70 %) у мономерному стані як в ядрі, так і в цитоплазмі. В наших експериментах вперше показано, що специфічний інгібітор протеасоми, який взаємодіє саме з пептидазними каталітичними (-субодиницями, пригнічує РНКазну активність протеасоми. Не виключено, що під впливом цього інгібітору змінюється конформація усього комплексу і це призводить до порушення здатності протеасоми руйнувати РНК чи зв’язуватися з відповідними послідовностями в молекулах РНК. Пошук ендогенних та синтетичних регуляторів саме РНКазної активності в цьому аспекті відкриває великі перспективи як в розумінні фундаментальних механізмів регуляції стабільності молекул РНК та синтезу білків, так і в можливостях цілеспрямованого впливу на ці процеси опосередковано через протеасомний протеоліз. Вплив кверцетину на пептидазні активності протеасоми. Отримавши докази залучення протеасоми в регуляцію активності eNOS як на етапі матричної РНК, так і білка, ми замислилися над можливим практичним застосуванням речовин, що впливають на активність протеасоми, як модуляторів продукції монооксиду азоту. Використання інгібіторів протеасоми з цією метою ускладнюється їх надзвичайною високою вартістю та можливими побічними реакціями організму на введення синтетичних речовин. Поштовх у вирішенні цього питання ми отримали після ознайомлення з роботою, виконаною під керівництвом доктора Ping Dou, що була опублікована у 1998 році. У цій роботі автори навели незаперечні докази того, що поліфеноли із зеленого чаю здатні пригнічувати активність протеасоми, причому ефективність інгібіції відповідає такій у специфічних інгібіторів протеасоми. Структурна аналогія між епігалокатехін-3-галатом, що виявляв найбільшу активність, та біофлавоноїдом кверцетином, властивості якого як кардіопротектору тривалий час вивчалися у відділі експериментальної кардіології під керівництвом академіка О.О.Мойбенка, була настільки очевидною, що ми припустили можливість впливу кверцетину на активність протеасоми. Рис. 20. Вплив специфічного інгібітору протеасоми та кверцетину на активність пурифікованої 20S протеасоми. А - хімотрипсиноподібна, Б – трипсиноподібна, В – пептидилглютаміл пептид-гідролазна активність протеасоми. Р<0.05 порівняно з контролем в усіх експериментах. В експериментах з пурифікованою 20S протеасомою нами вперше показано, що кверцетин дозозалежно пригнічує усі три пептидазні активності протеасоми, причому ступінь пригнічення співставляється з такою при застосуванні специфичного інгібітору протеасоми (рис. 20). Найбільшою мірою кверцетин, як і специфічний інгібітор, пригнічує хімотрипсиноподібну активність 20S протеасоми – від 80 % до 65 % залежно від концентрації. Трипсиноподібна активність знижувалася на 30 - 10 %, а пептидилглютаміл пептид-гідролазна – на 61 – 50 %. Класто-лактацистин в-лактон виявляє, звичайно, більшу здатність пригнічувати гідроліз специфічних пептидних субстратів. Аналогічним чином кверцетин пригнічує активність 26S протеасоми з PF II, однак ефективність інгібування гідролізу специфічних пептидних субстратів була меншою, ніж у класто-лактацистин (-лактона. Рис. 21. Вплив кверцетину (5 мкМ) та класто-лактацистин (-лактона (5 мкМ) на хімотрипсиноподібну (А), трипсиноподібну (Б) та пептидилглютаміл пептидгідролазну (В) активність протеасоми в ізольованих кардіоміоцитах. * - Р<0.05 порівняно з контролем. При визначенні активності протеасоми в ізольованих кардіоміоцитах було отримано наступні результати (рис. 21): кверцетин на 63.7 % (Р = 0.04) пригнічував хімотрипсиноподібну активність протеасоми, на 26 % (Р = 0.03) - трипсиноподібну і на 34.2 % (Р = 0.16) - пептдилглютаміл пептидгідролазну. Ефект класто-лактоцистин (-лактону був, звичайно, більш вираженим і вірогідно знижувалася активність гідролізу усіх трьох флуорогенних субстратів. Таким чином, проведені нами експерименти повністю підтвердили гіпотезу про здатність біофлавоноїдів пригнічувати акивність протеасоми. Таблиця 3. Кількість (%) живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів в контролі, при моделюванні аноксії-реоксигенації та за впливу класто-лактацистин (-лактона (2.5 мкМ), кверцетину (2.5 мкМ) і “Корвітину” (2.5 мкМ). Кількість клітин (%) Живі Некротичні Апоптотичні Контроль n =10 89.8 ± 0.90 3.2 ± 0.33 5.8 ± 0.73 Аноксія-реоксигенація (30-60 хв) n = 10 79.1 ± 1.31 P1 < 0.001 7.7 ± 1.11 P1 < 0.001 11.9 ± 1.04 P1 < 0.001 Класто-лактацистин (-лактон + аноксія-реоксигенація n = 7 85.9 ± 0.47 P < 0.001 P1 = 0.0046 4.0 ± 0.42 P = 0.015 P1 = 0.18 6.57 ± 0.40 P < 0.001 P1 = 0.44 Кверцетин + аноксія-реоксигенація n = 5 88.3 ± 0.77 P < 0.001 P1 = 0.32 P2 = 0.02 4.3 ± 0.93 P = 0.07 P1 = 0.18 P2 = 0.69 5.1 ± 0.64 P < 0.001 P1 = 0.55 P2 = 0.07 “Корвітин” + аноксія-реоксигенація n = 5 89.1 ± 0.77 P < 0.001 P1 = 0.67 P2 = 0.003 4.9 ± 0.82 P = 0.11 P1 = 0.04 P2 = 0.3 5.3 ± 0.70 P = 0.001 P1 = 0.65 P2 = 0.12 P – вірогідність відмінностей порівняно з аноксією-реоксигенацією; P1 - вірогідність відмінностей порівняно з контролем; P2 – вірогідність відмінностей порівняно з впливом класто-лактацистин (-лактону при аноксії-реоксигенації. Кверцетин дозозалежно пригнічував і активність пурифікованої протеасоми і протеасомну активність в культурі неонатальних кардіоміоцитів. Порівняння його властивостей із відомими інгібіторами протеасоми (класто-лактацистин в-лактон, MG 132) показало, що він незначно поступається цим речовинам у здатності інгібувати пептидазні активності макромолекулярного протеїназного комплексу. Підтвердженням отриманих нами даних стала робота тієї самої дослідницької групи Ping Dou. У травні 2005 року вони оприлюднили свої дані про антипротеасомні властивості кверцетину та ряду інших біофлавоноїдів ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Chen+D%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Chen D . et al., 2005(. У цій роботі також наводяться дані про здатність кверцетину спричинювати загибель пухлинних клітин за рахунок пригнічення активності протеасоми і робиться висновок про перспективність застосування біофлавоноїдів при лікуванні чи профілактиці пухлинних захворювань. Однак, кверцетин, а більшою мірою його водорозчинний аналог “Корвітин”, вже знайшли застосування в лікуванні серцево-судинних захворювань (Пархоменко О.М. та ін., 2005( і, можливо, певною мірою кардіопротекторні властивості біофлавоноїдів реалізуються за рахунок впливу на активність протеасоми. Ми перевірили це припущення у дослідах на культивованих кардіоміоцитах і встановили, що в низьких концентраціях (5 мкМ) кверцетин, так само як і “Корвітин”, здатний попереджувати розвиток некротичної та апоптотичної загибелі клітин при відтворенні аноксії-реоксигенації (таблиця 3). Збільшення концентрації препарату спричинювало загибель клітин як запрограмованим (апоптоз та аутофагія), так і незапрограмованим шляхом. Традиційні інгібітори протеасоми (класто-лактацистин в-лактон, MG 132) виявляли аналогічні властивості, що дозволило нам зробити висновок про те, що пригнічення активності протеасоми під час аноксії-реоксигенації є одним з найбільш важливих механізмів дії кверцетину як кардіопротектору. Ми добре усвідомлювали, що за введення препарату внутрішньовенно, коли неминучою стає взаємодія кверцетину із різноманітними факторами крові, які можуть зв’язувати та інактивувати біофлавоноїд може суттєво знизити здатність цієї речовини впливати на активність внутрішньоклітинної протеїнази. Чи буде кверцетин за умов цілісного організму впливати на активність протеасоми так само, як на ізольовані клітини (кардіоміоцити чи тромбоцити)? Рис. 22. Вплив “Корвітину” (5 мг/кг маси тіла) на хімотрипсиноподібну (А), трипсиноподібну (Б) та пептидилглютаміл пептидгідролазну (В) активність протеасоми в ізольованих нейтрофільних гранулоцитах кроля. * - Р<0.05 порівняно з контролем. Саме для з’ясування цього питання ми провели експерименти із визначення активності протеасоми в лейкоцитах крові, які виділялися з крові кролів до введення водорозчинного аналогу кверцетину “Корвітину” та через 90 хвилин після інґєкції. Концентрація препарату відповідала лікувальній дозі (5 мг/кг), яку було встановлено в експериментах на собаках та підтверджено в кардіологічній клініці. Результати експериментів показали, що через 90 хвилин після внутрішньовенного введення “Корвітину” протеасомна активність в ізольованих лейкоцитах змінюється по-різному в залежності від виду клітин, в яких вимірювалася хімотрипсиноподібна, трипсиноподібна та пептидилглютаміл пептидгідролазна активність мультикаталітичного протеїназного комплексу. Усі три пептидазні активності протеасоми значно пригнічувалися у нейтрофільних гранулоцитах (рис. 22). Хімотрипсиноподабна активність знижувалася у 2.3 раза (Р=0.038), трипсиноподібна – в 2.1 раза (Р=0.09), а пептидилглютаміл пептидгідролазна – в 2.6 раза (Р=0.047). У моноцитах та лімфоцитах ці зміни були менш суттєвими. Значне зменшення активності протеасоми саме у нейтрофільних гранулоцитах – це факт, що має велике практичне значення, бо саме нейтрофільні гранулоцити становлять переважну більшість клітин в інфільтраті ішемізованого органу. Саме ці клітини несуть відповідальність за вторинну альтерацію та поширення зони інфаркту як серця, так і будь якого іншого органу, навіть після відновлення кровотоку. Отже, є усі підстави вважати, що кардіопротекторні властивості “Корвітину” реалізуються, зокрема, за рахунок впливу на протеасомний протеоліз як у кардіоміоцитах, так і в нейтрофільних гранулоцитах. ВИСНОВКИ Сучасними роботами в галузі патологічної фізіології та медичної генетики доведено, що індивідуальні особливості генетичної інформації людини можуть обумовлювати розвиток не тільки відомих моногенних спадкових захворювань, але й полігенних патологій, в тому числі і найбільш поширених серцево-судинних захворювань. Важливим підходом до ідентифікації генотипу людини є визначення алельного поліморфізму генів, зокрема тих, що пов’язані із хворобами серця та судин, серед яких ген ендотеліальної NO-синтази має виняткове значення. 1. При дослідженні частоти алельного поліморфізму промотору (Т-786?С), 7-го екзону (G894?T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази показано, що С/С варіант промотору в 2.7 рази частіше зустрічається у хворих на гострий коронарний синдром, ніж у практично здорових осіб. 2. У виникненні есенціальної артеріальної гіпертензії у дітей та підлітків має значення алельний поліморфізм 7-го екзону (G894?T) гена ендотеліальної NO-синтази – Т/Т варіант виявлявся у хворих втричі частіше, ніж у практично здорових осіб. 3. Інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази на 35% менша при С/С генотипі промотору, ніж за Т/Т варіанту промотору, а активність продукції NO тромбоцитами людей з С/С варіантом промотору у 2.1 рази менша, ніж при Т/Т генотипі, що вказує на функціональне значення цього алельного поліморфізму як одного із патогенетичних механізмів серцево-судинних захворювань. 5. Поліморфізм генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7), дуже рідко зустрічається в українській популяції, а розподіл різних алельних варіантів цих генів не відрізняється у хворих на серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів. 6. Експресія генів LMP2 та LMP7 не залежить від алельного поліморфізму зазначених генів, проте хімотрипсиноподібна та трипсиноподібна активність протеасоми в ізольованих моноцитах залежить від поліморфізму гена LMP2: за алельного варіанту Arg/Arg спостерігається зменшення пептидазних активностей протеасоми, а гетерозиготи (Arg/His) відрізняються найбільшою активністю макромолекулярного протеїназного комплексу. 8. Доведено, що протеасома приймає участь в регуляції активності ендотеліальної NO-синтази в ізольованих тромбоцитах кроля - активація протеасомного протеолізу спричинює вірогідне підвищення активності ферменту на 25 %, а інгібітори протеасоми та метильований убіквітин запобігають цьому ефекту. За умов in vitro рекомбінантна ендотеліальна NO-синтаза також зазнає убіквітин-залежної протеасомної деградації. 9. За допомогою розробленого нами методу доведено, що матричні РНК різних ізоформ NO-синтази розщеплюються 26S протеасомою, а інгібітор протеасоми класто-лактацистин (-лактон пригнічує РНКазну активність протеасоми. Цей факт свідчить про участь протеасомного протеолізу в регуляції активності NO-синтази як на посттранскрипційному, так і посттрансляційному рівні. 10. Кардіопротекторні механізми дії біофлавоноїду кверцетину пов’язані із впливом на протеасомний протеоліз, бо зазначений препарат дозозалежно пригнічує усі три пептидазні активності пурифікованої протеасоми та активність цього протеїназного комплексу в культивованих неонатальних кардіоміоцитах. При цьому кверцетин запобігає некротичній та апоптотичній загибелі культивованих кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації, однак не зменшує кількість клітин, що гинуть шляхом аутофагії. 13. Внутрішньовенне введення водорозчинного аналогу кверцетину “Корвітину” призводить до значного пригнічення активності протеасоми в нейтрофільних гранулоцитах, що дозволяє використовувати цей лікувальний препарат з метою регуляції активності протеасомного протеолізу при серцево-судинних захворюваннях. 14. Проведені генетичні та патофізіологічні дослідження підтримують сучасний напрямок у медичній генетиці, що відкриває нові можливості ранньої діагностики та індивідуалізації лікування серцево-судинних захворювань за принципами фармакогенетики. Список опублікованих праць за темою дисертації Биць Ю.В., Досенко В.Є., Медведєв В.В. Роль апоптозу в патогенезі атеросклерозу // Фізіологічний журнал.- 2000.-Т. 46.- №5.-С.83-93. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко О.О., Пархоменко О.М. Патофізіологічні аспекти генетичного поліморфізму ендотеліальної NO-синтази // Фізіологічний журнал.-2003.-Т.48.-№6.-С.86-102. Веремеенко К.Н., Досенко В.Е., Нагибин В.С., Кизим А.И., Мойбенко А.А. Протеолитические ферменты и апоптоз // Укр. биохимический журнал.–2003.-Т., №4.-С.20-34. Нагібін В.С., Досенко В.Є., Пивовар С.М., Мойбенко О.О., Ягупольский Л.М. Фторований аналог діазоксиду попереджує апоптоз неонатальних кардіоміоцитів під час аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, № 3.-С.3-9. Досенко В.Е., Прудников И.М., Цывкин В.Н., Мойбенко А.А. Протеасомальная активность в синаптосомах структур головного мозга при пролонгированном иммобилизационном стрессе // Нейрофизиология.- 2004.-Т.36, №2.-С.121-127. Тумановська Л.В., Досенко В.Є., Нагібін В.С., Макогон Н.В., Мойбенко О.О. Апоптотична, аутофагічна та онкотична загибель кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, №5.-С.11-18. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Нагибін В.С., Тумановська Л.В. Особливості клітинної смерті кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Клінічна та експериментальна патологія.-2004.-Т.ІІІ, №2.-С.30-32. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Лутай Я.М., Пархоменко О.М., Мойбенко О.О. Алельний поліморфізм промотору гену ендотеліальної NO-синтази (Т-786?С) як генетичний предиктор гострого коронарного синдрому // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №1.-С.72-76. Досенко В.Є., Лутай Я.М., Загорий В.Ю., Пархоменко А.Н., Мойбенко А.А. Частота аллельного полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы у больных с острым коронарным синдромом в украинской популяции // Цитология и генетика.-2005.-Т.39.-№2.-С.49-54. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние протеасомного протеолиза на активность NO-синтазы в изолированных тромбоцитах // Укр. биохимический журнал.-2005.-T.77.-С.39-42. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Хайтович Н.В., Гордок О.А., Мойбенко О.О. Алельний поліморфізм гену ендотеліальної NO-синтази та його функціональні прояви // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №2.-С.39-45. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture // Фізіологічний журнал.-2005.Т.51.- №3.-С.12-17. Досенко В.E., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Изменения протеасомальной активности и активности нейтральных протеиназ в тканях головного мозга крыс при старении // Нейрофизиология.-2005.-Т.37.-№1.-С.11-14. Пархоменко А.Н., Лутай Я.М., Досенко В.E., Довгань Н.В., Мойбенко А.А. Распространенность, патогенетическое и прогностическое значение полиморфизма промотора гена эндотелиальной NO–синтетазы у больных с острым коронарным синдромом // Укр. кардіол. журнал.- 2005.-№4.-С.20-27. Мойбенко А.А., Досенко В.E., Нагибин В.С. Ферментативные механизмы апоптоза // Пат. физиология и экспериментальная терапия.-2005.-№3.-С.17-26 Досенко В.Є. Метод оцінки функціонального значення алельних варіантів гена ендотеліальної NO-синтази // Лабораторна діагностика.-2005.-№2.-С.47-52. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Изменения протеасомальной активности и активности нейтральных протеиназ в лейкоцитах крови и в головном мозге при старении // Успехи геронтологии.-2005.-Вып.17.-С.102-107. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Нагибин В.С., Мойбенко А.А. Влияние N-3-метиладенина на пептидазную и рибонуклеазную активность протеасомы // Укр. биохимический журнал.-2005.-Т.77, №5.-С.52-56. Досенко В.Є., Михальчук Д.В., Загорий В.Ю., Пархоменко А.Н., Мойбенко А.А. Частота аллельного полиморфизма генов, кодирующих каталитические субъединицы иммунопротеасомы, у больных с острым коронарным синдромом // Цитология и генетика.-2005.-Т.39, №6.-С.50-54. Досенко В.Є., Михальчук Д.В., Загорий В.Ю., Хайтович М.В., Мойбенко А.А. Функціональне значення алельного поліморфізму генів, що кодують каталітичні субодиниці імунопротеасоми // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №6.-С.3-10.. Досенко В.Є., Пашевін Д.О., Биць Ю.В., Мойбенко О.О. Зміни активності протеасоми в тканинах аорти при пролонгованому імобілізаційному стресі // Клін. та експерим. патологія.-2005.-Т.4, №2.-С.32-36. Досенко В.Є., Нагибин В.С., Тумановская Л.В., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние кверцетина на активность 20S, 26S протеасомы и протеасомную активность в изолированных кардиомиоцитах // Биомедицинская химия.- 2006.-Т.52, №2.-С.138-145. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Лутай Я.М., Хайтович М.В., Пархоменко О.М. Алельний поліморфізм гену ендотеліальної NO-синтази у хворих на серцево-судинні захворювання // Доповіді НАН України.-2005.-№12.-С.173-176. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко А.А. Протеасомна деградація РНК різних ізоформ NO-синтази // Фізіологічний журнал.-2006.-Т.52, №1.-С.3-7. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Proteasomal proteolysis in anoxia-reoxygenation, preconditioning and postconditioning of isolated cardiomyocytes // Pathophysiology.-2006.-Vol. 13, N2.-P.119-125. Dosenko V.E., Zagoriy V.Yu., Lutay Y., Parkhomenko A., Moibenko A.A. Allelic polymorphism of promoter (T-786?C), but not that of exon 7 (G894?T) or VNTR in intron 4 of the endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with acute coronary syndrome in the Ukrainian population // Clin. Exp. Cardiol.-2006.-Vol.11, N1.-P.11-13. Dosenko V.E., Zagoriy V.Yu., Haytovich N.V., Gordok O.A., Moibenko A.A. Allelic polymorphism of endothelial NO-synthase gene and its functional manifestations // Acta Biochem. Pol.-2006.-Vol. 53, N2.-P.299-302. Хайтович М.В., Досенко В.Є. Вплив генетичних поліморфізмів генів ангіотензин-перетворюючого ферменту та ендотеліальної синтази оксиду азоту на ефективність антигіпертензивної терапії у дітей з артеріальною гіпертензією // Педіатрія, акушерство та гінекологія.-2005.-№3.-С.42. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Moibenko A.A. Phosphocreatine (neoton) prevents necrotic and apoptotic death of cardiomyocytes in modelling of anoxia-reoxygenation // J. Mol. Cell. Cardiol.-2004.-Vol.36.-Issue 5.-P.746. Dosenko V.E., Prudnikov I.M., Cyvkin V.N., Moibenko A.A.Increase of proteasomal activity in cortex and hippocampus synaptosomes in prolonged immobilization stress // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.24. Dosenko V.E., Mikhalchyuk D.V., Moibenko A.A. Association between allelic variant of immunoproteasome subunits (LMP2, LMP7) and acute coronary syndrome // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.15. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Proteasomal activity in isolated neonatal cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.13. Zagoriy V.Yu., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Age-related changes of proteasomal activity in blood leukocytes and in brain // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.23. Nagibin V.S. xe "Nagibin, V. S." , Dosenko V.E. xe "Dosenko, V. E." , Tumanovskaya L.V. xe "Tumanovskaya, L. V." , Moibenko xe "Moibenko, O. O." O.O. Apoptotic and autophagic death of cardiomyocytes in anoxia–reoxygenation and at inhibition of proteasome activity // Abstracts of 12th Euroconference on apoptosis, (Chania, 17-20 Sept. 2004).-P.117. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Autophagic cell death of cardiomyocytes in anoxia–reoxygenation is prevented by postconditioning. KATP-channels dependent effect // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.58. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A. Proteasome inhibitors as agents of pharmacological preconditioning // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.161. Dosenko V., Nagibin V., Tumanovskaya L., Yuzkiv M., Moybenko A., Vaage J. Postconditioning in cultured cardiomyocytes: role of proteasomal proteolysis and ATP-sensing K+ channels // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromsш, June 21-25, 2005).-Р.1017. Dosenko V., Zagoriy V., Parkhomenko A., Moybenko A. Allelic polymorphism of endothelial NO-synthase gene and its functional manifestations // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromsш, June 21-25, 2005).-Р.1083. Lutay Y., Parkhomenko A., Dosenko V., Dovgan N., Moibenko A. Endothelial NOS gene promoter polymorphism has negative prognostic impact after ACS that can be facilitated by smoking // Eur. Heart J.-2005.-Vol.26.-P.156. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovska L.V., Moybenko A.A., Vaage J. Proteasome inhibitors reproduce preconditioning and postconditioning in cardiomyocyte culture // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 40, Abstracts 26th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Manchester, June 14-17, 2006).-Р.936. АНОТАЦІЇ Досенко В.Є. Роль алельного поліморфізму генів ендотеліальної NO-синтази та протеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань: молекулярно-генетичні аспекти. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006. Дисертацію присвячено вивченню ролі алельного поліморфізму гена ендотеліальної NO-синтази та генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми, в патогенезі серцево-судинних захворювань. При дослідженні частоти алельного поліморфізму промотору (Т-786?С), 7-го екзону (G894?T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази показано, що С/С варіант промотору в 2.7 рази частіше зустрічається у хворих на гострий коронарний синдром, ніж у практично здорових осіб. Інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази на 35% менша при С/С генотипі промотору, ніж за Т/Т варіанту промотору, а активність продукції NO тромбоцитами людей з С/С варіантом промотору у 2.1 рази менша, ніж при Т/Т генотипі, що вказує на функціональне значення цього алельного поліморфізму. Розподіл різних алельних варіантів генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7) не відрізняється у хворих на серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів. За допомогою розробленого нами методу доведено, що матричні РНК різних ізоформ NO-синтази розщеплюються 26S протеасомою, а це свідчить про участь протеасомного протеолізу в регуляції активності NO-синтази як на посттранскрипційному, так і посттрансляційному рівні. В експериментах in vitro та на культурі кардіомоцитів показано, що кардіопротекторні механізми дії біофлавоноїду кверцетину пов’язані із впливом на протеасомний протеоліз. Ключові слова: ендотеліальна NO-синтаза, протеасома, алельний поліморфізм, серцево-судинні захворювання. Досенко В.Е. Роль аллельного полиморфизма генов эндотелиальной NO-синтазы и протеасомы в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний: молекулярно-генетические аспекты. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006. Представлены результаты определения аллельного полиморфизма промотора (Т-786?С), 7-го экзона (G894?T) и 4-го интрона (4b/4a) гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) у больных с острым коронарным синдромом. Установлено, что соотношение аллельных вариантов при анализе Т-786(С полиморфизма промотора составляет 48%, 36% и 16% (в контроле – 48%, 46%, 6%; Р<0.05 по (2-критерию); при анализе G894(T полиморфизма 7-го экзона – 34%, 58%, 8% (в контроле – 29%, 67%, 4%; Р>0.05), а при
определении 4b/4a полиморфизма 4-го интрона – 64,5%, 31% и 4,5% (в
контроле – 62,5%, 32,5%, 5%; Р>0.05). Полученные даные свидетельствуют о
том, что С/С вариант промотора гена eNOS имеет отношение к увеличению
вероятности развития острого коронарного синдрома в украинской
популяции. При этом в развитии эссенциальной артериальной гипертензии у
детей и подростков имеет значение аллельный полиморфизм 7-го экзона
(G894?T) гена eNOS – Т/Т вариант встречался у больных в три раза чаще,
чем у практически здоровых индивидуумов. Интенсивность экспресии гена
eNOS на 35% меньше при С/С генотипе промотора, чем при Т/Т варианте, а
активность продукции NO тромбоцитами людей с С/С вариантом промотора в
2.1 раза менше, чем при Т/Т генотипе, что указывает на функциональное
значение этого аллельного полиморфизма. Также представлены результаты
определения аллельного полиморфизма генов, кодирующих большие
мульфункциональные протеазы LMP2 (Arg60(His) и LMP7 (Lys145(Gln).
Установлено, что соотношение аллельных вариантов Arg/Arg, Arg/His и
His/His при анализе полиморфизма гена LMP2 составило 52%, 40.5% и 7.5%
соответственно (в контроле – 53.8%, 38.7%, 7.5%; Р>0.05 по (2-критерию).
Распределение аллельных вариантов гена LMP7 было следующим: Lys/Lys –
89.5%, Lys/Gln – 10.5%, Gln/Gln – 0% (в контроле – 93.8%, 6.2%, 0%
соответственно; Р>0.05). Полученные даные свидетельствуют о том, что
полиморфизм генов, кодирующих каталитические субъединицы протеасомы, не
влияет на вероятность развития острого коронарного синдрома в украинской
популяции. В экспериментах на изолированных тромбоцитах показано, что
при воздействии протеасомной фракции ІІ (PF II) из ретикулоцитов кролика
изменяется активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). При
инкубации соницированных тромбоцитов с PF II активность еNOS
увеличивалась на 24.6% (Р=0.02). Метилированный убиквитин и
класто-лактоцистин (-лактон в значительной степени нивелировали этот
эффект. С помощью разработанного метода показано, что матричные РНК
различных изоформ NO-синтазы расщепляются 26S протеасомой, а ингибитор
протеасомы класто-лактацистин (-лактон подавляет РНКазну активность
протеасомы, а это свидетельствуют об участии убиквитин-зависимого
протеасомного протеолиза в регуляции активности eNOS в регуляции
активности NO-синтазы как на посттранскрипционном, так и
посттрансляционном уровне. Установлено, что кардиопротекторные механизмы
действия биофлавоноида кверцетина связаны с влиянием на протеасомный
протеолиз, т.к. указанный препарат дозозависимо угентает пептидазные
активности пурифицированной протеасомы и активность этого протеиназного
комплекса в культивированных кардиомиоцитах. При этом кверцетин
предупреждает некротическую и апоптотическую гибель кардиомиоцитов при
моделировании аноксии-реоксигенации.

Ключевые слова: эндотелиальная NO-синтаза, протеасома, аллельный
полиморфизм, сердечно-сосудистые заболевания.

Dosenko V.E. The role of endothelial NO-synthase and proteasome allelic
polymorphism in pathogenesis of cardio-vascular disease: molecular and
genetic aspects. – Manuscript.

Thesis for a doctor of science degree by speciality 14.03.04 –
pathological physiology. – O.O. Bogomolets Institute of Physiology, NAS
of Ukraine, Kyiv, 2006.

The work is devoted to investigation of the role of promoter (Т-786?С),
exon 7 (G894?T) and intron 4 (4b/4a) of endothelial NO-synthase (eNOS)
and LMP2 (Arg60(His) and LMP7 (Lys145(Gln) allelic polymorphism in
pathogenesis of cardio-vascular disease. Obtained data show that С/С
promoter variant of eNOS is in 2.7-fold more frequent at patients with
acute coronary syndrome, than in practically healthy subjects. Level of
eNOS gene expression is on 35% less at the C/C genotype, than at the T/T
variant of promoter. Activity of NO production in platelets of people
with the C/C variant of promoter is in 2.1 times less than it is at the
T/T genotype. It specifies to the functional value of this allelic
polymorphism. Distribution of different allelic variants of LMP2 and
LMP7 genes does not differ in patients with cardio-vascular disease and
in practically healthy subjects. With the use of developed method it was
shown that mRNA of different NOS іsoform hydrolyzed by 26S proteasome,
which indicates the participation of proteasomal proteolysis in
regulation of the eNOS activity both on posttranscriptional and
posttranslational levels. In vitro and cardiomyocyte culture experiments
was shown that the cardioprotective mechanisms of quercetin are related
to influence on proteasomal proteolysis.

Key words: endothelial NO-synthase, proteasome, allelic polymorphism,
cardio-vascular disease.

PAGE 1

**

**

Б

А

4

3

2

1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *