Прозапальні цитокіни периферичної крові на початкових етапах формування цукрового діабету 1 та 2 типу (автореферат)

Міністерство Охорони Здоров’я УКРАЇНИ

національний медичний університет

імені о.о. богомольця

АНАСТАСІЙ ЛІЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 616.379-008.64:616.155.3

Прозапальні цитокіни периферичної крові на початкових етапах формування
цукрового діабету 1 та 2 типу

14.03.08 –імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українському науково-практичному центрі ендокринної
хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Малижев Вадим Олексійович

Український науково-практичний центр

ендокринної хірургії, трансплантації

ендокринних органів і тканин МОЗ України,

завідувач лабораторії клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Мельников Олег Феодосійович, Інститут
отоларингології імені проф. О.С. Коломійченка АМН України, завідувач
лабораторії патофізіології та імунології;

доктор медичних наук, професор Чумак Анатолій Андрійович, Науковий центр
радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії молекулярної
біології відділу клінічної імунології.

Провідна установа

Інститут фтизіатрії та пульмонології імені Ф.Г. Яновського, лабораторія
імунології, АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться 16.02.2006 р. о 13-30 на засіданні спеціалізованої
вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті імені
О.О. Богомольця (Київ, вул. Шовковична, 39/1. Центральна міська клінічна
лікарня, корпус 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця (03057, Київ-057, вул. Зоологічна,
1).

Автореферат розісланий 06.01.2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Впродовж останніх 20 років захворюваність на діабет
як 1-го, так і 2-го типів у всьому світі значно зросла та набула
епідемічного характеру [Zimmet P., 2001], тому дослідження питань
патогенезу цих захворювань мають велике соціальне і медичне значення.

Діабет 1-го типу належить до класичних органоспецифічних аутоімунних
захворювань. Для нього характерний переважний розвиток клітинних імунних
реакцій, ефектори яких, Т-цитотоксичні лімфоцити, виконують руйнівну дію
щодо бета-клітин [Alkinson M.A., 1994]. Паралельно у цьому процесі
важливу, якщо не вирішальну, роль відіграють прозапальні цитокіни
активованих макрофагів і Т-лімфоцитів, а саме: інтерлейкін-1 (ІЛ-1),
тумор-некротичний фактор альфа (ТНФ?) та інтерферон-гамма. Їх взаємодія
з бета-клітинами призводить до накопичення в останніх оксиду азоту та
інших вільних радикалів, що активують гени програмованої смерті,
продукти яких ініціюють апоптоз інсулінопродукуючих клітин [Rabinovitch
A., 1998].

За цукрового діабету 2-го типу характерними є інсулінорезистентність і
повільне прогресуюче падіння синтезу інсуліну [Gerich J.E., 1998].
Обидва ці феномени формуються внаслідок дії низки чинників, серед яких
велике значення мають прозапальні цитокіни. Руйнування бета-клітин за
даного типу діабету може здійснюватися за рахунок стимулюючої дії ТНФ?
на синтез ІЛ-1 резидентними макрофагами острівців із подальшою
взаємодією його з бета-клітинами [Kwon G., 1999], та/або внаслідок
цитотоксичної дії вільних жирних кислот, що накопичуються в останніх
завдяки ліполітичній дії ТНФ? [Unger R.H., 1997].

Отже, за цукрового діабету обох типів прозапальні цитокіни відіграють
вирішальну роль щодо втрати бета-клітинами інсулінопродукуючої функції,
з одного боку, а з іншого – вони ж причетні і до формування
інсулінорезистентності, яка найбільш характерна для діабету 2-го типу
[Greenberg A.S., 2002]. Слід також зазначити, що продукція прозапальних
цитокінів за діабету 1-го типу є результатом активації специфічних
імунних реакцій адоптивного імунітету [Roep B.O., 2003 ]. За діабету
2-го типу їх синтез пов’язано з дисфункцією жирової тканини або з
патологією вродженого імунітету [Pickup J.C., 1998; Felber J.P., 2002].

Проте питання щодо ролі прозапальних цитокінів у патогенезі цукрового
діабету 1-го та 2-го типів залишається далеко не визначеним. Результати
низки досліджень цитокінового профілю в периферичній крові хворих тварин
і людей, клітинного та цитокінового спектру in situ та результати, що
отримані в дослідах in vitro в умовах культури клітин, виявилися
фрагментарними та суперечливими. Тому вони не можуть бути використані
для детальнішого аналізу ролі означених біологічно активних речовин в
генезі цукрового діабету 1-го та 2-го типів. Немає і можливості
визначити їх цінність для моніторингу перебігу та лікування цукрового
діабету, що само по собі є складною задачею за багатьох патологій
[Бережна Н.М., 2004]. Ці обставини вимагають подальшого дослідження
проблеми, вирішення якої, безперечно, є актуальним для клінічної
імунопатології цукрового діабету.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема
дисертаційної роботи тісно пов’язана та органічно витікає з
науково-дослідних робіт, які виконувалися в лабораторії клінічної
імунології Українського науково-практичного центру ендокринної хірургії,
трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України у 2000-2004
роках: “Функціонування макрофагально-хелперної ланки імунітету на ранніх
етапах розвитку цукрового діабету типу 1 та 2” (№ держреєстрації
0101U002690) і “Стан неспецифічної ланки імунітету при розвитку
цукрового діабету типу 2” (№ держреєстрації 0102U000740).

Мета роботи. Оцінити діагностичну та прогностичну значущість визначення
вмісту прозапальних цитокінів у периферичній крові на початкових етапах
формування цукрового діабету 1-го та 2-го типів у хворих людей.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі
завдання:

Дослідити вміст ТНФ?, ІЛ-1?, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові осіб
групи ризику щодо розвитку цукрового діабету 1-го типу.

Визначити вміст ТНФ?, ІЛ-1?, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові хворих
із вперше виявленим цукровим діабетом 1-го типу.

Дослідити можливість визначення вмісту в периферичній крові прозапальних
цитокінів як маркерів перебігу аутоімунного руйнування ?-клітин.

Дослідити вміст цитокінів (ТНФ?, ІЛ-1?, ІЛ-10 та ІЛ-12) у хворих із
вперше виявленим цукровим діабетом 2-го типу.

Визначити характер зв’язку між рівнем цитокінів і станом метаболізму у
хворих на цукровий діабет 2-го типу.

Дослідити особливості розподілу основних популяцій лімфоїдних клітин та
субпопуляцій Тх1 і Тх2 лімфоцитів у периферичній крові хворих на
цукровий діабет 1-го та 2-го типів.

З’ясувати діагностичну та прогностичну цінність визначення цитокінів у
периферичній крові хворих на цукровий діабет 1-го та 2-го типів.

Об’єкт дослідження: механізми формування неспецифічних імунних реакцій.

Предмет дослідження: вміст імуноцитів і прозапальних цитокінів у
периферичній крові хворих на перших етапах формування цукрового діабету
1-го та 2-го типів.

Методи дослідження: загальноклінічні, імуногенетичні,
цитофлуориметричні, імуноферментні, радіоімунні, біохімічні,
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Основні положення, що
характеризують новизну результатів дослідження та виносяться на захист,
зводяться до такого:

Перебіг цукрового діабету 1-го та 2-го типу супроводжується певними
змінами системного вмісту таких цитокінів, як ТНФ?, інтерлейкін-1?,
інтерлейкін-10 та інтерлейкін-12. Ці зміни, з одного боку, відображають
перебіг даної патології, а з іншого – є причиною формування різних її
проявів.

Формування та розвиток цукрового діабету 1-го типу відбувається на тлі
підвищеної продукції інтерлейкіну-12 і генерації Тх1-лімфоцитів, що може
віддзеркалювати певну поломку механізмів підтримання імунної
толерантності на периферії та пояснювати переважання розвитку за цього
захворювання клітинних реакцій аутоагресії.

Вміст у сироватці крові хворих на цукровий діабет 1-го типу ТНФ? корелює
зі ступенем руйнування ?-клітин, виступаючи маркером інтенсивності
перебігу запального процесу в острівцях Лангерганса.

Формування цукрового діабету 2-го типу супроводжується розвитком
хронічного стресу, що є причиною характерної для даної патології
вторинної імунної недостатності, яка характеризується зниженням
кількості в периферичній крові основних субпопуляцій лімфоїдних клітин.

За цукрового діабету 2-го типу відбуваються певні зміни вмісту
прозапальних цитокінів у периферичній крові. Знайдено, що ТНФ? тісно
пов’язаний із формуванням інсулінової резистентності, тоді як
інтерлейкін-1 може бути одним із чинників, які впливають на характер
функціонування ?-клітин підшлункової залози – від стимуляції до
інгібіції, що є характерним для динаміки розвитку цукрового діабету
цього типу. Водночас, притаманні даному захворюванню метаболічні зсуви,
зокрема гіперглікемія, є причиною довготривалого збереження підвищеної
активності цитокін-продукуючих елементів і тим самим сприяють
прогресуванню хвороби.

Практичне значення. Отримані дані вказують на суттєву роль прозапальних
цитокінів у процесах формування та перебігу цукрового діабету 1-го і
2-го типів, що може бути використано як додаткові критерії діагностики,
прогнозування та моніторингу даних захворювань.

На основі проведених досліджень запропоновано для окреслення ступеня
ризику розвитку цукрового діабету 1-го типу визначати у периферичній
крові інтерлейкін-12 як доповнюючий критерій, спроможний значно
підвищити надійність передклінічної діагностики. Доцільним, на нашу
думку, є динамічне визначення в крові хворих із вперше діагностованим
цукровим діабетом 1-го типу ТНФ? як маркера інтенсивності імунного
запалення для планування тактики лікування цієї патології, включаючи
імунотропну та протизапальну терапію.

Визначені системне підвищення рівня прозапальних цитокінів у крові
хворих на вперше виявлений цукровий діабет 2-го типу та їх роль у
формуванні метаболічних зсувів є свідченням того, що дана патологія
перебігає на тлі хронічного запального процесу. Це обумовлює доцільність
використання в клінічній практиці не лише цукрознижувальних препаратів,
але й комплексної терапії, спрямованої на пригнічення запалення та
синтезу прозапальних цитокінів.

Особистий внесок здобувача. Ідеї дисертаційної роботи запропоновано
науковим керівником д.мед.н. Малижевим В.О. Разом із науковим керівником
створено методологічну основу роботи, адекватну меті та завданням.
Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз
літературних даних, зібрано матеріал, виконано імунологічні дослідження,
їх обґрунтування та статистичну обробку отриманих даних, сформульовано
основні висновки та практичні рекомендації. Імуногенетичні дослідження
(фенотипування) виконано спільно зі співробітниками лабораторії
імунології Інституту хірургії та трансплантології АМН України.
Запозичення дослідів інших авторів відсутні.

За цикл робіт за темою дисертації автора було відзначено стипендією
Кабінету Міністрів України (2000-2001 рр.).

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлено
та обговорено на конференціях і з’їздах: ІV Українська науково-практична
конференція з актуальних питань алергології, клінічної та лабораторної
імунології (Київ, 1999); Науково-практична конференція, присвячена
80-річчю Інституту фармакотерапії ендокринних захворювань “Актуальні
проблеми фармакотерапії ендокринних захворювань” (Харків, 1999); 36-ий
Щорічний конгрес EASD (Єрусалим, Ізраїль, 2000); V Науково-практична
конференція “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної
імунології” (Київ, 2000); 17-ий Конгрес Міжнародної діабетичної
федерації (Мехіко, Мексика, 2000); Науково-практична конференція
“Цукровий діабет 2 типу – епідемія ХХІ сторіччя. Сучасне та майбутнє”
(Київ, 2003).

Публікації. Основні положення дисертації представлені у 12 публікаціях у
вітчизняних і зарубіжних виданнях і повністю відображають матеріали
дисертаційної роботи. Серед них 5 статей у фахових виданнях,
рекомендованих ВАК України, 7 – у матеріалах і тезах конференцій і
конгресів.

Структура дисертації. Робота складається зі вступу, огляду літератури,
розділу, в якому викладено матеріали та методи дослідження, 2 розділів
власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів,
висновків, практичних рекомендацій і списку використаних літературних
джерел. Загальний обсяг дисертаційної роботи складає 140 сторінок
машинописного тексту, включаючи 17 таблиць і 21 рисунок. Список
використаних джерел містить 212 публікацій, серед них 18 – кирилицею та
194 – латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Досліджено 253 хворих на цукровий діабет
1-го та 2-го типів.

Для формування групи дітей і підлітків з ознаками схильності до
захворювання на діабет обстежено дітей від 128 сімей, в яких
зареєстровано випадки захворювання на цукровий діабет 1-го та 2-го
типів. Внаслідок проведеного моніторингу відібрано 33 дітей і підлітків
із фенотипом DR3+, DR4+ і DR3+/DR4+. У даної групи осіб (перша
досліджувана група) у подальшому визначали вміст у периферичній крові
таких цитокінів, як IЛ-1?, ТНФ?, IЛ-10, IЛ-12.

Другу досліджувану групу (80 хворих) склали хворі з вперше виявленим
цукровим діабетом 1-го типу (ЦД1) і терміном захворювання до 5 років.

Третя група складалася з 45 хворих із вперше виявленим цукровим діабетом
2-го типу (ЦД2) віком від 41 до 76 років і тривалістю захворювання (за
анамнестичними даними) від 0,5 місяця до 3 років.

Контрольну групу представлено 82 практично здоровими донорами
відповідного віку і статі.

Усі хворі на ЦД1 під час спостережень перебували на інтенсивній
інсулінотерапії. Хворим на цукровий діабет 2-го типу призначали
секретагог інсуліну – репаглінід (НовоНорм, Данія). Репаглінід не
проявляє екстрапанкреатичної дії, а отже, і це суттєво, він не може
прямо впливати на продукцію прозапальних цитокінів як жировими
клітинами, так і макрофагами. Доза репаглініду добиралася для кожного
хворого індивідуально та коливалася від 0,5 до 3,0 мг на прийом перед
кожним вживанням їжі.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою методів
варіаційної статистики та кореляційного аналізу. Вивчали також характер
функціональних взаємозв’язків між одержаними параметрами з урахуванням
аналітичного представлення для непараметричної регресії з побудовою
відповідних графіків [Лапач С.Н., 2000].

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення. При дослідженні дітей
з ознаками схильності до розвитку цукрового діабету встановлено, що
63,6% із них народилися у сім’ях, в яких батько або мати хворіють на
ЦД1, а 36,4% — на ЦД2. Результати вивчення вмісту цитокінів у
периферичній крові цих дітей представлено в табл. 1, з якої видно, що за
відсутності ознак порушень вуглеводного обміну у них визначається
достовірне зниження рівня С-пептиду в сироватці крові, на тлі чого
відбувається збільшення концентрації цитокінів, характер розподілу яких
залежить від типу цукрового діабету у родичів. Так, у дітей із
позитивним сімейним анамнезом на ЦД1 достовірно збільшився рівень у
крові TНФ? та IЛ-12 (р<0,05). Водночас за наявності ЦД2 у сім’ї спостерігалося збільшення в крові дітей концентрації IЛ-1? і TНФ?. Таблиця 1 Вміст цитокінів у периферичній крові дітей і підлітків, у сім’ях яких зареєстровано захворювання на цукровий діабет Показники Донори (контроль) (n=15) Позитивний сімейний анамнез на цукровий діабет 1-го типу (n=21) 2-го типу (n=12) C-пептид (нг/мл) 6,93(0,74 3,33(0,61* 3,3(0,92* IЛ-1( (пкг/мл) 30,89(4,95 44,98(7,98 91,84(29,16* TНФ? (пкг/мл) 21,64(2,39 39,57(8,26* 47,59(9,72* IЛ-10 (пкг/мл) 1,33(0,47 2,43(1,06 0,82(0,78 IЛ-12 (пкг/мл) 63,79(7,9 117,69(19,53* 76,38(22,4 Примітка. * – p< 0,05 відносно контрольної групи. Отже, встановлено, що, по-перше, успадковуватися може не лише цукровий діабет 1-го, а й 2-го типу. По-друге, вже на етапі схильності до захворювання знайдено зміни у концентрації ряду цитокінів. Дітям від батьків, хворих на ЦД1, притаманне збільшення вмісту TНФ? та IЛ-12. Останній у цьому випадку представляє особливий інтерес, оскільки він є специфічним індуктором розвитку клітинних реакцій імунітету, що характерно для цукрового діабету саме 1-го типу. Інша картина спостерігалася в осіб групи ризику, в сім’ях яких діагностувався ЦД2. Характерним для останніх було достовірне збільшення в крові вмісту IЛ-1? та TНФ?. Наступні дослідження були спрямовані на вивчення рівня циркулюючих цитокінів в осіб з клінічно-визначеним цукровим діабетом, які були розподілені на групи з С-пептид-позитивним та С-пептид-негативними діабетом (табл. 2). Таблиця 2 Вміст цитокінів у периферичній крові хворих на цукровий діабет 1-го типу Групи обстежених n IЛ-1(, пг/мл TНФ(, пг/мл IЛ-10, пг/мл IЛ-12, пг/мл IЛ-12/ IЛ-10 Контрольна група 20 20,25(2,1 24,65(2,2 1,72(0,7 43,77(5,3 25,45 Хворі на С-пептид-позитивний ЦД: 1. Вперше виявлений 2. з трив. ( 1 року 3. з трив. 1-3 років 4. з трив. 3-5 років 14 17 14 16 93,88(25,3(( 55,11(22,17 40,13(7,5((( 45,88(7,1((( 54,68(9,4(( 31,53(4,9 39,9(5,1(( 32,47(5,2 1,04(0,8 1,8(0,7 2,03(0,8 1,17(0,7 84,07(13,5(( 90,47(19,6((( 137,1(37,2((( 86,8(6,3( 80,8 50,26 67,54 74,19 Хворі на С-пептид-негативний ЦД 10 46,77(6,1( 29,38(3,03 3,44(1,5 111,9(20,9(( 32,53 Примітки: ( – р(0,001 відносно донорів; (( – р(0,01 відносно донорів; ((( – р(0,05 відносно донорів. Хворі з вперше виявленим ЦД1 мали вірогідно вищі показники рівнів IЛ-1? (р(0,01), TНФ? (р(0,01) та IЛ-12 (р(0,01) відносно донорів. При цьому співвідношення IЛ-12/IЛ-10 перевищувало аналогічне у донорів у 3,1 разу. Група обстежених, термін хвороби яких складав менше року, вірогідно відрізнялась від донорів лише за вмістом IЛ-12 (р(0,05). Зростання терміну захворювання супроводжувалося появою вірогідних відмінностей між вмістом прозапальних цитокінів у хворих і донорів. Цікавими виявилися дані щодо вмісту інтерлейкінів у хворих на ЦД1, в яких була відсутня власна інсулінопродукція. Вміст IЛ-1? та IЛ-12 також вірогідно відрізнявся від такого у донорів та у хворих із С-пептид-позитивним діабетом. У них зберігалося і високе співвідношення IЛ-12/IЛ-10. Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що у хворих на С-пептид-позитивний ЦД1 відбувається системне збільшення концентрації IЛ-1?, TНФ? та IЛ-12. Ці дані можуть свідчити про ймовірний запальний процес в острівцях Лангерганса за умови збереження залишкової кількості (-клітин, а отже і специфічного антигенного стимулу. Більш вагомими, на наш погляд, є отримані результати щодо системної концентрації IЛ-12. Вражаючим є той факт, що вірогідне збільшення його вмісту в крові визначалося як у хворих на С-пептид-позитивний, так і на С-пептид-негативний ЦД1. Саме це може бути причиною відхилення імунної відповіді у бік розвитку клітинних імунних реакцій за ЦД1, оскільки IЛ-12 індукує диференціювання Тх1 лімфоцитів. У хворих на С-пептид-негативний ЦД1 паралельно визначено і збереження підвищеного рівня в крові IL-1(. Опосередковано це може вказувати на певну активацію функціональної активності макрофагів, не пов’язану з антигенною стимуляцією. Можна припустити, що така активація макрофагів і пов’язана з нею гіперпродукція IЛ-12 є конститутивно обумовленими, що, можливо, є основною причиною формування ЦД1 у генетично схильних до цієї хвороби людей. Характер розподілу IЛ-10 та IЛ-12, визначений нами, передбачає і відповідні зміни вмісту основних субпопуляцій Т-хелперів – Тх1 і Тх2. Не виключено також, що диспропорція регуляторних цитокінів може певною мірою вплинути і на субпопуляційний склад лімфоїдних клітин у цілому. Але, попри наявність запальної імунної реакції в острівцях Лангерганса, ми не виявили жодних змін у субпопуляційному складі лімфоїдних клітин у периферичній крові. Можливо, це пояснюється кінцевим етапом запальної реакції та відносно невеликою кількістю лімфоїдних клонів, задіяних у патологічному процесі. Більш показовими є дані, які було одержано при дослідженні кількості Тх1 і Тх2 клітин. Знайдено, що у хворих на цукровий діабет відбувається збільшення відносної кількості Тх1 лімфоцитів порівняно з їх вмістом у донорів (р<0,05). Паралельно визначалося і збільшення співвідношення Тх1/Тх2 – від 1,26±0,1 у донорів до 2,5±0,4 у дітей, хворих на ЦД1 (р<0,05). Отже, на фазі С-пептид-позитивного ЦД1 у крові хворих відбувається не лише зростання концентрації IЛ-12, але й збільшення числа Тх1 лімфоцитів, що є відображенням переважаючого перебігу в осередку запалення (острівці Лангерганса) клітинних реакцій імунітету. Щодо цукрового діабету 2-го типу, основною метою досліджень було визначення вмісту прозапальних цитокінів у периферичній крові хворих із вперше виявленим ЦД2 та їх взаємозв’язку з основними метаболічними і гормональними порушеннями. Досягнення за допомогою репаглініду стану компенсації вуглеводного обміну, за даними вимірювання рівня глюкози та глікованого гемоглобіну, супроводжувалося поліпшенням самопочуття хворих, зменшенням вмісту С-пептиду, сироваткового інсуліну, тригліцеридів, СТГ, коливаннями вмісту конрінсулярних гормонів та холестерину. На тлі зареєстрованих метаболічних порушень знайдено певні зміни і в концентрації цитокінів у периферичній крові хворих. Як видно з табл. 3, у нелікованих пацієнтів визначається достовірно підвищений рівень у крові TНФ? з одночасним збільшенням концентрації IЛ-10 і зменшенням співвідношення IЛ-12/IЛ-10 – з 47,96 у донорів до 7,83 у нелікованих хворих. Протягом лікування відбувалося зниження рівня в крові IЛ-1?, яке досягало вірогідності через 4 місяці після початку лікування (р(0,01). Щодо TНФ? ситуація дещо інша. Через 1 місяць після лікування відбувалося суттєве збільшення його концентрації в крові, яка майже у 3 рази перевищувала нормальний рівень (р(0,001). Проте через 4 місяці вміст цього цитокіну в крові знижувався і практично досягав рівня показників донорів. Лікування хворих протягом 1 місяця не викликало змін концентрації в крові IЛ-10, але через 4 місяці після застосування репаглініду вона знизилася нижче контрольного рівня більше ніж у 3 рази (р(0,05). Поліпшення метаболізму глюкози під впливом репаглініду не позначилося на вмісті в крові іншого цитокіну, а саме IЛ-12. Проведені кореляційний та регресивний аналізи дозволили зробити припущення про існування певних функціональних зв’язків між цитокінами та показниками метаболізму. Таблиця 3 Вміст цитокінів у периферичній крові хворих на цукровий діабет 2-го типу перед і під час лікування репаглінідом Групи обстежених n IЛ-1(, пг/мл TНФ?, пг/мл IЛ-10, пг/мл IЛ-12, пг/мл Донори 15 13,84(3,2 17,28(1,8 1,33(0,47 63,79(7,9 Хворі до лікування 27 11,64(3,03 29,66(3,39 (( 5,98(2,62 46,82(7,3 Хворі через 1 міс. після лікування 27 9,13(2,13 41,12(7,44 ( 6,41(4,01 52,27(8,98 Хворі через 4 міс. після лікування 27 2,97(0,7(,( 20,84(1,63 ( 0,29(0,2 52,68(8,41 Примітки: ( – р(0,001 порівняно з донорами; (( – р(0,02 порівняно з донорами; ( – р(0,02 порівняно з хворими перед лікуванням; ( – р(0,01 порівняно з хворими перед лікуванням. У цілому, на основі одержаних даних можна дійти висновку, що дійсно прозапальні цитокіни ТНФ? та ІЛ-1 відіграють важливу роль у формуванні основних метаболічних зсувів за ЦД2. Щодо ТНФ?, у хворих перед лікуванням між цим цитокіном і показниками глюкози та С-пептиду явного кореляційного зв’язку не виявлялось, і він набував значущості лише за умов стабілізації вуглеводного обміну. Це підтверджується і характером кривих апроксимуючих залежностей між ТНФ? та глюкозою (рис. 1) і ТНФ? та С-пептидом (рис. 2), з яких видно, що у цій ситуації з’являється пряма концентраційна залежність між даним цитокіном і рівнем у периферичній крові глюкози і С-пептиду. Даний факт є вагомим свідченням причетності ТНФ? до означених метаболічних змін. Підтверджує це і виявлення у хворих підвищеного коефіцієнту інсулінової резистентності, величина якого, як відомо, залежить від блокади інсулінової сигнальної системи, здійснюваної ТНФ?. Рис. 1. Взаємозв’язок ТНФ? з рівнем глюкози в периферичній крові. 1 – донори, 2 – хворі на ЦД2 перед лікуванням, 3 – через 1 місяць після лікування, 4 – через 4 місяці після лікування. Рис. 2. Взаємозв’язок ТНФ? з рівнем С-пептиду в периферичній крові. 1 – донори, 2 – хворі на ЦД2 перед лікуванням, 3 – через 1 місяць лікування, 4 – через 4 місяці лікування. На відміну від ТНФ?, концентрація ІЛ-1 у хворих вже на етапі виявлення ЦД2 певною мірою залежала від інсулінопродукуючої функції ?-клітин. Як видно з графіка апроксимуючих залежностей між ІЛ-1 та інсуліном (рис. 3) не виявлено будь-якого зв’язку у донорів. Але він мав місце у хворих перед лікуванням. Впродовж лікування цей зв’язок зникав, що було викликано стимуляцією секреції даного гормону репаглінідом. У цілому ці дані є доказом прямої участі ІЛ-1 у формуванні ЦД2 з дозозалежними проявами його впливу на ендокринну функцію ?-клітин – від її стимуляції до пригнічення. Рис. 3. Взаємозв’язок ІЛ-1 з інсуліном. 1 – донори, 2 – хворі на ЦД2 перед лікуванням, 3 – через 1 місяць лікування, 4 – через 4 місяці лікування. Привертають до себе увагу спостереження, які показали, що перед лікуванням продуцентами ТНФ? виступали і мононуклеари периферичної крові. З досягненням нормоглікемії внесок останніх до загального пулу даного цитокіну зменшувався (рис. 4). Для встановлення функціональних зв’язків між цитокінами та показниками ліпідного обміну було проаналізовано результати визначення коефіцієнтів кореляції відокремлених ознак (для кожної пари змінних виключався ймовірний вплив третьої) та побудовано графіки апроксимуючих залежностей відповідних пар показників. Проведені дослідження дозволили визначити тісний зв’язок між вмістом холестерину та тригліцеридів у периферичній крові хворих і концентраціями інсуліну, ІЛ-1? та TНФ?. Аналіз одержаних результатів дозволяє стверджувати, що саме зміни у синтезі прозапальних цитокінів можуть бути однією з причин розвитку дисліпідемії за ЦД2. До цього ж, ІЛ-1 і ТНФ? справляють різний вплив на вміст холестерину та тригліцеридів. Є всі підстави вважати, що від співвідношення цих цитокінів в організмі залежить значною мірою збереження нормоліпідемії. Проміж іншим, між рівнем тригліцеридів і концентрацією інсуліну існує пряма залежність, що пояснюється розвитком інсулінорезистентності в печінці та неспроможністю інсуліну стимулювати утилізацію тригліцеридів. Стан інсулінової резистентності в даному випадку може бути наслідком специфічної дії ТНФ? на інсулінову сигнальну систему. Результати визначення субпопуляційного складу лімфоцитів хворих на ЦД2 свідчать, що у даної категорії пацієнтів хвороба протікає на тлі загального зниження кількості імунокомпетентних лімфоцитів із деяким підвищенням відсотку NK-клітин. Крім того, незважаючи на наявність ознак імунодефіцитного стану, у хворих на ЦД2 не виявлено порушень нормального вікового розподілу основних типів Т-хелперів. Причиною вторинної імунної недостатності, на наш погляд, може бути притаманний ЦД2 хронічний стрес. У цілому наведені результати свідчать про те, що у хворих на ЦД2 відбуваються складні зміни у функціонуванні неспецифічної ланки імунітету зі зміною характеру їх взаємовідносин з різними метаболічними проявами, характерними для хвороби. Отже, за ЦД2 формується новий рівень регуляторних взаємозв’язків, де важливу роль відіграють зміни у синтезі цитокінів макрофагального походження. Є всі підстави вважати, що формування ЦД2 тісно пов’язано з патологією неспецифічної ланки імунітету, що диктує необхідність розробки принципово нових методів лікування даної патології. Це ж стосується і ЦД1. ВИСНОВКИ У дисертації представлено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, що стосується ролі прозапальних цитокінів у формуванні цукрового діабету 1-го та 2-го типів, зокрема виявлено нові аспекти зв’язку вмісту цитокінів у периферичній крові хворих із характером формування означеної патології на ранніх етапах її розвитку. Доведено доцільність визначення у клінічній практиці рівня прозапальних цитокінів як прогностичних та діагностичних маркерів. На всіх етапах розвитку цукрового діабету 1-го типу – предіабету, С-пептид-позитивного діабету та С-пептид-негативного діабету в периферичній крові пацієнтів визначається вірогідне збільшення вмісту інтерлейкіну-12. Є усі підстави вважати, що дана ознака носить конституційний характер і є однією з причин переважаючого розвитку клітинних імунних реакцій за даної патології. У дітей групи ризику щодо цукрового діабету 1-го типу у сироватці крові виявляється вірогідне підвищення рівня ТНФ?, концентрація якого збільшується за появи перших клінічних ознак діабету та утримується на високому рівні аж до завершення руйнування ?-клітин, що маніфестується відсутністю С-пептиду в периферичній крові. У цьому плані ТНФ? може розглядатися як маркер перебігу аутоімунного запалення в острівцях Лангерганса у хворих на цукровий діабет 1-го типу. На початкових етапах розвитку цукрового діабету 1-го типу в периферичній крові хворих виявляється підвищений рівень інтерлейкіну-1?, що зберігається тривало та, на відміну від ТНФ?, залишається суттєво підвищеним і на етапі С-пептид-негативного діабету. На ранніх етапах формування цукрового діабету 1-го типу в периферичній крові зберігається нормальний рівень основних популяцій лімфоцитів. Водночас у хворих дітей визначається дисбаланс у вмісті Тх1 і Тх2 клітин, який проявляється вірогідним збільшенням кількості Тх1-лімфоцитів, що не суперечить сучасним уявленням про клітинний характер аутоімунної агресії за цукрового діабету 1-го типу. Перебіг цукрового діабету 2-го типу характеризується явним зменшенням у периферичній крові загального вмісту Т-лімфоцитів, кількості Т-хелперів, Т-цитотоксичних і В-лімфоцитів зі збереженням нормального співвідношення Тх1 і Тх2 клітин. Оскільки у хворих паралельно відзначається збільшення концентрації в сироватці крові глюкокортикоїдних гормонів і маркерів гострої фази, це може розглядатися як ознака розвитку вторинної імунної недостатності, в основі якої лежить стимулююча дія прозапальних цитокінів відносно гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи та синтезу білків гострої фази печінкою. У хворих із вперше виявленим цукровим діабетом 2-го типу на тлі гіперглікемії визначається вірогідне збільшення концентрації ТНФ? в периферичній крові та активація спонтанного синтезу цього цитокіну мононуклеарами крові. З досягненням компенсації вуглеводного обміну відбувається нормалізація вмісту сироваткового ТНФ? та вірогідне зменшення його синтезу мононуклеарами. Отже, підвищена концентрація глюкози стимулює спонтанний синтез ТНФ? мононуклеарами крові, що може бути причиною посилення патологічних метаболічних проявів за цукрового діабету 2-го типу. Виявлено низку прямих і зворотних зв’язків вмісту ТНФ? з інсуліном, С-пептидом, глюкозою, інтерлейкіном-10, інтерлейкіном-12 та індексом маси тіла, які зазнають певних змін у процесі лікування хворих. Аналіз цих зв’язків у сукупності дозволяє стверджувати, що ТНФ? у процесі розвитку цукрового діабету 2-го типу відповідальний, головним чином, за формування і збереження стану інсулінової резистентності. У сироватці хворих на цукровий діабет 2-го типу виявлено зворотну залежність вмісту інсуліну та С-пептиду від рівня інтерлейкіну-1. За низьких концентрацій останнього відзначається посилення інсуліносекретуючої здатності ?-клітин, яка суттєво пригнічується зі зростанням системного рівня цього цитокіну. Ці данні є доказом прямої участі інтерлейкіну-1 у формуванні цукрового діабету 2-го типу з дозозалежними проявами його дії на ендокринну функцію ?-?літин. Визначення в периферичній крові вмісту прозапальних цитокінів та інтерлейкіну-12 є доцільним для встановлення ступеня ризику захворювання на цукровий діабет 1-го типу, визначення активності імунного запалення острівців Лангерганса за розвитку аутоагресії, а також для моніторингу перебігу і ефективності лікування цукрового діабету 2-го типу. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Анастасій Л.В., Малижев В.О., Карабун П.М., Сакало О.А., Фуніков Г.Л. Зв’язок цитокінів з метаболічними проявами цукрового діабету типу 2 // Імунологія та алергологія. - 2002. - №1. - С. 3-9 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Анастасій Л.В. Вміст цитокінів в периферичній крові хворих на етапах перебігу С-пептид-позитивного цукрового діабету типу 1 // Імунологія та алергологія. - 2003. - № 2. - С. 5-7. Карабун П.М., Анастасій Л.В., Малижев В.О., Сакало О.А. Стан регуляції вуглеводного обміну у хворих на цукровий діабет 2 типу при застосуванні репаглініду // Ендокринологія. - 2002. - Т.7. - №1. - С.13-20 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Ларін О.С., Анастасій Л.В., Сакало О.А., Корнієнко Ф.Б., Малижев В.О. Взаємозв’язок циркулюючих цитокінів (ТНФ, ІЛ-1) із вмістом у крові тригліцеридів і холестерину у хворих із вперше виявленим цукровим діабетом 2 типу. Новий аспект терапевтичної дії ново норму // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. - 2004. - №1. - С. 24-30 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Малижев В.О., Анастасій Л.В., Ларін О.С., Неборачко М.В., Гірявенко О.Я. Ліпоцитокіни в генезі цукрового діабету 2-го типу // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. - 2005. - №1. - С. 3-25 (збір матеріалу, обговорення, оформлення). Анастасий Л.В., Малыжев В.А., Сакало Е.А. Содержание IL-1(, TNF- (, IL-10 и IL-12 у больных сахарным диабетом II типа. Связь с гипергликемией. Матеріали IV Української науково-практичної конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології, 10-12 листопада 1999 р., м. Київ. - “Імунологія та алергологія”. - 1999. - №3. - С. 50 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Малыжев В.А., Анастасий Л.В., Горлова Л.Н. Роль неспецифической резистентности в формировании соматической патологии на примере сахарного диабета II типа. Матеріали IV Української науково-практичної конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології, 10-12 листопада 1999 р., м. Київ. - “Імунологія та алергологія”. - 1999. - №3. - С. 50-51 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка). Anastasy L., Malyzhev V., Gorlova L. and Sakalo E. The serum cytokines levels at early clinical stages of autoimmune type 1 dіabetes // Abstracts of the 36th Annual Meeting of the EASD Jerusalem, Israel, 17-21 September 2000. - Diabetologia. - 2000. - V.43. (Suppl 1). - P. A108 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка). Malyzhev V., Anastasiy L., Sakalo E. The Ratio of IL-12 and IL-10 in Patients with Type 1 and 2 Diabetes // Abs. 17th International Diabetes Federation Congress, November 5-10, 2000., Mexico City, Mexico. - P. 1 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Малыжев В.А., Анастасий Л.В. Цитокиновый мониторинг аутоиммунного процесса при формировании сахарного диабета 1-го типа // Тези V Науково-практичної конференції “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології” 20-22 листопада 2000 р., Київ. - Імунологія та алергологія. - 2000. - №2-3. С. 70 (збір матеріалу, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка, оформлення). Анастасій Л.В. Взаємозв’язок між фактором некрозу пухлин-( та індексом маси тіла у хворих на вперше виявлений цукровий діабет ІІ типу на тлі лікування новонормом // Матеріали VI з’їзду ендокринологів України, Київ, 23-25 травня 2001 р. // Ендокринологія. - 2001. - Том 6, додаток. - С. 6. Малижев В.О., Анастасій Л.В. Прозапальні цитокіни та метаболізм глюкози // Вибрані матеріали Науково-практичної конференції “Цукровий діабет 2 типу – епідемія ХХІ сторіччя. Сучасне та майбутнє”, 3-4.04.2003 р., Київ. - Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. - 2003. - №2. - С. 85-86 (збір матеріалу, оформлення). АНОТАЦІЯ Анастасій Л.В. Прозапальні цитокіни периферичної крові на початкових етапах формування цукрового діабету 1 та 2 типу. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.08 – імунологія та алергологія. Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України. – Київ, 2006. Було вивчено спектр прозапальних цитокінів у периферичній крові осіб групи ризику щодо ЦД 1-го типу, хворих на ЦД 1-го типу, хворих на ЦД 2-го типу на ранніх етапах формування хвороби. У крові досліджуваних вимірювали концентрації ІЛ-1, ТНФ?, ІЛ-10, ІЛ-12, С-пептиду, інсуліну, показники вуглеводного та ліпідного обмінів, вміст контрінсулярних гормонів і субпопуляцій Т-лімфоцитів. Встановлено підвищення вмісту ІЛ-12 і Тх1 на всіх етапах розвитку ЦД 1-го типу, що може бути причиною переважаючого розвитку клітинних імунних реакцій імунітету за ЦД1. Показано також, що за С-пептид-позитивного ЦД рівень у крові ТНФ? корелює з інтенсивністю імунного руйнування (-клітин. Знайдені взаємозв’язки між цитокінами та метаболічними показниками за ЦД 2-го типу вказують на те, що прозапальні цитокіни беруть пряму участь у формуванні даного типу діабету. Ключові слова: прозапальні цитокіни, цукровий діабет 1-го типу, цукровий діабет 2-го типу, імунопатогенез. аннотация Анастасий Л.В. Провоспалительные цитокины периферической крови на начальных этапах формирования сахарного диабета 1 и 2 типа. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.08 – иммунология и аллергология. Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца МЗ Украины. – Киев, 2006. Диссертационная работа посвящена изучению содержания цитокинов в периферической крови лиц группы риска развития сахарного диабета 1-го типа, у больных сахарным диабетом 1-го и 2-го типов на ранних этапах формирования заболевания. В крови исследуемых определяли концентрации ИЛ-1?, ТНФ?, ИЛ-10, ИЛ-12, С-пептида, инсулина, показатели углеводного и липидного обменов, содержание контринсулярных гормонов и субпопуляций Т-лимфоцитов. В результате проведенных исследований установлено, что у больных сахарным диабетом 1-го типа на всех этапах его развития отмечается повышенный уровень ИЛ-12 и Тх1 в периферической крови. Это может объяснить явление преобладающего развития клеточных иммунных реакций при данной патологии. Кроме того, установлено, что у детей группы риска в сыворотке крови определяется повышенная концентрация ТНФ?, которая остается достоверно высокой и при первых клинических проявлениях заболевания. Повышенная концентрация ТНФ? в периферической крови больных сахарным диабетом 1-го типа регистрируется до завершения аутоиммунного разрушения (-клеток островков Лангерганса. Таким образом, уровень ТНФ? в периферической крови может служить маркером интенсивности аутоиммунного воспаления при С-пептид-положительном сахарном диабете. При изучении содержания интерлейкинов и показателей углеводного и липидного обменов у больных сахарным диабетом 2-го типа выявлены определенные закономерности и взаимосвязи. Высокая концентрация глюкозы крови у больных до начала лечения сопровождалась достоверно повышенными концентрациями кортизола, глюкагона, триглицеридов и холестерина. Параллельно с достижением нормогликемии через 4 месяца после начала лечения отмечалось существенное снижение уровня глюкагона и триглицеридов, концентрации которых у больных до лечения были достоверно высокими. Содержание кортизола в сыворотке крови у больных через 4 месяца после начала терапии оставалось достоверно высоким и не отличалось от такого до лечения. Аналогичным образом изменялась и концентрация холестерина, с той лишь разницей, что у больных через 1 месяц после начала лечения уровень холестерина достоверно снижался по сравнению с этим показателем до лечения. На фоне зарегистрированных метаболических изменений отмечалось существенное повышение концентрации ТНФ? в сыворотке крови больных до лечения, его достоверное повышение через 1 месяц после начала лечения по сравнению с первоначальным уровнем и снижение до исходного через 4 месяца терапии. Концентрация ИЛ-1, которая ни до лечения, ни через 1 месяц после лечения не отличалась от такой у доноров, через 4 месяца после начала терапии достоверно снизилась. В результате анализа взаимосвязей между полученными показателями метаболизма и интерлейкинами установлено, что концентрация ТНФ? мононуклеарного происхождения коррелирует с содержанием в крови глюкозы, и последняя может выступать в роли стимулирующего фактора дополнительной продукции ТНФ?. Это, в свою очередь, может быть причиной прогрессирования заболевания. Кроме того, анализ взаимосвязей содержания ТНФ? с концентрациями инсулина, С-пептида, ИЛ-10, ИЛ-12, индексом массы тела, которые изменяются в процессе лечения, позволяет утверждать, что ТНФ? ответственен за развитие и сохранение состояния инсулиновой резистентности. Установлено, что в отличие от ТНФ?, другой провоспалительный цитокин – ИЛ-1? – оказывает дозозависимый эффект на инсулинсекретирующую активность поджелудочной железы. Таким образом, результаты проведенных исследований дают основание рассматривать провоспалительные цитокины в качестве факторов, принимающих прямое участие в формировании сахарного диабета 2-го типа. Ключевые слова: провоспалительные цитокины, сахарный диабет 1-го типа, сахарный диабет 2-го типа, иммунопатогенез. SUMMARY Anastasiy L.V. Proinflammatory cytokines of peripheral blood at the early stage of type 1 and 2 diabetes mellitus. – Manuscript. Thesis for candidate’s degree in speciality 14.03.08 – immunology and allergology. The O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv, 2006. The feathers of levels cytokines in peripheral blood in patients at risk of diabetes mellitus type 1 (DM1), in patients with overt DM1 and in patients with diabetes mellitus type 2 (DM2) on the early stage of duration of illness were studied. Contents of IL-1, TNF(, IL-10, IL-12, C-peptide, insulin, parameters of carbohydrate and lipid metabolism, contrinsular hormones and the spectrum of subpopulations of T-lymphocytes in the blood were investigated. Increased concentration of IL-12 and Th1 during all stages of DM1 were determined, it might be a reason of primary development of cellular immune response in patients with DM1. Also correlation between TNF? and intensity of immune (-cells destruction in on the C-peptide positive DM1 was found out. In case of DM2 connections between cytokines and metabolism parameters that were found give us possibility to consider proinflammatory cytokines as the factors of DM2 development. Фактор некрозу пухлин- (, пкг / мл 3 2 1 4 Глюкоза, ммоль/л 3 6 9 12 15 18 13 28 43 58 73 88 0 600 1500 3000 С- пептид, нмоль / л 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 1 2 (хmaх=66) 3 (хmax=96) Фактор некрозу пухлин-(, пкг/мл 4 4 0 22,5 45 Інтерлейкін-1 , пкг / мл 3 1 2 (хmax=97,02) 4 7 14 35 56 70 Інсулін, нмоль / л 2,5 5 Титри цитотоксичності, log2 контроль Хворі на ЦД2 до лікування Хворі на ЦД2 після лікування Рис. 4 Синтез TНФ? моноцитами хворих на ЦД2 in vitro до лікування і через 4 місяці після застосування репаглініду.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *