Пошук та вивчення потенційних протипухлинних засо-бів – похідних кислот фосфору (експериментальне дослі-дження) (автореферат)

Міністерство охорони здоров’я україни

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КУДРЯВЦЕВА іРИНА ГЕОРГІЇВНА

УДК 616-006.001.6: 615.54.546:18.32.33.38

Пошук та вивчення потенційних протипухлинних засобів – похідних кислот
фосфору (експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі онкофармакології Інституту фармакології та
токсикології АМН України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

Шарикіна Надія Іванівна,

Інститут фармакології та токсикології АМН України,

завідувачка відділу онкофармакології.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

Яковлєва Лариса Василівна,

Національний фармацевтичний університет,

завідувачка кафедри фармакоекономіки,

завідувачка ЦНДЛ

доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН
України ім. Р.Є. Кавецького, завідувач відділу ензимології

доктор медичних наук, професор

Драннік Георгій Миколайович,

Інститут урології АМН України,

завідувач лабораторії імунології та вірусології

Захист відбудеться 05.10.2007 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному
фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул.
Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного
фармацевтичного університету за адресою: 61168, м. Харків, вул. Блюхера,
4.

Автореферат розісланий 04.09. 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

доктор біологічних наук, професор Л.М.
Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасна протипухлинна терапія визнана у світі одним з
необхідних методів лікування хворих з онкозахворюваннями поряд з
хірургічним і променевим методами. Але і дотепер, пошук цитостатиків
проводиться переважно емпірично, у зв’язку з чим існуючі засоби не мають
високої селективності і чинять побічну дію на нормальні, насамперед
інтенсивно проліферуючі тканини.

Найбільш поширеною групою сучасних хіміотерапевтичних засобів, що
застосовуються для лікування онкологічних захворювань, є цитостатики
алкілуючої дії. До їх числа належить окрема група активних
протипухлинних сполук і препаратів (бензотеф, хлофіден і ін.), у
хімічній структурі яких присутні фосфоровмісні фрагменти. Загальними
властивостями цих сполук є зміна спектру дії у порівнянні з традиційними
цитостатиками, зниження токсичності та підвищення вибірковості дії.
Наявність фосфорної кислоти в молекулі алкілуючих агентів визначає їх
здатність утворювати транспортні латентні форми діючого початку, що
забезпечують проникнення до клітин природних носіїв, чинити політропний
вплив на організм і пухлинний ріст (Chaber B.A., Collins J.M., 1990;
Шарикіна Н.І. і співавт., 1998, 2000).

Доведення значимої ролі фосфоровмісних сполук при пухлинному рості стало
обґрунтуванням цілеспрямованого пошуку оригінальних протипухлинних
засобів серед фосфорильованих похідних різних класів органічних сполук,
який протягом тривалого часу проводиться науковцями відділу
онкофармакології Інституту фармакології і токсикології АМН України.

На підставі результатів широкого фармакологічного скринінгу відібрано 5
груп фосфоровмісних сполук (гідразиди кислот фосфору, фосфорильовані
уреїди, уретани, урацили, моно- і бісфосфонати), що володіють вираженою
протипухлинною активністю, з числа яких 10 сполук були піддані
подальшому поглибленому вивченню. Особливу увагу дослідників привернули
похідні бісфосфонових кислот. Тотожність хімічної структури останніх з
пірофосфатом визначає їхню участь у значній кількості біохімічних
реакцій як антиметаболітів фосфорного обміну (Комиссаренко С.В. и
соавт., 1977; Котык А., Янычек К., 1980). Важливою є здатність
бісфосфонатів до комплексоутворення (Г.И. Фомовская, 1986), зниженню
вмісту Са2+ у сироватці крові. Зазначений механізм може сприяти
гальмуванню передачі мітогенних сигналів у пухлинній клітині завдяки
впливу на рівень Са2+ та на систему “остеобласт-остеокласт” (Fleish H.,
1995; Фитз Б.Л. и соавт., 2000).

У ході досліджень, проведених у ІФТ АМН України, виявлено перспективну
речовину М-1 (Мебіфон), яка запропонована як потенційний протипухлинний
засіб. Проведене її доклінічне вивчення та клінічна апробація. Препарат
рекомендований до клінічного застосування і зареєстрований в Україні
(реєстраційне посвідчення № Р.07.02/04973 від 01.07.02).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана в рамках НДР ІФТ АМН України: № держреєстрації 0193И013185
(1991-1995 рр.); 0196U003198 (1997-1999 рр.); 100V000301 (2000-2002
рр.).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – пошук похідних кислот
фосфору з протипухлинною активністю, розробка на основі найбільш
перспективної речовини препарату для впровадження в медичну практику та
вивчення механізмів його дії. Для досягнення поставленої мети необхідно
виконати наступні завдання:

Провести пошук нових протипухлинних речовин серед похідних кислот
фосфору.

Встановити протипухлинну активність відібраних груп фосфоровмісних
сполук при експериментальному пухлинному рості в умовах відтворення
наступних референс-систем: саркома 45, саркома 180, карциносаркома
Уокера, епідермоїдна карцинома легенів Льюїс, карцинома молочної залози
(Са755), лейкемія L-1210, лімфолейкоз Р-388, карцинома Герена і
лімфосаркома Пліса.

Вивчити токсичні властивості фосфоровмісних сполук у гострому
експерименті з визначенням значення DL50 .

Вивчити залежність “структура – дія” і визначити раціональні шляхи
пошуку нових протипухлинних засобів.

Провести поглиблене вивчення перспективних протипухлинних речовин.

У рамках доклінічного вивчення Мебіфону як потенційного протипухлинного
засобу провести дослідження:

загальнотоксичних властивостей та окремих видів специфічної токсичності
препарату;

токсикологічних характеристик Мебіфону в умовах хронічного експерименту;

протипухлинної активності на культурах нормальних і пухлинних клітин та
на моделях експериментальних пухлин у лабораторних тварин;

механізмів протипухлинної дії, а саме: вплив Мебіфону на імунну систему
і процеси запалення; вплив на обмін кальцію, стромальні стовбурні
клітини та кісткову тканину.

Об’єкти дослідження:

Похідні кислот фосфору (всього 57 сполук): гідразиди кислот фосфору,
фосфорильовані уреїди, фосфорильовані уретани; фосфорильовані урацили,
похідні кислот фосфору та фосфорани.

Протипухлинний препарат „Мебіфон”.

Предмет дослідження: фармакологічна активність, токсикологічні
характеристики фосфоровмісних сполук в адекватних модельних системах;
доклінічне вивчення препарату „Мебіфон” відповідно до рекомендацій ГФЦ
МОЗ України.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані
фармакологічні, біохімічні, електрофізіологічні, токсикологічні,
гематологічні, імунологічні, гістологічні, електрохімічні методи
дослідження та методи математичної статистики. Усього використано 79
методів дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначено ряд фізіологічно
активних речовин серед похідних гідразидів кислот фосфору,
фосфорильованих похідних сечовини, уретану та урацилу, похідних
фосфорної кислоти та фосфоранів, що володіють вираженою протипухлинною
дією та помірною токсичністю, перспективних для подальшого вивчення і
впровадження. Отриманий масив даних використаний для вивчення залежності
“структура-дія” з визначенням шляхів пошуку нових протипухлинних
засобів. Вперше у рамках доклінічного вивчення препарату „Мебіфон”
встановлено багатовекторний характер його впливу на пухлинний ріст,
показана безпека при короткочасному і тривалому застосуванні. Вперше
показано, що новий цитостатичний препарат „Мебіфон” на відміну від
існуючих цитостатиків не пригнічує систему кровотворення, не змінює
адгезивних властивостей стовбурових клітин кісткового мозку, коригує
онкогенні впливи на кісткову тканину.

Наукова новизна отриманих результатів підтверджена 10 патентами на
винахід та 1 заявкою на патент на винахід.

Практичне значення роботи. За результатами вивчення протипухлинної
активності 57 хімічних речовин визначено 10 нових молекул перспективних
для подальшого дослідження з метою створення нового протипухлинного
засобу. Найперспективніша з них отримала назву „Мебіфон” і стала
об’єктом доклінічного дослідження. Матеріали доклінічного вивчення
Мебіфону стали підставою для його клінічної апробації і впровадження у
клінічну практику. Препарат „Мебіфон” зареєстрований в Україні
(реєстраційне посвідчення № Р.07.02/04973 від 01.07.02) як засіб для
лікування онкологічних хворих з метастазами в кістках.

Проводяться дослідження з розширення показань до застосування Мебіфону
та включення його у фармакотерапевтичні схеми, які застосовуються при
різних формах пухлинної хвороби (ІІІ – ІV фази клінічного вивчення).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною
науковою працею. За участю консультанту проведено вибір напрямку і
планування досліджень, підбір методичних підходів. Особисто автором
проведений патентно-інформаційний пошук, узагальнений світовий досвід
науковців за темою дисертації, виконання експериментальних досліджень,
аналіз отриманих результатів, формулювання висновків роботи та
практичних рекомендацій. У наукових публікаціях, виданих у
співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних
досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідалися та представлялися на ІІ з’їзді фармакологів УРСР (Харків,
1990 р.); науково-практичній конференції “Лікарські засоби України,
синтез, наукові дослідження, виробництво, реалізація” (Харків, 1992 р.);
науково-практичній конференції “Перспективи створення і виробництва
лікарських засобів в Україні” (Одеса, 1993 р.); науково-практичній
конференції “Сучасні проблеми фармації” (Харків, 1994 р.); І
національному з’їзді фармакологів України (Полтава, 1995 р.);
науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації – у медичну
практику” (Харків, 1996 р.); Республіканській науково-практичній
конференції “Нове в медикаментозній терапії раку молочної залози” (Київ,
1998 р.); Europian Congress of Pharmacology (Hungary, Budapest, 1999);
ІІ з’їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000 р.); ІІ національному з’їзді
фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001 р.); Х Російському
національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 2003 р.).

Публікації. За темою дисертації опублікована 31 наукова праця, з них 17
статей у фахових виданнях,10 патентів на винаходи, 1 заявка на патент та
3 тезів доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, п’яти
розділів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення
результатів досліджень, висновків і переліку використаних джерел.
Загальний обсяг дисертації складає 382 сторінки друкованого тексту.
Робота ілюстрована 71 таблицею, 22 рисунками. Перелік використаних
джерел містить 422 найменування (170 кирилицею і 252 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Усього у ході первинного
фармакологічного скринінгу досліджено 57 сполук, які представлені
похідними 5-ти груп фосфоровмісних речовин:

гідразидів кислот фосфору;

фосфорильованих уреїдів;

фосфорильованих уретанів;

фосфорильованих урацилів;

кислот фосфору та фосфоранів.

Для поглибленого фармакологічного вивчення, яке здійснювалось у рамках
доклінічних досліджень, обрано сполуку під шифром М-1– натрієву сіль
метилендифосфонової кислоти (препарат “Мебіфон”) (рис.1).

Рис. 1. Хімічна будова препарату “Мебіфон” (натрієва сіль

метилендифосфонової кислоти)

Вивчення токсичності 57 сполук проведено на білих нелінійних щурах,
білих нелінійних мишах при різних шляхах введення, для мебіфону
додатково на мишах лінії СВА та С57В1/6 (Беленький М.Д., 1963;
Прозоровский В.Б. и соавт., 1978).

При вивченні протипухлинної дії використані 10 моделей експериментальних
пухлин: саркома 45, лімфосаркома Пліса, саркома М-1, саркома 180,
епідермоїдна карцинома легенів Льюїс, меланома В-16, аденокарцинома
молочної залози ” Са755, карцинома Уокера, лімфоїдна лейкемія L-1210 та
лімфоцитарна лейкемія Р-3 88. Штами отримували з банків штамів Інституту
фармакології та токсикології АМН України при відділі онкофармакології,
Онкологічного наукового центру Російської Федерації та Інституту
патології, онкології та радіобіології НАН України ім. Р.Є. Кавецького.

Пасажі пухлин та вивчення протипухлинної дії проведені згідно з
існуючими вимогами (Софьина З.П. й др., 1980; Шарикіна H.I., Шляховенко
В.О. та співавт.,2001).

Вивчення залежності “структура-активність” проведено з використанням
дисперсійного, кореляційного аналізу, визначення електронної будови
сполук, основи яких наведені у ряді робіт (Кадыров Ч.Ш. и соавт.,1989;
Машковский М.Д., 1994; Недоступ В.И., Дацюк О.Е., 1999; Макеев Г.М. и
соавт.,1998).

При поглибленому вивченні протипухлинної дії мебіфону in vitro
використані одношарова культура лейкемічних клітин (лінія L-41) та
культура клітин пухлини гортані (НЕР-2) (Софьина З.П. и соавт., 1980).
Активність препарату на пухлинах молочної залози людини визначалась в
підкапсульному тесті (Bogden A.E.et al.,1981).

Доклінічні токсикологічні дослідження мебіфону проведені у відповідності
до вимог ДФЦ МОЗ України (Стефанов О.В. та співавт., 2001).

Вивчення комплексоутворюючих властивостей Мебіфону проведено методом
полярографії in vitro з використанням ртутно крапаючого електроду
(Kostyuk P.G.et al.,1981).

Дія препарату на кальцієві, натрієві та калієві канали вивчалася на
нейронах спінальних та тригемінальних гангліїв щура (Hammill OP. et
al.,1981; Moraidis I., Bingman D.,1994; Kramer, R. et al.,1994; Usachev
Y.et al., 1995; Reiser MA.et al.,1996; Shirokova N., Rios E.,1996; Yao
SL.et al.,1996; Mentz F. et al.,1996).

Вплив мебіфону на остеогенні клітини кісткового мозку людини, їх
трансформацію та диференціювання in vivo проведено методом клонування
стромальних клітин-попередників кісткового мозку (Астахова B.C., 2000).

Для оцінки впливу препарату на гістологічну структуру кістки щурів та
гістоморфометричні показники компактної та губчастої кісткової тканини
використаний комплекс методик гістоморфометрії з описовою гістологією
(Baak JPA., Oort J.,1983; Parfitt AM.,1988; Ревелл П.А., 1993).

Різнобічне дослідження впливу Мебіфону на ранні етапи імуногенезу та
імунну відповідь включало визначення мітостатичної та лімфотоксичної
дії, впливу на міграцію стовбурових клітин з кісткового мозку, міграцію
Т- та В-лімфоцитів, їхню кооперативну взаємодію за схемою,
запропонованою авторами (Петров Р.В., Манько М.М., 1971).

Аналіз впливу Мебіфону на імунорегуляторні клітини крові та селезінки
проведений з використанням моноклональних антитіл фірми “Becton
Diskinson” (США): Anty-Lyt-1 – мічені FITC (Т-лімфоцити); Anti-Thy-1 –
мічені FITC (Т-лімфоцити); Anty-Lyt-2 – мічені FITC
(Т-кілери/супресори); Anty-L3T4 – мічені фікоеритрином (Т-хелпери), а
також тест-панелей Simultest, мічених двома різними флуорохромами зі
світінням в зеленій (FITS-флуорисцентізоціанат) та червоній
(РЕ-фікоеритрин) частинах видимого світла: Simultest CDЗ+/CD8+
(Т-лімфоцити/Т-лімфоцити:кілери/ супресори); 2. Simultest
CDЗ+/CD\6+CD56′ (Т-лімфоцити / NK-клітини); Simultest CDЗ+/HLA-DR+
(Т-клітини / активовані Т-клітини).

При визначенні цитотоксичної активності NK-клітин клітинами-мішенями
були лінія пухлинних клітин УАС-1 (Н-2).

Вивчення антиексудативної дії Мебіфону проведено на моделі формалінового
набряку (Тринус А.П. и соавт.,1976).

Анальгетична дія вивчалася при термічному (Komlos Е. et al., 1950) та
хімічному подразненні (Chemow H.J. et al., 1961), жарознижувальна – на
моделі пірогеналової лихоманки (Тринус А.П. и соавт., 1976].

Усього у дослідах використано 3173 білі нелінійні щури, 1448 білих
нелінійних мишей, 100 мишей лінії С57 В1/6, 145 мишей лінії СВА х С57
BV6,130 мишей лінії СВА, 94 миші лінії P1/BALB(C.C57 B1), 50 мишей лінії
BALBc, 43 миші лінії CC57W, 3О мишей лінії ДВА, 172 морські свинки, 6
кроликів. Маса і стать тварин відповідали застосованим методичним
підходам, що викладені у відповідних розділах роботи. Тварини
утримувалися на звичайному харчовому раціоні, отримували їжу та пиття ad
libitum.

Отримані результати опрацьовані методами варіаційної статистики з
використанням критерію Стьюдента (Беленький М.Д., 1963; Сепетлиев Д.,
1965; Прозоровский В.Б., Прозоровская В.М. и соавт.,1978).

Пошук фосфоровмісних речовин, активних при експериментальному пухлинному
рості, та визначення залежності “структура-дія” у ряду похідних
фосфорної кислоти. Фосфоровмісні сполуки посідають визначене місце в
пошуках нових високоселективних протипухлинних засобів (Шарыкина Н.И.,
1969, 1980; Бухтиарова ТА., 1984; Donald L., Hill Ph.D., 1975; Кузьменко
И.И., 1967, 1979). Ці речовини мають ряд важливих особливостей, які
детермінують наявність у них протипухлинної дії та її вибірковість, а
саме:

сполуки, що мають тетраедричну систему фосфору, практично не проникають
через неушкоджені клітинні мембрани, що припускає доцільність
використання фосфорильованих носіїв для створення про-ліків з доставкою
та проникненням діючого фрагмента молекули всередину клітини;

фосфоровмісні молекули та їх фосфоровмісні фрагменти можуть проникати
через змінені кліткові мембрани за різних патологічних станів, у тому
числі при пухлинному рості, діючи як метаболіти або антиметаболіти
фосфорного обміну;

фосфоровмісні молекули зі структурною подібністю до неорганічного
пірофосфату або неорганічних фосфатів можуть проникати всередину клітини
з використанням механізму активного транспорту або полегшеної дифузії.

Відзначені особливості фосфоровмісних сполук визначили напрямок пошуку
нових протипухлинних засобів серед фосфорильованих функціональноактивних
реагентів, антиметаболітів піримідинового обміну, біс- та
монофосфонатів.

Ряд фосфорильованих функціонально активних реагентів були отримані в
Інституті фармакології та токсикології АМН України і дозволені для
клінічного застосування (бензотеф, хлофіден та ін.).

Наші дослідження цього напрямку були продовжені з заміною
фосфорильованих хлоретиламінів, фосфорильованих етиленімінів, тобто
традиційних алкілуючих агентів, фосфорильованими функціонально активними
реагентами з латентною алкілуючою активністю (похідні гідразину, уретану
та сечовини). У дослідження були включені також фосфорильовані
антиметаболіти пуринового обміну – транспортні форми 5-фторурацилу, а
також аналоги неорганічного пірофосфату та неорганічних фосфатів.

Пошук нових протипухлинних засобів серед наведених структур хімічних
сполук (усього обрано 57 оригінальних сполук) здійснювався з
використанням загальноприйнятих методичних підходів до вивчення основних
фармакологічних властивостей речовин з передбачуваною протипухлинною
дією (токсичність, протипухлинна активність) (Софьина З.П. и соавт.,
1980). Сполуки синтезовані в Інституті фармакології та токсикології АМН
України (відділ синтезу функціонально активних речовин, відділ
технології синтезу та аналізу лікарських засобів) та в Інституті
органічної хімії НАН України.

З 57 вивчених сполук за рівнем протипухлинної дії привернули увагу 10
сполук:

(-метилгідразид під шифром Ф-433;

фосфорильовані сечовини під шифрами Ф-550, Ф-551 і Ф-555;

фосфорильовані урацили під шифрами ФП-10, ФП-12;

бісфосфонати під шифрами М-1 і О-1;

похідні фосфорної кислоти під шифрами 160189, 350189 ( табл.1).

Таблиця 1

Хімічна будова перспективних протипухлинних засобів у ряду похідних

фосфорної кислоти

Лабораторний шифр Формула Хімічна назва

Ф-433

(-Метилгідразид-О,О’-ди (п-метилфеніл) фосфорної кислоти

Ф-550

(-Фенілгідразид уреїдометилфосфорної кислоти

Ф-551

(-Бензоїлгідразид уреїдометилфосфорної кислоти

Продовж. табл. 1

Ф-555

О,О’-Диметиловий ефір уреїдофосфорної кислоти

ФП-10

N-4,5-бензо-1,3,2-діоксафосфоленкарбамоїл-5-фторурацил

ФП-12

N-4,5-бензо-1,3,2-діоксафосфоленкарбамоїлурацил

М-1

Динатрієва сіль метилендифосфонової кислоти

О-1

Динатрієва сіль оксалідендифосфонової кислоти

160189

Натрієва сіль фенілфосфонистої кислоти

350189

Динатрієва сіль гідроксиметилфосфонової кислоти

Всі відібрані сполуки виявляють активність (90% гальмування росту одного
і більше із використаних штамів пухлин, і (70,0 % (або на рівні
прийнятого критерію значимості для певної моделі) на кожній з 8-ми
моделей

Таблиця 2

Протипухлинна активність перспективних фосфоровмісних сполук

Штами пухлин Відсоток гальмування пухлинного росту

Ф-433 Ф-550 Ф-551 Ф-555 ФП-10 ФП-12 М-1 О-1 160189 350189

Лімфосаркома Плісса 90,3 78,4 92,0 86,3 97,5 90,3 81,1 52,9 0 0

Карцинома Герена 51,0 – – – 70,0 52,0 – – – –

Саркома 180 96,0 96,0 28,0 89,9 – – 71,1 90,0 – –

Саркома 45 – 62,4 – 93,5 – 70,0 48,7 50,7 50,4 50,4

Карцинома Уокера – 55,8 86,8 – 72,2 86,5 46,2 24,5 – 91,1

Епідермоїдна карцинома легенів Льюїс – – – – – – 72,5 45,1 91,1 84,3

Меланома В-16 – – – – – – 55,0 – 93,4 93,4

Аденокарцинома молочної залози – – – – – – 99,2 – – –

пухлинного росту (табл. 2). Такий рівень протипухлинної активності
задовольняє існуючим вимогам до потенційних цитостатиків ((90,0 %
гальмування – 1 штам; 70,0 % – 3 штами) (Софьина З.П. и соавт., 1980;
Шарикіна Н.І. та співавт., 2000) і обгрунтовує доцільність їх подальшого
вивчення як протипухлинних засобів.

Так, метилгідразид Ф-433 ((-метилгідразид-о,о’-ди
(п-метилфе-ніл)фосфорної кислоти) показав активність (90,0 % гальмування
росту лімфосаркоми Плісса і саркоми 180, перевищуючи активність
тест-стандарта натулана (78,0 %, 65,0 %, відповідно).

Виражену протипухлинну активність на ряді експериментальних пухлин
проявили фосфорильовані сечовини:

Ф-550 ((-фенілгідразид уреїдометилфосфорної кислоти) – 1 штам (90,0 %
гальмування росту пухлини (саркома 180); 3 штами, з урахуванням саркоми
180, (70,0 % гальмування росту пухлини;

Ф-555 (о,о’-диметиловий ефір уреїдофосфорної кислоти) – 1 штам (90,0 %
гальмування росту пухлини (саркома 45); 2 штами (90,0 % гальмування
росту пухлини (лімфосаркома Плісса, саркома 180);

Ф-551 ((-бензоїлгідразид уреїдометилфосфорної кислоти) – 1 штам (90,0 %
гальмування росту пухлини (лімфосаркома Плісса); 1 штам (90,0 %
гальмування росту пухлини (карциносаркома Уокера).За виявленою здатністю
до пригнічення пухлинного росту два похідних фосфорильованих урацилів
також відповідають вимогам до потенційних протипухлинних засобів:

ФП-10 (N-4,5-бензо-1,3,2-диоксафосфоленкарбамоїл-5-фторурацил) – 1 штам
(90,0 % гальмування пухлинного росту (лімфосаркома Плісса); 3 штами, з
урахуванням лімфосаркоми Плісса, – (70,0 % гальмування пухлинного росту
(карцинома Герена, карциносаркома Уокера);

ФП-12 (N-4,5-бензо-1,3,2-диоксафосфоленкарбамоїлурацил) – 1 штам (90,0 %
гальмування пухлинного росту (лімфосаркома Плісса); 1 штам (90,0 %
гальмування пухлинного росту (карциносаркома Уокера); 3 штами, з
урахуванням двох попередніх, – (70,0 % гальмування росту пухлин.

Значущий протипухлинний ефект у наших дослідах проявили два похідних
бісфосфонатів – аналогів неорганічного пірофосфату – сполуки О-1 і М-1.
Сполука О-1 (динатрієва сіль оксаліденбісфосфонової кислоти) показала
(90% гальмування пухлинного росту на 1 штамі (саркома 180). Сполука М-1
(динатрієва сіль метиленбісфосфонової кислоти) виявилася значно
активнішою, ніж попередня: на 1 штамі (90% (аденокарцинома 755) і на 4-х
штамах, з урахуванням попереднього, – (70% гальмування пухлинного росту
(лімфосаркома Плісса, саркома 180, епідермічна карцинома Льюїс). На
інших використаних моделях активність речовини знаходилась в межах
критерію значимості штамів (саркома 45, меланома В-16, карциносаркома
Уокера).

Сполука О-1 (динатрієва сіль оксаліденбісфосфонової кислоти, ОБФК;
натрій-калієва сіль під назвою “Ксидіфон”), за даними літератури, після
наших досліджень впроваджена в практику охорони здоров’я по ряду
показань, зокрема, для лікування остеопатій (виключаючи пухлинну
хворобу) (Золотухина М.М. и соавт., 1993).

Що стосується динатрієвої солі метиленбісфосфонової кислоти (сполука
М-1), то дані літератури засвідчують лише незначний ступінь вираженості
її протипухлинної активності (Золотухина М.М. и соавт., 1993). Проведене
нами поглиблене фармакологічне дослідження дозволило довести наявність у
даної сполуки протипухлинного ефекту, який відповідає сучасним вимогам
до хіміотерапевтичних засобів, що застосовуються для лікування
онкологічних захворювань.

Таким чином, нами вивчено і описано перший бісфосфонат з вираженою
протипухлинною активністю, який, під назвою “Мебіфон”, впроваджено в
практику охорони здоров‘я як засіб, активний при злоякісних
новоутвореннях молочної та передміхурової залоз з метастазами у кістки.
Дещо пізніше була описана аналогічна дія у іншого представника
бісфосфонатів – золадронату (зомети) (Berenson JR. et al., 2001; Ali SM.
et al., 2001), що підтверджує правильність обраного нами напрямку пошуку
нових ефективних і достатньо безпечних цитостатиків.

У ході наших експериментів досліджувались також аналоги неорганічного
фосфату – оригінальні сполуки на основі монофосфонової кислоти (шифри
160189 і 350189). Їх протипухлинна активність високого рівня на ряді
експериментальних моделей описана вперше:

сполука 160189 (натрієва сіль фенілфосфонистої кислоти) – 2 штами (90,0
% гальмування пухлинного росту (епідермоїдна карцинома Льюїс, меланома
В-16);

сполука 350189 (динатрієва сіль гідрооксиметилфосфонової кислоти) – 2
штами (90,0 % гальмування пухлинного росту (епідермоїдна карцинома
Льюїс, меланома В-16); 1 штам (90,0 % гальмування пухлинного росту
(карциносаркома Уокера).

Зазначені речовини стали предметом подальших поглиблених досліджень
відділу онкофармакології Інституту фармакології та токсикології АМН
України зі створення нових протипухлинних засобів з полівалентним
механізмом дії (8 нових молекул).

Отриманий масив даних з вивчення фармакологічних властивостей 57
фосфоровмісних сполук став підґрунтям для проведення аналізу з
визначення залежності “структура-дія”, метою якого є визначення напрямку
подальшого пошуку ефективних протипухлинних засобів (Кадыров Ч.Ш. и
соавт., 1989; Машковский М.Д., 1994; Макеев Г.М. и соавт., 1998;
Недоступ В.И., Дацюк О.Е., 1999).

Насамперед був проведений аналіз параметрів гострої токсичності сполук
(ЛД50) і зіставлення її з вивченими хімічними класами, дескрипторами і
молекулярною масою. Речовини були розділені на хімічні групи і
представлені в порядку зростання ЛД50. Перші результати дозволили
встановити приблизно однакові показники середніх значень ЛД50 сполук в
групах (мМ/кг).

Далі була зроблена спроба оцінити відмінності токсичності сполук в
групах за допомогою дисперсійного аналізу. Низьке значення критерію
Фішера (F=1,81) і рівня значимості ((=0,13) свідчили про недостатньо
істотні відмінності токсичності сполук порівнюваних хімічних класів.
Тобто, токсичність речовин, загалом, не обумовлюється їх належністю до
конкретного класу хімічних сполук, а визначається сукупністю різних
структурних чинників.

Для вивчення впливу структурних факторів на токсичність сполук, останні
були формалізовані за допомогою дескрипторів, якими служили: наявність
або відсутність гідразидного, сечовинного, уретанового фрагментів,
карбонільної групи, ароматичних груп, особливості радикалів у атома
фосфору тощо. Результати розрахунків висвітлили наступну тенденцію:
найбільший вплив на токсичність чинить сечовинний фрагмент ( число
ароматичних груп ( наявність додаткової карбонільної групи ( уретановий
фрагмент ( молекулярна маса.

Дослідження впливу молекулярної маси на загальнотоксичні властивості
речовин проведене за допомогою кореляційного аналізу. Констатована
відсутність лінійної залежності між ЛД50 і молекулярною масою, про що
свідчить розрахований коефіцієнт кореляції (Ккор=0,20 при рівні
значимості (=0,15). Тобто, зв’язок токсичності з молекулярною масою
речовин носить більш складний характер.

Оскільки значні відмінності у хімічній будові досліджуваних
фосфорорганічних сполук перешкоджають встановленню глобальних
залежностей “структура – дія”, основна увага була зосереджена на
встановленні цієї залежності всередині окремих класів.

В межах вивчених груп сполук відзначені наступні закономірності:

токсичність метилгідразидів пов’язана з наявністю одного з ароматичних
ядер і замісників, особливо електроноакцепторних, які зменшують
токсичність сполук;

у гідразидів уреїдофосфорних кислот (Ф-550 та інш.), які відрізняються
одним радикалом біля атома кисню, заміна метильної групи на ізопропільну
призводить до підвищення, а введення замісників до гідразидного
фрагменту (карбонільна група) – до зменшення токсичності;

серед ефірів уреїдофосфорних кислот найменш токсичними є речовини з
парною кількістю атомів вуглецю в ефірному фрагменті з довжиною ланцюга
С4-С6;

похідні уретанфосфорних кислот, загалом, менш токсичні за аналогічні
уреїди;

на токсичні властивості аддуктів солей урацилу з фосфорними кислотами
впливає природа замісника в 5 положенні урацилового циклу і в
ароматичному залишку фосфорної кислоти;

дифосфонові кислоти менш токсичні, ніж монофосфонові.

Аналіз протипухлинної активності фосфоровмісних сполук показав, що кожна
група характеризується значним розкидом значень протипухлинної
активності, що свідчить про наявність залежності “структура-активність”.

Для кількісної оцінки розбіжності у вираженості протипухлинної
активності між групами був проведений дисперсійний аналіз даних,
отриманих при відтворенні лімфосаркоми Пліса. Визначені середні значення
протипухлинної дії становили: фосфорильовані гідразиди, солі та ефіри
кислот фосфору, фосфорильовані сечовини – (60,0 %; фосфоровмісні урацили
– (70,0 %, фосфорильовані уретани і фосфорани (40,0 % і (30,0 %,
відповідно. Низькі значення критерію Фішера і рівня значимості (F=1,76;
(=0,15) вказують на те, що відмінність у виразності протипухлинної
активності між групами не дуже суттєва.

Попарне порівняння груп показало істотну відмінність між гідразидами і
фосфоранами (t=2,01; (=0,08), урацилами і фосфоранами (t=3,28; (=0,007),
урацилами і уретанами (t=2,42; (=0,03).

Порівняння протипухлинної активності сполук в межах одного класу,
визначеній на лімфосаркомі Пліса, дозволило встановити наступні
закономірності:

введення атомів фтору, метильних груп в молекулу похідних гідразидів
призводить до підвищення протипухлинної активності;

встановлена висока протипухлинна активність уреїдофосфорних кислот, яка
знижується при заміні метильного радикала і введенні замісників в
бензольний фрагмент; бензоїлгідразиди цього класу активніші за
фенілгідразиди і фосфорильовані уретани;

відзначається висока протипухлинна активність аддуктів 5-фтор- і
5-бромурацилу з фосфорними кислотами; ефекти калієвих і натрієвих солей
близькі за вираженістю; помітно знижує активність введення замісників в
бензольне кільце, заміна дифенілового ефіру диметиловим;

у карбамоїлурацилів додавання другої карбамоїльної групи знижує
протипухлинний ефект;

у дифосфонатів зміна вуглецевого радикала неорганічного пірофосфату
призводить до зниження протипухлинної активності; подібний ефект
спостерігається і у монофосфатів.

При аналізі протипухлинної активності фосфоровмісних сполук (n=19) на
іншій моделі пухлини – саркомі 180– показано:

у метилгідразидів, як і на попередній моделі, введення атома фтору
позначається підвищенням протипухлинної активності; у той же час, на
відміну від лімфосаркоми Пліса, введення електронодонорних замісників
різко знижує протипухлинну дію на саркомі 180;

в уреїдах кислот фосфору визначальну роль відіграє уреїдний фрагмент,
введення замісників мало змінює виразність протипухлинної дії;

аналогічно як і на лімфосаркомі Пліса активність аддуктів 5-фтор-урацилу
з фосфоровмісними кислотами зменшується при введенні замісників в
бензольне кільце і заміні дифенілового ефіру диметиловим;

похідні бісфосфонових кислот активніші за монофосфонати; спостерігається
зниження протипухлинної активності за наявності замісників в
метиленовому містку (О-1 порівняно з М-1).

При відтворенні меланоми В-16 монофосфонати показали вищий рівень
активності, ніж бісфосфонати. Ця закономірність зберігається на
карциномі легенів Льюїс: 160189 – 91,1 % гальмування пухлинного росту;
350189 – 84,3 %.

На карциномі Герена метилгідразиди при невисокій протипухлинній
активності зберігають закономірність, відзначену на лімфосаркомі Плісса
і саркомі 180: підвищення протипухлинної активності при введенні атомів
фтору і її зниження при заміні електроноакцепторних замісників на
електронодонорні. Похідні уреїдо- і уретанфосфорної кислоти практично не
виявляють активності на цьому штамі. Низька протипухлинна активність
відзначена для аддуктів 5-фторурацилу з диарілфосфорними кислотами.

На карциномі Уокера активними виявилися бензоїлгідразиди уретано-і
уреїдофосфорної кислоти (Ф-554 – 91,0 %; Ф-551 – 85,0 %). При цьому
наявність бензилгідразидного фрагмента є визначальною, оскільки
фенілгідразидний аналог протипухлинної активності практично не має.

На саркомі 45 фосфоровмісні сполуки не володіють високою протипухлинною
активністю (4 речовини з 22 мають протипухлинний ефект 50,0 %
гальмування пухлинного росту). При порівнянні сполук однієї групи
визначено, що у ряді диалкілових ефірів уреїдофосфорної кислоти похідні
з парним числом вуглецевих атомів в алкільному радикалі (С4Н9 і С6Н13)
активніші за похідні з непарним числом атомів (С3Н4, С5Н11 і С7Н15).
Протипухлинна дія аддуктів 5-фторурацилу з диарилфосфорними кислотами
залежить від характеру замісників у фенільному радикалі.

При узагальненні результатів вивчення біологічної активності 57 сполук з
потенційним протипухлинним ефектом (токсичність, протипухлинна дія) був
проведений кореляційний аналіз між визначеним ефектом на різних штамах
пухлин з включенням молекулярної маси сполук. Враховували коефіцієнт
кореляції (Ккор), число сполук (N) і рівень значимості (р).

Цілковита кореляція токсичності (ЛД50) з відсотком гальмування
характерна для досліджень на карциномі Уокера (Ккор=0,997). Графічно ця
кореляція зображається прямою лінією і описується рівнянням:
ПТ=102,968-24,755ЛД50. Помітна кореляція має місце відносно саркоми 180
і карциносаркоми Уокера. Для цих моделей, ймовірно, із зростанням
токсичності зростатиме протипухлинний ефект відповідно до визначеної
залежності.

За наслідками кореляційного аналізу сполук досліджених груп можна
відзначити такі системи оцінки протипухлинної дії :

активність на лімфосаркомі Пліса корелює з протипухлинним ефектом на
саркомі 45, саркомі 180;

протипухлинна дія на карциномі легенів Льюїс корелює з такою на меланомі
В-16 і саркомі 180. При цьому активність на перших двох моделях тісно
корелює з молекулярною масою речовин, яка є лімітуючим фактором для
проникнення сполук через мембранні структури цих пухлин;

карциному Герена і саркому М-1 недоцільно використовувати у дослідних
системах, як такі, що не дають значущої кореляції з іншими моделями;
можливе їх застосування за умови розширення спектру пухлин при вивченні
речовин з виявленою активністю.

Варто звернути увагу на 2-і важливі характеристики активності речовин на
конкретних моделях пухлинного росту: середнє значення протипухлинної дії
і максимальне значення цієї дії. Середні значення протипухлинної
активності для більшості вивчених сполук, як правило, зростають із
зростанням максимальної активності. Це є свідченням універсальності їх
дії. Проте, є невелика група речовин, для яких ця залежність не
витримується, що дозволяє говорити про специфічність їх дії на окремі
моделі пухлинного росту.

Порівняння розподілу максимальних значень протипухлинної дії вивчених
сполук по групах проведене з використанням методу дисперсійного аналізу.
У ході аналізу визначені достатньо високе значення критерію Фішера
(F=3,84) і рівня значимості (р=0,0053).

Середні значення активності відносно пухлинного росту кожної з груп
сполук: метилгідразиди (61,96 %); урацили (75,02 %); уретани (61,60 %);
моно- і дифосфонати (79,77 %); урацили (75,02 %); уреїди (48,82 %);
фосфорани (28,27 %).

Зазначені підходи, на додаток до викладеного, дозволили виявити найбільш
перспективні групи фосфоровмісних сполук.

Вивчення залежності “протипухлинна активність – електронна будова”,
необхідне для можливого дизайну нових речовин, проведене у такому ряді
сполук:

фосфорильованих сечовин з алкільними замісниками у фосфатному фрагменті;

фосфорильованих сечовин з арильними замісниками у фосфатному фрагменті;

фосфорильованих сечовин з алкільним і гідразидними замісниками у
фосфатному фрагменті;

фосфорильованих сечовин з двома сечовинними і одним алкільним (або
арильним) замісниками у фосфатному фрагменті.

Наведені сполуки сконструйовані з функціонально активних фрагментів, що
детермінують властивості складної молекули. Важливим параметром в цьому
плані є енергія і локалізація граничних молекулярних орбіталей (нижньої
вакантної – НВМО і верхньої зайнятої – ВЗМО), які визначають характер
перенесення електронної щільності в реакціях. Для розрахунку електронної
і просторової будови молекул був використаний напівемпіричний метод РМЗ
і пакет програм HyperChem.

Перша група – фосфорильовані сечовини з алкільними замісниками у
фосфатному фрагменті. Як відомо, оксисечовина є інгібітором переходу
рибонуклеотидів в дезоксирибонуклеотиди, тобто пригнічує синтез ДНК
(Elford H.I.,1968). Вивчені нами речовини містять уреїдний фрагмент, що
припускає наявність у механізмі їхньої дії аналогічної складової.
Поєднання сечовинного і диалкілфосфатного фрагментів з різною довжиною і
розгалуженістю алкільних груп супроводжується відповідними зсувами
гідрофобно-ліпофільного балансу, що зображається зміною відповідних
показників. Враховували розраховані дані дипольного моменту ( (Д),
поверхні і об’єму молекули S (Е2), V (Е3), коефіцієнти ліпофільності Log
P, молярної рефракції MR (см3/моль).

За результатами дослідів показано, що зміна вуглеводневого алкільного
радикалу у фосфатній групі впливає на гідрофобні, стеричні і електронні
властивості молекул. При цьому квантово-хімічні характеристики сполук
близькі до таких у метилнітрозосечовини. Локалізація ВЗМО сполук,
зокрема найбільш активної Ф-555, на сечовинному фрагменті, напевно, є
визначальною в їхньому протипухлинному ефекті.

При заміні алкільних замісників на арильні у фосфатному фрагменті
протипухлинна активність виражена досить незначно. Особливістю цих
речовин є локалізація ВЗМО на атомах ароматичних груп.

Фосфорильовані сечовини з алкільним і гідразидним замісниками у
фосфатному фрагменті характеризуються близькими значеннями
квантово-хімічних характеристик з прокарбазином і гідрооксисечовиною.
Величини енергій ВЗМО відповідно дорівнюють: Ф-550 – 7,75 еВ;
прокарбазин – 9,21 еВ; гідрооксисечовина – 9,47 еВ. Загальною
властивістю сполук ряду є переважна локалізація ВЗМО на -NHNHR при
значно меншій участі в утворенні ВЗМО сечовинного фрагмента.

Фосфорильовані сечовини з двома сечовинними і одним алкільним або
арильним замісниками у фосфатному фрагменті можуть чинити свою
біологічну дію за рахунок як гідразидного, так і сечовинного фрагментів.

Таким чином, для наявності вираженої протипухлинної дії фосфорильованих
сечовин необхідна наявність в їх структурі алкільних замісників у
фосфатному фрагменті, локалізація ВЗМО на сечовинному, або гідразидному
фрагменті. При поєднанні в молекулі сечовинного і гідразидного
фрагментів функція сечовинного фрагмента ослаблюється.

Отримані дані вказують на можливість прогнозування активності сполук за
результатами на одному з відзначених штамів пухлин 2-х наведених систем;

для виявлення перспективних груп сполук в масивах біологічних даних
можливий аналіз середніх і максимальних значень протипухлинної дії;

У окремих групах:

введення атома фтору в метильні групи метилгідразидів підвищує
протипухлинну активність, заміна електроноакцепторних замісників на
електронодонорні призводить до зниження протипухлинного ефекту;

у фосфорильованих сечовин протипухлинний ефект знижується при заміні
метильного радикала, введенні замісників в бензольний фрагмент;
бензоїлгідразиди активніші за фенілгідразиди (лімфосаркома Пліса); в
активності на саркомі 180 важливу роль відіграє уреїдний фрагмент; на
саркомі 45 активніші сполуки з парним числом вуглецевих атомів в
алкільному радикалі (С4Н9 і С6Н13), ніж з непарним числом атомів вуглецю
(С3Н7, С5Н11 і С7Н15);

серед фосфорильованих сечовин значною протипухлинною активністю
володіють речовини з локалізацією ВЗМО на сечовинному або гідразидному
фрагментах;

протипухлинна активність адуктів 5FU з фосфоровмісними кислотами
знижується при введенні замісників в бензольне кільце, заміні
дифенілових ефірів на диметилові (лімфосаркома Пліса, саркома 180),
практично відсутня активність цих речовин на карциномі Герена;

у карбамоїлурацилів введення 2-ої карбамоїльної групи знижує
протипухлинний ефект;

введення замісників в метиленовий місток бісфосфонатів призводить до
зниження їх протипухлинної активності (лімфосаркома Пліса).

Загалом, отримані матеріали з вивчення залежності “структура-дія” 57
сполук дозволили звернути увагу на ряд важливих фактів, які можуть бути
використанні в подальшому конструюванні нових біологічно активних сполук
у зазначених напрямах.

–

`

$

–

N

8x¬

`

b

`

b

l

’

TH

d?th

&

0?|?~???????¤?°?1/4?E???O?ae?o?iriiiiiiiiii

Ff1/4

??&?

¦

?

?

¬

?

¶

?

1/4

H

H

??&?

??&?

Pрспектива її впровадження, успішно пройшли клінічні випробування.
Препарат під назвою “Мебіфон” зареєстрований в Україні як засіб
лікування хворих зі злоякісними новоутвореннями молочної і
передміхурової залоз з метастазами до кісток (Комісаренко С.В.,1986).

Дослідження із створення нового лікарського засобу “Мебіфон”.

При вивченні основних фармакологічних властивостей препарату
(токсичність, протипухлинна активність) було показано, що за рівнем
гострої токсичності він належить до класу середньотоксичних речовин
(ДЕСТ 12.1. 007-76,1990). ЛД50 для мишей при внутрішньовенному,
внутрішньочеревинному, підшкірному і внутрішньошлунковому введеннях
складає відповідно 129, 148, 187 і 235 мг/кг. Спостерігаються
відмінності у видовій чутливості препарату Найменш чутливі –
миші-гібриди першого покоління СВА ( С57В1/6 і щури, для яких ЛД50
препарату при внутрішньоочеревинному введенні складає 282 мг/кг. Звертає
на себе увагу факт, що картина отруєння тварин на тлі мебіфону
відповідає такій у класичних цитостатиків. Спостерігається кишковий тип
загибелі (Шарикіна Н.І., 1980), що вказує на роль цитостатичного ефекту
в механізмі дії мебіфону.

Вивчення кумуляції і зворотності токсичних властивостей препарату
(Ларионов Л.Ф., 1962; Чернов В.А., 1964) показали, що Мебіфон володіє
приблизно в 4 рази меншою здатністю до кумуляції, ніж циклофосфамід
(Ларионов Л.Ф., 1962). Індекси зворотності токсичних властивостей
оберненопропорційні до індексів кумуляції токсичних властивостей і
дорівнюють відповідно 3,75 і 1,0.

Вивчення картини загибелі тварин при введенні токсичних доз мебіфону
(ЛД50, ЛД99)., яка за зовнішніми ознаками схожа на таку у традиційних
цитостатиків, виявило чіткі відмінності відносно картини периферичної
крові. Так, у мебіфону відсутній пригнічуючий вплив на показники
периферичної крові (лейкоцити, еритроцити, вміст гемоглобіну) при
значному зниженні вмісту тромбоцитів. Зважаючи на останнє було проведене
дослідження дії препарату на окремі показники системи гемостазу.
Встановлено, що мебіфон дещо прискорює згортання крові, не змінює
протромбіновий індекс, час рекальціфікації, ретракції кров’яного
згустка, практично не змінює стійкість плазми до гепарину. Наведені
зміни щодо прискорення згортання крові мали місце при клінічній
апробації препарату і відзначені в інструкції з його клінічного
застосування.

Поглиблене вивчення протипухлинної активності мебіфону в умовах in vitro
і in vivo дозволило не лише підтвердити його ефективність відносно
пригнічення злоякісного росту, але й зробити певні висновки про механізм
дії.

За загальноприйнятими критеріями оцінки протипухлинної дії (Софьина З.П.
и соавт.,1980) наявність прямого цитостатичного, зокрема
протипухлинного, ефекту підтверджується у дослідах in vitro, якщо
біологічно активна речовина виявляє здатність до пригнічення клітинних
культур в дозі 100 мг/мл і менше на рівні 50 % і вище. На двох моделях –
перевивній одношаровій культурі лейкемічних клітин (лінія L-41) і
культурі клітин пухлини гортані (HЕP-2) мебіфон лише в дозах 150-300
мг/мл виявляв слабкий ефект гальмування (до 20,0-30,0 %), що нижче
наведеного критерію значимості. Тобто, препарат не чинить вираженої
прямої цитостатичної дії.

Вивчення протипухлинної активності мебіфону в умовах in vivo включало
використання різноманітних моделей пухлин (табл. 2). Оцінку ефективності
препарату здійснювали відповідно до існуючих вимог: перспективною
протипухлинною сполукою вважається та, що виявляє активність на 1 моделі
(90,0 % або 3-х моделях (70,0 % гальмування пухлинного росту з
перевищенням активності тест-стандарту хоча б на 1 моделі на 50,0 % і
більше (Софьина З.П. и соавт, 1980; Шарикіна Н.І. зі співавт., 2001).

Активність мебіфону в межах 70,0 % гальмування пухлинного росту мала
місце на 6 моделях (саркома 180, карцинома Герена, епідермоїдна
карцинома легенів Льюїс, лімфосаркома Плісса, саркома М-1, карцинома
755). На 2-х штамах експериментальних пухлин протипухлинна активність
Мебіфону (90,0 % гальмування пухлинного росту (карцинома 755, саркома
М-1). Ефект на лімфосаркомі Пліса близький до 90,0 %. Наведені дані
засвідчують відповідність мебіфону рівням протипухлинної активності
перспективних речовин з протипухлинною дією

Зважаючи на відсутність значущої протипухлинної активності у відомих
представників бісфосфонатів, які застосовуються для лікування хворих зі
злоякісними новоутвореннями і метастазами до кісток (бонефос, аредіа та
ін.), як тест-стандарт у наших дослідах був обраний натулан – аналог за
дією (на підставі власних даних і даних літератури (Софьина З.П. и
соавт.,1980). Дані про протипухлинну активність зомети не дозволили
взяти цей препарат за тест-стандарт, з огляду на відсутність відповідних
публікацій і реєстрації препарату в Україні.

Порівняння протипухлинної активності Мебіфону і натулану в дозах, що
дають оптимальний протипухлинний ефект, показало, що Мебіфон активніший
за натулан на лімфосаркомі Плісса ((90,0 % при 71,4 % первинного
виліковування; натулан – 55,4 %), саркомі 180, епідермоїдній карциномі
легенів Льюїс. Приблизно однакові ефекти зареєстровані на меланомі В-16.
Тобто, зважаючи на вищенаведене, у наших дослідах доведена відповідність
Мебіфону прийнятим вимогам: активність Мебіфону, більше ніж на 70,0 %
гальмування пухлинного росту вища за таку тест-стандарту натулану на
епідермоїдній карциномі легенів Льюїс. На лімфосаркомі Пліса цей
показник Мебіфону близький до 50,0 %.

Варто відзначити, що ефект мебіфону знаходиться на рівні критерію
значимості або перевищує його на асцитних штамах експериментальних
пухлин (моделях лейкозного процесу): лімфоцитарна лейкемія Р-388 – 25,3
% збільшення тривалості життя мишей лінії DBA; лейкемія L-1210 – 46,2 %
збільшення тривалості життя тварин цієї лінії (при критерії значимості
(25,0 %).

Для визначення оптимального режиму застосування мебіфону були проведені
дослідження на лімфосаркомі Пліса, де ефект препарату був високим в
інтервалі доз (1/4 – 1/8) ЛД50 у 14 режимах. Оптимальним режимом
застосування визнано режим 40 мг/кг х 48 г х 6 введень. При цьому
гальмування росту пухлини склало 92,0 % при високому відсотку первинного
виліковування тварин, відсутності загибелі тварин і збереженні відносної
маси селезінки в межах 0,6. Визначене зниження маси селезінки свідчить
про певну імунотропну дію препарату.

Важливим критерієм оцінки протипухлинної дії є здатність препарату
утримувати протипухлинний ефект (Ларионов Л.Ф.,1962). Ця здатність
властива мебіфону: одноразове введення препарату в дозі 100 мг/кг (1,5 %
розчин) утримує протипухлинний ефект (88,3 % гальмування лімфосаркоми
Пліса за об’ємом) до 5 діб (89,6 %). На початку лікувальних дій на 8-й
день (лімфосаркома Пліса, занедбаний пухлинний ріст) ефект препарату
відповідав рівню значимості ((50,0 % гальмування пухлинного росту), що
висвітлювало спроможність препарату гальмувати занедбаний пухлинний
ріст.

Для орієнтації напрямку клінічної апробації мебіфону проведене вивчення
його активності на гетеротрансплантатах злоякісних пухлин молочної
залози людини в підкапсульному тесті (Bogden AE. Et al.,1981). У наших
дослідах показано, що мебіфон гальмує ріст гетеротрансплантатів на 46,7
% при критерії значимості (25,0 %. У подальших клініко-експериментальних
дослідженнях відділу онкофармакології була показана активність препарату
на злоякісних пухлинах молочної і передміхурової залози, що знайшло
відбиття у відповідних показаннях до його клінічного застосування.

У ході доклінічних токсикологічних досліджень мебіфону, відповідно до
вимог ДФЦ МОЗ України (Стефанов О.В. зі спіавт.,2001), доведено:

препарат не впливає на показники периферичної крові в експериментах з
вивчення хронічної токсичності і лікувальних курсів (вміст лейкоцитів,
еритроцитів, гемоглобіну);

під час вивчення хронічної токсичності мало місце збільшення частоти
серцевих скорочень, зниження вольтажу зубців Р і Т на тлі тривалого
введення препарату; курсове введення мебіфону не спричиняє змін частоти
дихання і біоелектричної активності серця;

при тривалому застосуванні препарат не справляє патологічного впливу на
функції печінки і нирок, не викликає патоморфологічних змін в органах і
тканинах;

в умовах хронічного експерименту визначається підвищений руховий режим
дослідних тварин (рухова і орієнтувально- дослідницька реакції);

ін‘єкційна форма мебіфону не чинить пірогенної дії.

В умовах клінічного вивчення підтвердилася здатність препарату, крім
відзначеного прискорення згортання крові, знижувати вольтаж зубців Р і Т
у окремих хворих, що наведено в інструкції з його клінічного
застосування.

Як згадувалось раніше, важливою особливістю бісфосфонатів є структурна
аналогія з неорганічним пірофосфатом із заміною зв’язку -Р-О-Р- на
зв’язок – Р-С-Р-, стійкий до ферментативного гідролізу, лужного і
кислотного гідролізу (Peterson S. et al., 1977). Сполуки з тетраедричною
системою фосфору зазвичай погано проникають через плазматичні мембрани з
посиленням цієї здатності при патологічних станах, відмінностях її
вираженності залежно від структури. Для метиленбісфосфонової кислоти,
найбільш близької за структурою до неорганічного пірофосфату, що містить
два тетраедричні іони РО43-, описана здатність проникати в клітини
імунної системи, опорних тканин тощо шляхом полегшеної дифузії з
присутністю специфічного переносника (Fleisch Н. et al., 1969; Bonjour
J.P. et al., 1973; Trochler U. et al., 1975; Peterson S. et al., 1977;
Янимирский К.Б. и соавт., 1983; Robertson W.G. et al., 1972, 1973;
Subramaniav B. et al., 1975, 1983; Ell P.J. et al., 1976; Fischer K. et
al., 1977; Trechsel U., Schenk R., 1977; Yughes S.P.F., Kelly P.J.,
1977; Wang Т. et al., 1979; Silberstein E.B. et al., 1979; Haseman M.K.,
1983; Maniel G.A. Heyman S., 1983; Gerson M.C. et al., 1984; Фомовская
Г.Н., 1986; Комиссаренко С.В., 1989). Від ступеня проникнення
бісфосфонатів в клітини залежить вираженість їх впливу на процеси
метаболізму, активність окремих ферментних систем і, загалом, здатність
бісфосфонатів гальмувати пухлинний ріст, знімати пов’язану з ним
алгогенну дію, вплив на організм речовин, подібних до паратгормону тощо
(Shorey R.L. et al, 1971; Murray A.W., 1971; Kramer G. et al., 1976;
Bodan G.A. et al, 1977; Дмитренко Н.П., 1984; Комиссаренко С.В.,1989;
Золотухина М.М.и соавт.,1993; Ichinose Y. et al, 2000; Bergstrom JD. et
al, 2000; Montalvetti A. et al, 2001; Martin MB. et al., 2001;).
Важливою загальною властивістю бісфосфонатів, від якої залежить їх
тропність до кісткових тканин, мезенхімних утворень загалом, є здатність
утворювати стійкі комплекси з Са2+, іншими рідкоземельними і перехідними
металами. З вираженістю цієї властивості пов’язана здатність їх впливу
на розчинений і кристалічний СаР – основу мінеральної фази кістки
(Fleisch H. et al., 1969; Robertson W.G. et al., 1972; 1973; Гулая Н.М.,
Комиссаренко С.В., 1982).

Опираючись на дані літератури стосовно різновидів біологічних ефектів
бісфосфонатів у наших подальших дослідженнях були з‘ясовані особливості
можливого механізму дії мебіфону за наведеними напрямками.

Вивчення комплексоутворюючих властивостей мебіфону здійснювали
полярографічним методом з використанням ртутно-крапаючого електроду
(Kostyuk P.G. et al., 1981) у порівнянні з бонефосом (клодроновою
кислотою), для якого ця властивість є визначеною. Показано, що мебіфон,
подібно до бонефосу, має здатність до взаємодії з іоном кальцію, хоча і
поступається препарату порівняння за вираженістю хелатуючих
властивостей. Проте, варто відзначити, що протипухлинна активність
мебіфону має місце на всіх використаних штамах експериментальних пухлин,
зокрема, на стійкому до цитостатичних агентів варіанті карциноми Герена.
Бонефос в аналогічних умовах не виявляє значущої протипухлинної
активності, поступаючись у цьому мебіфону.

Оскільки у літературі ми не зустріли даних про вплив бісфосфонатів на
іонні канали, була досліджена дія мебіфону на кальцієві, натрієві і
калієві канали нейронів спінальних і тригемінальних гангліїв щура
(Hammill OP. et al., 1981; Kramer et al., 1994; Moraidis I., Bingman D.,
1994; Usachev Y. et al., 1995; Reiser MA. et al., 1996; Shirokova N.,
Rios E., 1996; Yao SL. et al., 1996; Mentz F. et al., 1996]. У дослідах
встановлено, що під впливом мебіфону кальцієві іонні канали Т- і L-типів
не змінювалися, у каналів N-типу в частини нейронів спінальних гангліїв
щура спостерігалося прискорення кінетики активації. Суттєво не
змінювалися як швидкі, так і затримані калієві струми. Спостерігався
істотний вплив препарату на активність натрієвих іонних каналів: при
зовнішній аплікації мав місце зсув вольтамперної характеристики для
максимумів вхідних натрієвих струмів з більш негативним значенням
потенціалу тощо. Відзначені зміни вимагають подальшого вивчення в плані
їх можливого обговорення в механізмах дії бісфосфонатів і мебіфону
зокрема.

Як відомо, кістковий мозок є джерелом двох ліній стовбурових
поліпотентних клітин: стромальної і гемопоетичної (Фриденштейн А.Я. и
соавт., 1973, 1980, 1981; 1985; Астахова B.C., 2000]. Перша дає початок
стромальним клітинам-попередникам, які вважаються регенераторним
потенціалом кісткової тканини та інш. (фібробласти, ретикуляторні
клітини, ендотеліальні клітини, попередники хондробластів, крім
остеобластів). Клітини проходять повний цикл диференціювання від ранніх
попередників до зрілих форм, які синтезують основну речовину з
відкладенням солей кальцію. Друга лінія – гемопоетична, яка дає початок
еритропоезу, лейкопоезу, мегакаріоцитам, моноцитам і остеокластам.
Особливо важливим моментом є належність остеокластів до моноцитарно-
макрофагального ряду. Система “остеобласт – остеокласт” підтримує
ремоделювання кістки, містить елементи різних за функцією стовбурових
клітин кісткового мозку.

Зважаючи на вищевказане нами було проведене вивчення впливу мебіфону на
стромальні стовбурові клітини кісткового мозку людини, їх трансферацію і
диференціювання в умовах дослідів клонування КУОф кісткового мозку
людини in vitro (Астахова B.C., 2000). Показано, що мебіфон не змінює
адгезивних властивостей стромальних клітин кісткового мозку.
Спостерігається збільшення кількості багатошарових колоній під впливом
препарату при тенденції (+21,4 %) підвищення ефективності клонування.
Отримані дані вказують на доцільність подальшого вивчення мебіфону
відносно стромальних стовбурових клітин.

Проведене також вивчення гістологічної структури і гістоморфометричних
показників компактної і губчастої кісткової тканини щурів-пухлиноносіїв
(карцинома Герена), як результуючих станів функціонування системи
“остеобласт – остеокласт”, в умовах курсового застосування мебіфону.
Показано, що мебіфон в режимі 40 мг/кг х 48 г х 6 введень у тварин без
пухлин не спричиняв змін кісткової тканини. У тварин-носіїв карциноми
Герена препарат запобігав онкогенним впливам, що спостерігалися у тварин
з пухлинами без лікувальних дій (зниження групового параметра кількості
кісткової тканини, показників, що характеризують активність остеогенезу.

У літературі наведені численні повідомлення щодо впливу бісфосфонатів, у
тому числі метиленбісфосфонової кислоти, на імунну систему (Фомовская
Г.Н., 1986). Значний об’єм аналітичних і експериментальних досліджень
імунотропної та імуномодулюючої дії мебіфону, проведений в Інституті
біохімії НАН України в 70-і – 80-і роки і узагальнений в роботах
Фомовскої Г.Н. (1986) та Комиссаренко С.В. (1989), можна представити
наступними положеннями:

показано тропізм препарату до лімфоїдних клітин;

гальмування біосинтезу антитіл до Т-залежних антигенів;

інгібіція реакцій клітинної імунної відповіді;

відсутність змін складу субпопуляції лімфоцитів;

вплив на функціональну активність Т-лімфоцитів;

не виявлено цитотоксичних властивостей метиленбісфосфонової кислоти
(відсутність впливу на утворення імунних лімфоцитів, мітогенного фактору
макрофагів, активації макрофагів цим фактором та ін.).

У наших дослідженнях підтверджена наявність імунотропної та
імуномодулюючої дії мебіфону (30-50 мг/кг), вивчені нові аспекти впливу
препарату на імунну систему. Зокрема, підтверджена здатність препарату
гальмувати утворення антитіл (ЙgI ( ЙgM) проти Т-залежного антигена
(еритроцити барана), пригнічувати реакцію гіперчутливості негайного і
сповільненого типів (ГСТ ( ГНТ), знижувати число відповідаючих клітин в
змішаній культурі лімфоцитів in vitro, пригнічувати розвиток реакції
“трансплантат проти господаря” in vivo.

Нами вивчений також вплив мебіфону на ранні етапи імуногенезу і імунну
відповідь. Показано, що мебіфон володіє помірною мітостатичною дією–
гальмує розмноження стовбурових клітин кісткового мозку в селезінці
(-36,0 % порівняно з контролем); міграцію стовбурових клітин з
кісткового мозку (Петров Р.В., Манько М.М., 1971; Петров Р.В., Манько
М.М., Хаитов Р.М. та ін., 1972) – 33,0 %; гальмує міграцію Т- і
В-лімфоцитів (-39,0 %; -55,0 %) ; кооперативну взаємодію Т- і
В-лімфоцитів (-39,0 %). При цьому препарат не виявляє лімфотоксичної
дії.

Встановлено низку важливих фактів щодо впливу мебіфону на
імунорегуляторні клітини крові і селезінки. Дослідження проведені з
використанням моноклональних антитіл, методів імунофлюоресцентного
забарвлення та імуноінструментального аналізу фірми Becton Diskinson
(США). Показана здатність мебіфону до значного збільшення відсоткової
кількості Lyt-2-позитивних клітин серед спленоцитів в експерименті:
певного збільшення числа L3T4+-клітин в периферичній крові мишей при
зниженні Thy-1- і Lyt-1-клітин, що вказує на імунорегуляторну дію
Мебіфону. Під впливом препарату спостерігалося тривале збільшення частки
Т-кілерів/супресорів (Lyt-2+) (селезінка), деяке переважання Т-хелперів
(L3T4) в периферичній крові. Доведена здатність мебіфону впливати на
експресію маркерів диференціювання та активації при культивації
лейкоцитів людини з мебіфоном (0,5 мкг/мл) in vitro: значне зниження
числа Т-лімфоцитів без супресорів/кілерів (CD3+8-),
T-лімфоцитів-кілерів/супресорів (CD3+/8+), різке збільшення числа
CD3-/8+-клітин, що мають різні функції, зокрема Т-кілерну. Відзначена
активація CD8+/CD69+-клітин – Т-кілерів/супресорів; зниження числа
CD3+/HLA-DR+-клітин. Препарат впливає на активаційні сигнали,
опосередковані експресією маркерів CD69+ і HLA-DR+.

В цілому, можна підсумувати, що мебіфон виявляє помірну регуляторну дію
на функціональну активність ряду клітинних субпопуляцій
імунокомпетентних клітин. Поряд з цим, у мебіфону відсутня властивість
стимулювати функціональну активність NK-клітин мишей (клітини-мішені –
лінія пухлинних клітин УАС-1 (Н-2а).

Отримані результати вказують на імунотропну дію мебіфону, починаючи з
ранніх етапів імуногенезу до різних етапів імунної відповіді, що
обгрунтовує доцільність його застосування при патологіях імунної системи
з конкретними імунними девіаціями.

Зважаючи на той факт, що елементи стромальної і гематопоетичної
стовбурових клітин беруть участь у формуванні процесів запалення (Петров
Р.В., Манько М.М. и соавт., 1972; Арипов УА. И соавт., 1976), а також
те, що пухлинний ріст нерідко супроводжується больовим синдромом,
перифокальним запаленням, гіпертермічною реакцією, яка є поганим
прогностичним симптомом відносно результату пухлинної хвороби (Тринус
Ф.П. и соавт., 1980), нами було проведене вивчення впливу мебіфону на
процеси запалення у експерименті. Показано, що для препарату властивий
значний анальгезувальний ефект на моделях термічного і хімічного
подразнення: зниження порогу больової чутливості на 57,8 і 44,0 %. Мала
місце незначна антиексудативна дія (формаліновий набряк), певна
жарознижувальна дія (-0,64 0С) на моделі пірогеналової лихоманки.
Отримані результати співпадають з відомими даними літератури, які
свідчать про наявність у бісфосфонатів антиноцицептивної активності
(Зигтз Б.Л., Мелтон Л. Дж., 2000).

В цілому, отримані матеріали з експериментального фармакологічного
вивчення Мебіфону засвідчують його здатність впливати на пухлинний ріст,
імуногенез, імунну відповідь, біль, запалення та тощо. Ці особливості
препарату у порівнянні з рядом відомих речовин групи бісфосфонатів
обґрунтовують його місце в онкологічній практиці при злоякісних
новоутвореннях з метастазами в кістках, перспективи використання
препарату при імунних девіаціях, запальних захворюваннях тощо.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

У дисертації наведені результати пошуку потенційних протипухлинних
речовин серед похідних гідразидів кислот фосфору, фосфорильованих
похідних сечовини, уретану та урацилу, похідних фосфорної кислоти та
фосфоранів. Отриманий масив даних використаний для вивчення залежності
“структура-дія” з визначенням шляхів пошуку нових протипухлинних
засобів. Надані результати доклінічного вивчення препарату “Мебіфон”,
який впроваджений у клінічну практику як засіб для лікування
онкологічних хворих з метастазами у кістках.

Вивчення протипухлинної активності 57 фосфоровмісних сполук 5 груп
(фосфорильовані гідразиди, уреїди, уретани, урацили, біс- і
монофосфонати) дозволило виявити 10 оригінальних речовин з вираженою
протипухлинною дією, перспективних для подальшого вивчення як
потенційних протипухлинних засобів (Ф-433, Ф-550, Ф-551, Ф-555, ФП-1,
ФП-10, ФП-12, М-1, 160189, 350189).

Вивчення залежності “структура – дія” серед 57 фосфоровмісних сполук з
використанням дисперсійного, кореляційного аналізу, визначення
електронної будови серед масиву сполук і окремих груп дозволило
визначити особливості, які можуть бути корисними при подальшому
конструюванні та оцінюванні нових сполук у зазначених напрямах:

серед фосфорильованих сечовин значною протипухлинною дією володіють
речовини з локалізацією ВЗМО на сечовинному або гідразидному фрагментах;

протипухлинна активність аддуктів 5-фторурацилу з фосфоровмісними
кислотами знижується при введенні замісників в бензольне кільце, заміні
дифенілових ефірів на диметилові;

у карбамоїлурацилів введення 2-ої карбомоїльної групи знижує
протипухлинний ефект;

введення замісників в метиленовий місток бісфосфонатів зменшує
протипухлинну активність та ін.

Відмічена кореляція вираженості протипухлинної дії вивчених сполук:

між лімфосаркомою Пліса, саркомою 45 і саркомою 180;

між епідермоїдною карциномою легенів Льюїс, меланомою В-16 і саркомою
180; отримані дані вказують на можливість прогнозування активності
сполук в зазначених системах за їх активністю на 1 –2 моделях.

Вперше, серед відомих бісфосфонатів, встановлена виражена протипухлинна
дія мебіфону в експерименті. Мебіфон:

володіє протипухлинною активністю (70,0 % на 6 моделях пухлинного росту
(вимога – 3);

володіє протипухлинною активністю (90,0 % на 2-х штамах (вимога – 1);

на 2-х моделях протипухлинну дію Мебіфону перевершує референс-препарат
на 50,0 % і більше (лімфосаркома Плісса, епідермоїдна карцинома легенів
Льюїс).

Мебіфон володіє стійким протипухлинним ефектом, здатністю гальмувати
занедбаний пухлинний ріст в межах прийнятого критерію значимості
(лімфосаркома Пліса – (50,0 % гальмування пухлинного росту).

Для орієнтації клінічної апробації проведено вивчення мебіфону на
злоякісних пухлинах молочної залози людини в підкапсульному тесті
(відсоток гальмування – 46,7 при критерії значимості (25,0 %). Зазначене
показання було підтверджене при клінічній апробації препарату.

Доклінічні токсикологічні дослідження Мебіфону, проведені відповідно до
вимог ДФЦ МОЗ України, підтвердили нешкідливість препарату. Відзначена у
експерименті властивість препарату до прискорення згортання крові,
зниження на ЕКГ потенціалів зубців Р і Т була підтверджена при клінічній
апробації. Ця інформація внесена як застереження до інструкції з
клінічного застосування.

На відміну від існуючих цитостатиків мебіфон не пригнічує систему
кровотворення; вигідним доповненням його фармакодинаміки є наявність
вираженої анальгезувальної, певної жарознижувальної дії.

Показана здатність мебіфону впливати на ранні етапи імуногенезу і імунну
відповідь (мітостатична дія, зниження показника міграції стовбурових
клітин кісткового мозку, зниження інтенсивності міграції Т- і
В-лімфоцитів та їхньої кооперативної взаємодії). Для мебіфону
характерний вплив на імунорегуляторні клітини крові і селезінки,
функціональну активність ряду клітинних субпопуляцій імунокомпетентних
клітин.

Мебіфон володіє здатністю зв’язуватися з іонами Са2+, не змінює
адгезивних властивостей стовбурових стромальних клітин кісткового мозку,
підвищує ефективність їх клонування, коригує онкогенні впливи на
кісткову тканину в експерименті.

11. Отримані дані послужили підставою для дозволу на клінічне
застосування мебіфону. Препарат зареєстрований в Україні.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Наукові статті

Скульская Н.Я., Проценко Л.Д., Авруцкая И.А., Кудрявцева И.Г. и др.
Синтез и антибластическая активность гидразидов фосфорилированных
хлорэтиламинов, модифицированных нитроксильными радикалами//
Химико-фармацевтический журнал. – 1992. – № 5. – С. 58-59.(Кудрявцева
І.Г. брала участь у вивченні антибластомної активності об’єктів
дослідження, в аналізі та узагальненні отриманих результатів)

Шарикіна Н.І., Кудрявцева І.Г., Танина С.С. та інші. Основні напрями
пошуку засобів лікування пухлинного захворювання// Ліки. – 1994. – № 4.
– С. 30-34. (Кудрявцевою І.Г. здійснено літературний пошук та
узагальнення даних).

Бобкова Л.С., Шарикіна Н.І., Кудрявцева І.Г. та інші. Антиокислювальні
властивості протипухлинних речовин – натулану та 3(2’,3’,4’-окси-) та
4’-метокси-фенілімінометилпіридинів//Фармацевтичний журнал. – 1997. –
№2. – С.79-82. (Кудрявцева І.Г. брала участь у експериментальних
фармакологічних дослідженнях, в аналізі та узагальненні отриманих
результатів).

Шарикіна Н.І., Пуськов О.М., Павловська Г.П., Таніна С.С., Кудрявцева
І.Г. та інші. Пухлинний ріст в умовах модуляції активності адрено- та
холінореактивних систем та протипухлинної терапії// Ліки. – 2000. – №5.
– С. 36-43. (Кудрявцева І.Г. брала участь у експериментальних
фарма-кологічних дослідженнях, в аналізі та узагальненні отриманих
результатів, написанні статті).

Кудрявцева І.Г., Голубов М.І., Бобкова Л.С. Комплексоутворення мебіфону
з катіоном кальцію// Ліки. – 2003. – № 3-4. – С. 101-103. (Кудрявцева
І.Г. визначила завдання та мету дослідження, брала участь у
експериментальних дослідженнях, в аналізі та узагальненні отриманих
результатів, написанні статті).

Шарыкина Н.И., Кудрявцева И.Г., Павловская Г.П. Влияние бифолара и
хлофидэна на синтез ДНК саркомы 45 и митотическая активность эпителия
тонкого кишечника крыс//УБЖ. – 2002. – №5. _ С. 112-116. (Кудрявцева
І.Г. визначила завдання та мету дослідження, брала участь у
експериментальних дослідженнях, в аналізі та узагальненні отриманих
результатів, написанні статті).

Шарыкина Н.И., Кудрявцева И.Г., Павловская Г.П. Белоксинтезирующий
аппарат клеток при злокачественном росте и фармакотерапии
хлофидэном//УБЖ. – 2002. – № 4. – С. 80-84. (Кудрявцева І.Г. визначила
завдання та мету дослідження, брала участь у експериментальних
дослідженнях, в аналізі та узагальненні отриманих результатів, написанні
статті).

Шарыкина Н.И., Кудрявцева И.Г., Павловская Г.П. К механизму действия
нового противоопухолевого препарата хлофидэна. Влияние на синтез РНК//
УБЖ. – 2003. – № 1. – С. 27-29. (Кудрявцева І.Г. визначила завдання та
мету дослідження, брала участь у експериментальних дослідженнях, в
аналізі та узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

Комісаренко С.В., Шарикіна Н.І., Андріанова С.М., Кудрявцева І.Г.,
Карлова Н.П. Фармакологічні властивості та механізм дії біфосфонатів//
Ліки. – 2003. – № 1-2. – С. 27-29. (Кудрявцева І.Г. брала участь у
визначенні завдання та мети дослідження, постановці експериментальної
частини, в аналізі та узагальненні отриманих результатів, написанні
статті.).

Кудрявцева І.Г. Вплив мебіфону на проліферацію і диференціювання
стромальних клітин – попередників кісткового мозку людини// Ліки. –
2003. – № 5-6. – С. 67-70. (Кудрявцевою І.Г. визначено мету, завдання
роботи, проведено досліди, аналіз, узагальнення результатів та написання
статті).

Шарыкина Н.И., Кудрявцева И.Г., Павловская Г.П. Цитотоксические эффекты
бифолара и хлофидэна. Влияние на синтез белка и клеточный цикл// УБЖ. –
2004. – № 1. –С.123-129. (Кудрявцева І.Г. брала участь у визначенні
завдання та мети дослідження, постановці експериментальної частини, в
аналізі та узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

Кудрявцева І.Г., Шарикіна Н.І. Сучасний стан пошуку і вивчення ФАР з
протипухлинною дією серед похідних кислоти фосфору. Огляд літератури
(частина І)// Ліки. – 2004. – № 1-2. – С. 31-40. (Кудрявцевою І.Г.
здійснено літературний пошук, аналіз та узагальнення літературних даних,
підготовку статті до друку).

Кудрявцева І.Г., Шарикіна Н.І. Сучасний стан пошуку і вивчення ФАР з
протипухлинною дією серед похідних кислоти фосфору. Огляд літератури
(частина ІІ)// Ліки. – 2004. – № 3-4. – С. 40-52. (Кудрявцевою І.Г.
здійснено літературний пошук, аналіз та узагальнення літературних даних,
підготовку статті до друку).

Кудрявцева І.Г., Шарикіна Н.І. Сучасний стан пошуку і вивчення ФАР з
протипухлинною дією серед похідних кислоти фосфору. Огляд літератури
(частина 3)// Ліки. – 2004. – № 5-6. – С. 19-23. (Кудрявцевою І.Г.
здійснено літературний пошук, аналіз та узагальнення літературних даних,
підготовку статті до друку).

Кудрявцева И.Г., Шарыкина Н.И., Карацуба Т.А. и др. Новый представитель
группы бисфосфонатов (доклинические исследования)// Онкология. – 2004. –
№ 3. С. 193-198. (Кудрявцева І.Г. брала участь у визначенні завдання та
мети дослідження, проведенні експериментальної частини, в аналізі та
узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

Шарикіна Н.І., Кузьменко І.І., Бухтіарова Т.А., Кудрявцева І.Г. та інші.
Біотрансформація хлофідену in vitro та in vivo// Ліки. – 2004. – № 5-6.
– С. 56-59. (Кудрявцева І.Г. брала участь у визначенні завдання та мети
дослідження, постановці експериментальної частини, в аналізі та
узагальненні отриманих результатів, написанні статті).

Шарикіна Н.І., Кудрявцева І.Г., Підгорський В.С. та інші. Імуномоделюючі
властивості бактерійних лектинів// Ліки. – 2007. – № 5-6. – С. 42-43.
(Кудрявцева І.Г. брала участь у визначенні завдання та мети дослідження,
постановці експериментальної частини, в аналізі та узагальненні
отриманих результатів, написанні статті).

Патенти

Авторское сивдетельство № 1835289 от 1992 г. Вещество, обладающее
антибластической активностью/ Овруцкий В.М., Клебанов Б.М., Шарыкина
Н.И., Глушко Л.П., Курочкина А.Ф., Кудрявцева И.Г. (Кудрявцева І.Г.
здійснила патентний пошук, брала участь у виконанні фармакологічних
досліджень, оформленні патенту).

Патент України № 12053 від 25.12.1996 р. Дигідрат динатрієвої солі
метиленбісфосфонової кислоти, який виявляє протипухлинну активність/
Комісаренко С. В., Шарикіна Н. І., Кудрявцева І. Г. та інш. (Кудрявцева
І.Г. брала участь у виконанні фармакологічних досліджень, оформленні
патенту).

Патент України № 10018 від 30.09.2006р. 3-(2’,3’,4’-окси) та
4’-метоксифенілімінометилпіридинів, що мають протипухлинну активність/
Бобкова Л.С., Овруцький В.М., Коляди О.П., Овруцький О.В., Шарикіна
Н.І., Кудрявцева І.Г. (Кудрявцева І.Г. брала участь у виконанні
фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Патент України № 17082 А від 21.04.1997. Потенційна протипухлинна
речовина/Сергєєв В. С., Овруцький В. М., Шарикіна Н. І., Кудрявцева І.
Г. (Кудрявцева І. Г. брала участь у виконанні фармакологічних
досліджень, оформленні патенту).

Патент України № 21453 А від 16.12.1997 р. Засіб, що має
інтерфероногенну та антибластичну активність/Овруцький В.М., Шарикіна
Н.І., Рибалко С.Л., Овруцький О.В., Кудрявцева І.Г. та інші. (Кудрявцева
І. Г. брала участь у виконанні фармакологічних досліджень, оформленні
патенту).

Патент України № 29639 А від 15.11.2000 р. Протипухлинний засіб/
Кузьменко І. Й., Зволінська Т. В., Шарикіна Н. І, Кудрявцева І. Г.
(Кудрявцева І. Г. здійснила патентний пошук, брала участь у виконанні
фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Патент України №36756 А від 15.08.2001 р. Спосіб лікування хворих із
злоякісними пухлинами молочної залози (мебіфон)/ Шарикіна Н. І.,
Кудрявцева І. Г., Кас’яненко І. В. та інш. (Кудрявцева І. Г. брала
участь у виконанні фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Патент України №40714 А від 15.08.2001р. Протипухлинний засіб –
динатрієва сіль метиленбісфосфонової кислоти (мебіфон)/ Комісаренко
С.В., Шарикіна H.I., Лозинський М.О., Кудрявцева І.Г. та інш.
(Кудрявцева І. Г. брала участь у виконанні фармакологічних досліджень,
оформленні патенту).

Патент України №52279 А від 16.06.2003.р. Бактерійний лектин –
протипухлинний засіб/ Подгорський В.С., Шарикіна Н.І., Коваленко Е.О.,
Кудрявцева І.Г., Гетьман К.І. (Кудрявцева І. Г. брала участь у виконанні
фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Патент України №73679 від 5.08.2005 р. Сполука
1,1’-(2”-бром-2”-хлоретеніл)-біс(5фторарацил)-у, яка має протипухлинну
активність/ Стефанов О.В., Вельчинська О.В., Шарикіна Н.І., Кудрявцева
І.Г. (Кудрявцева І.Г. здійснила патентний пошук, брала участь у
виконанні фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Заявка на патент № 200703652 от 03.04.2007 р. Аддукт 5-фторурацилу та
натрієвої солі дифеніл-фосфорної кислоти, який має протипухлиннк
активність (ФП-8)/Стефанов А.В., Шарикіна Н.І., Демченко А.М.,
Кудрявцева І.Г. та інші. (Кудрявцева І.Г. брала участь у виконанні
фармакологічних досліджень, оформленні патенту).

Матеріали з’їздів і конференцій

Олійник Г.М., Кудрявцева І.Г., Найштетік В.Я. та інші. Препарат для
лікування хворих на злоякісні пухлини головного мозку
(„Біпеск”)//Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та
погляд в майбутнє: Тез.доп.І Всеукр. НПК, Київ, 14-15 жовтня 2004 р. –
Онкологія. – 2004. – № 3. – С. 38-40.

Захаренко В.В., Найштетік В.Я, Кудрявцева І.Г., Шарикіна Н.І. та інші.
Фармакологічні властивості препарату „Пропес” (експериментальне
дослідження)//Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та
погляд в майбутнє: Тез.доп.І Всеукр. НПК, Київ, 14-15 жовтня 2004 р. –
Онкологія. – 2004. – № 3. – С. 36-37.

Шарикіна Н.І., Бухтіарова Т.А., Кузьменко І.Й., Кудрявцева І.Г. та інші.
Протипухлинний препарат Хлофіден (експериментальні і клінічні
дослідження)//Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та
погляд в майбутнє: Тез.доп.І Всеукр. НПК, Київ, 14-15 жовтня 2004 р. –
Онкологія. – 2004. – № 3. – С. 19-21.

АНОТАЦІЯ

Кудрявцева І. Г. Пошук та вивчення потенційних протипухлинних засобів –
похідних кислот фосфору (експериментальне дослідження) -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук за
спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Національний фармацевтичний
університет, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена пошуку та вивченню фосфоровмісних сполук
з протипухлинною дією. Відібрано 10 нових молекул з вираженою
протипухлинною дією серед фосфорильованих метилгідразидів, уреїдів
піримідинів та моно-і дифосфатів, перспективних для подальшого вивчення
і можливого впровадження. Вивчено залежність “структура-дія” з
визначенням шляхів пошуку нових протипухлинних засобів.

Запропонований перший бісфосфонат “Мебіфон”, що поєднує біологічні
властивості бісфосфонатів з вираженою протипухлинною активністю: (70,0 %
гальмування пухлинного росту (саркома 180, карцинома Герена,
епідермоїдна карцинома легенів Льюїс, лімфосаркома Пліса, саркома М-1,
карцинома 755). На 2-х останніх моделях протипухлинна активність
Мебіфону досягає (90,0 %. Препарат стійко утримує протипухлинний ефект,
активний при занедбаних формах пухлинного росту.

Мебіфон справляє значну анальгезувальну дію, виявляє жарознижувальні
властивості, здатність індукувати ангіогенез при відсутності пригнічення
гемопоезу. Показана здатність Мебіфону до сполучення з іонами кальцію,
відсутність впливу на адгезивні властивості стовбурових стромальних
клітин, підвищення активності їхнього клонування, запобігання онкогенним
впливам на кісткову тканину. Підтверджені імунотропні властивості
Мебіфону, визначена його здатність впливати на ранні етапи імуногенезу,
активність імунорегуляторних клітин, систему “остеокласт-остеобласт”.

Препарат зареєстрований в Україні як засіб лікування хворих із
злоякісними новоутвореннями молочної і передміхурової залоз з
метастазами до кісток.

Ключові слова: фосфорильовані функціонально активні реагенти,
біс-монофосфонати, протипухлинна активність, залежність “структура-дія”,
Мебіфон, механізм дії.

АННОТАЦИЯ

Кудрявцева И. Г. Поиск и изучение потенциальных противоопухолевых
средств – производных кислот фосфора (экспериментальное исследование) –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук по
специальности 14.03.05 – фармакология. – Национальный фармацевтический
университет, Харьков, 2007.

Диссертационная работа посвящена поиску и изучению фосфорсодержащих
соединений с противоопухолевым действием. Найдено 10 новых молекул с
выраженным противоопухолевым действием: (-метилгидразид Ф-433;
фосфорилированные мочевины Ф-550, Ф-551 и Ф-555; фосфорилированные
урацилы ФП-10, ФП-12; бисфосфонаты М-1 и О-1; производные фосфорной
кислоты 160189, 350189. Отмеченные вещества представляют интерес для
дальнейшего изучения как потенциальные противоопухолевые средства. В
соответствии с существующими требованиями к потенциальным
противоопухолевым средствам ((90,0 % торможения – 1 штамм; 70,0 % – 3
штамма) каждое из приведенных веществ (90,0 % тормозит 1 из принятых
штаммов опухоли и более, значительное число веществ проявляет активность
(70,0 % торможения роста опухолей либо на уровне принятого критерия
значимости каждой модели. Полученный при фармакологическом исследовании
массив данных использован для изучения зависимости “структура-действие”
с определением путей поиска новых противоопухолевых средств.

Результаты фармакологического скрининга позволили выделить для
дальнейшего изучения с целью создания нового противоопухолевого
препарата бисфосфонат под шифром „М-1”, получивший название “Мебифон”.
Мебифон сочетает биологические свойства бисфосфонатов с выраженной
противоопухолевой активностью: (70,0 % торможения опухолевого роста
(саркома 180, карцинома Герена, эпидермоидная карцинома легких Льюис,
лимфосаркома Плисса, саркома М-1, карцинома 755). На 2-х последних
моделях противоопухолевая активность Мебифона достигает (90,0 %.
Препарат стойко удерживает противоопухолевый эффект, активен при
запущенных формах опухолевого роста.

Мебифон оказывает выраженное анальгезирующее действие, выявляет
жаропонижающие свойства, способность индуцировать ангиогенез при
отсутствии угнетающего влияния на гемопоэз.

Показана способность Мебифона связываться с ионами кальция, не изменять
адгезивных свойств стволовых стромальных клеток, повышать активность их
клонирования, снимать онкогенные влияния на костную ткань.

Подтверждены иммунотропные свойства Мебифона, отмечена его способность
влиять на ранние этапы иммуногенеза (митостатическое действие, снижение
способности стволовых клеток к миграции из костного мозга, ослабление
миграции Т-и В-лимфоцитов и их кооперативного действия при отсутствии
лимфотоксичности). С помощью моноклональных антител отмечен ряд важных
фактов о влиянии мебифона на иммунорегуляторные клетки крови и
селезенки. Отмечена активация CD8+/CD69+-клеток –
Т-киллеров/супрессоров; снижение числа CD3+/HLA-DR+-клеток. Препарат
влияет на активационные сигналы, опосредованные экспрессией маркеров
CD69+ і HLA-DR+. Не отмечено способности мебифона к стимуляции
функциональной активности NK-клеток мышей (клетки-мишени – линия
опухолевых клеток УАС-1 (Н-2а).

Доказана безопасность Мебифона при кратковременном и продолжительном
использовании.

Мебифон разрешен для медицинского применения как средство лечения
больных со злокачественными новообразованиями молочной и предстательной
желез с метастазами в кости. Зарегистрирован в Украине.

Ключевые слова: фосфорилированные функционально активные реагенты, бис-
и монофосфонаты, противоопухолевая активность, зависимость
“структура-действие”, Мебифон, механизм действия.

SUMMARY

Kudryavtzeva I.G. Search and study the potential antitumour agents –
phosphoric acid derivatives (experimental study) – A manuscript.

A thesis for Doctor in Pharmacy Degree in Specialty 14.03.05 –
Pharmacology. – National University of Pharmacy, Kharkov, 2007.

The dissertation is devoted to search and study of phosphor containing
combinations with antitumour action. Ten new molecules with the marked
antitumour action are found among phosphorylated methylhydrazides,
ureides, pyrimidines and monophosphates. The “structure-action”
relation was studied.

The first biophosphonate Mebifon combining the properties of
biophosphonates with the marked antitumour action presented the
following: the antitumour growth inhibition (sarcoma 180, Heren’s
carcinoma, Luis’s pulmonary epidermoid carcinoma, Plis’s lymphatic
sarcoma, sarcoma M-1, adenocarcinoma of breast – Ca755) > 70.0%. In two
last models the effect is > 90%. The drug keeps steady the antitumour
effect and is active in neglected stage of tumour growth.

The drug showed the marked analgesic action, febrifugal activity, can
induce the angiogenesis under the absence of hemopoesis depression.

The immunotropic properties of the drug Mebifon were proved, and its
ability to influence on the early stages of the immunogenesis, on the
activity of the immunoregulatory cells, on the “osteoblast-osteclast”
system was determined.

The Mebifon is certified in Ukraine.

Key words: phosphorylated functionally active reagents, pyrimidines,
bis- and monophosphonates, antitumour effect, “structure – action”
relation, Mebifon, antitumour activity, mechanism of action.

Підписано до друку 31.08.2007 р. Формат 60х84/16.

Папір офсетний. Гарнітура Times. Друк різографія.

Умов.друк.арк. 1,6. Наклад 100 прим. Замов. № 467

Віддруковано з оригінал-макету на ФОП „Петрова І.В.”

м. Харків, вул.. Гв.Широнінців, 79в, к. 137, тел. 778-60-34

Свідоцтво про держреєстрацію В00 № 948011 від 03.01.03 р.

Свідоцтво про внесення суб’єкта видавничої справи до державного

реєстру видавців, виготівників і розповсюджувачів видавничої

продукції серія ХК № 134 від 23.02.05 р.

PAGE 10

PAGE 37

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter