Поєднаний вплив солей кадмію, кобальту та рентгенівських променів на захисні системи тварин та шляхи корекції виявлених порушень (реферат)

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ЛИХАЦЬКИЙ Петро Григорович

УДК 612.015.11.017-02:546.48+546.537.531]-092.9

Поєднаний вплив солей кадмію, кобальту та рентгенівських променів на
захисні системи тварин та шляхи корекції виявлених порушень

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському державному медичному університеті

імені І.Я. Горбачевського Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

ФІРА Людмила Степанівна,

Тернопільський державний медичний

університет ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри фармакогнозії

з медичною ботанікою

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СОЛОГУБ Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин Української

академії аграрних наук,

головний науковий співробітник

лабораторії обміну речовин

доктор біологічних наук, професор,

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович,

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії коферментів

Провідна установа – Національний медичний університет
імені О.О. Богомольця Міністерства охорони здоров’я України,
кафедра біоорганічної,

біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ

Захист відбудеться „ 19” _червня 2007 р. о _12 00_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин
УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий „_18_” _травня_ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтенсивний розвиток металургійної, автомобільної
індустрії, хімізація побуту різні техногенні катастрофи зумовлюють
значне забруднення довкілля важкими металами (Гонський Я.І.,
Соловодзінська І.Є., 2002; Дмухальська Є.Б., 2003).

Важкі метали мають виражені мембранотоксичні властивості, впливають на
активність ферментів та перебіг біохімічних процесів, здатні до
кумуляції у тканинах і за тривалої дії спричинюють віддалені негативні
ефекти (Губський Ю.І., Ерстенюк Г.М., 2003). Надходження в організм
надлишкових концентрацій солей важких металів та металів із змінною
валентністю викликає зростання вмісту активних форм кисню (АФК),
посилення процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), пошкодження
різних типів біомакромолекул. При цьому рівновага в системі
прооксиданти-антиоксиданти зсувається в сторону нагромадження молекул з
прооксидантними властивостями та розвивається оксидативний стрес в
організмі тварин (Забродский П.Ф., 1998; Калиман П.А., 2001, Засекин
Д.А. 2002).

Серед важких металів, які суттєво впливають на функції органів та систем
людини і тварин, за токсичністю одне з перших місць посідають кадмій та
кобальт (Губский Ю.И. и др. 1993; Гонський Я.І. та ін. 2002; Калиман
П.А. и др. 2000, 2005).

У житті часто має місце поєднаний вплив декількох токсичних чинників на
організм. Звідси доцільним є дослідження одночасного впливу декількох
токсикантів на організм людини.

Останнім часом людина щоденно піддається впливові низькодозового
радіаційного опромінення, що може поглибити загальну інтоксикацію
організму після ураження хімічними речовинами. Тому обгрунтованим стає
вивчення механізмів поєднаного впливу хімічних токсинів та радіаційного
опромінення на організм людини.

Значний інтерес становить дослідження впливу нових антиоксидантів,
ентеросорбентів, імуномодуляторів та субстанцій з лікарської рослинної
сировини з антиоксидантними та сорбційними властивостями на організм
людини та тварин за поєднаної дії різних хімічних токсикантів та низьких
доз радіоактивного опромінення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота тісно пов’язана з плановою науковою темою кафедри фармакогнозії з
медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім.
І.Я. Горбачевського “Фармакогностичне вивчення деяких видів лікарських
рослин” № держреєстрації-0105U004109, в якій автор
досліджував зміни функціональної активності антиоксидантної та імунної
систем захисту, стан мембранних структур гепатоцитів та еритроцитів за
умов поєднаного отруєння тварин солями кадмію та кобальту на тлі
низькодозового радіаційного опромінення, а також вивчав ефективність
використання за цих умов антиоксидантів, ентеросорбентів,
імуномодуляторів та субстанцій з конюшини лучної.

Мета і завдання дослідження. Встановити особливості метаболічних
порушень за умов поєднаного токсичного ураження щурів солями кадмію та
кобальту на тлі низькодозового радіаційного опромінення та запропонувати
способи їх корекції із використанням антиоксидантів, ентеросорбентів,
імуномодуляторів та субстанцій з конюшини лучної.

Для досягнення поставленої мети було сформовано такі основні завдання:

Вивчити ступінь порушення процесів ліпопероксидації та стан клітинних
мембран гепатоцитів та еритроцитів за умов поєднаного ураження тварин
хлоридами кадмію та кобальту на тлі низькодозового радіаційного
опромінення.

Дослідити рівень ендогенної інтоксикації в організмі тварин, одночасно
уражених солями кадмію, кобальту та радіацією низької інтенсивності.

Дослідити активність захисних систем організму, зокрема, антиоксидантної
та імунної, у щурів після отруєння їх хлоридами кадмію та кобальту в
поєднанні з низькими дозами іонізуючої радіації.

Вивчити вплив антиоксиданту тіотриазоліну на метаболічні порушення в
організмі тварин після ураження їх солями кадмію та кобальту на тлі
опромінення.

Обґрунтувати можливість застосування ентеросорбенту фібросилу для
зниження ендогенної інтоксикації в організмі щурів, уражених солями
важких металів та низькодозовим випромінюванням.

Провести вивчення імуномодуляторних властивостей тималіну за умов
радіаційно-хімічної інтоксикації.

Вивчити хімічний склад трави конюшини лучної з метою виявлення
біологічно активних речовин.

Дослідити ефективність використання субстанцій з трави конюшини лучної
для корекції метаболічних порушень, виявлених у тварин після ураження їх
хлоридами кадмію та кобальту на тлі радіаційного ураження.

Об’єкт дослідження – хімічне ураження тварин хлоридами кадмію та
кобальту на тлі низькодозового радіаційного опромінення після
застосування тіотриазоліну, тималіну, фібросилу та субстанцій з конюшини
лучної.

Предмет дослідження – показники вільнорадикального окиснення (ВРО),
ендогенної інтоксикації (ЕІ), ферментативної та неферментативної
антиоксидантної системи, гуморальної та клітинної ланок імунітету в
організмі тварин з токсичним ураженням солями кадмію та кобальту на тлі
низькодозового радіаційного опромінення та після корекції
тіотриазоліном, фібросилом, тималіном та лікарськими формами з трави
конюшини лучної, хімічний склад трави конюшини лучної.

Методи дослідження – біохімічні (спектрофотометричні, титриметричні),
біофізичні (атомна спектрофотометрія), імунологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено активацію
процесів ліпопероксидації (підвищення вмісту ТБК-реагуючих продуктів в
сироватці крові та печінці) та збільшення ступеня проникності клітинних
мембран гепатоцитів (підвищення активності амінотрансфераз) та
еритроцитів (підвищення еритроцитарного індексу) за умов поєднаного
отруєння щурів солями кадмію та кобальту на тлі низькодозового
радіаційного опромінення.

Виявлено зниження активності каталази та вмісту відновленого глутатіону
в сироватці крові уражених тварин, що вказує на пригнічення системи
антиоксидантного захисту в умовах радіаційно-хімічної інтоксикації.

Встановлено підвищення ступеня ендогенної інтоксикації, що проявляється
збільшення вмісту молекул середньої маси (МСМ) в сироватці крові та
печінці тварин в умовах поєднаного впливу на організм радіаційного
опромінення та солей важких металів, зокрема хлоридів кадмію та
кобальту.

У тварин, які зазнали опромінення та отруєння хімічними токсинами,
виявлено пригнічення активованих процесів ліпопероксидації та
стабілізації проникності клітинних мебран після застосування
антиоксиданта тіотриазоліну.

Для зменшення ендогенної інтоксикації після опромінення уражених тварин
та отруєння важкими металами вперше запропоновано природний
ентеросорбент фібросил.

Вперше показано нормалізуючий вплив імуномодулятора тималіну на
показники гуморальної ланки імунної системи (зменшення вмісту
циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та неспецифічної резистентності
організму (підвищення фагоцитарної активності лейкоцитів) тварин після
ураження їх ксенобіотиками в поєднанні з низькодозовим радіаційним
опроміненням.

Для корекції виявлених порушень окиснювальних процесів, а також
захисних систем за умов радіаційно-хімічної інтоксикації вперше
використано субстанції з конюшини лучної і доведено доцільність їх
подальшого вивчення з метою застосування в практичній медицині.

Практичне значення результатів. Запропоновано метод визначення вмісту
МСМ для оцінки ступеня ураження організму і важкості перебігу
радіаційно-хімічного токсикозу.

Вивчення хімічного складу конюшини лучної та виявлення великої
кількості біологічно активних речовин з антиоксидантними властивостями
стало основою для вивчення в експерименті коригуючої дії субстанцій з
рослини, що дозволить у подальшому її використання за умов ураження
ксенобіотиками.

На основі проведених досліджень можна вважати обґрунтованим використання
коригуючих чинників, які впливають на різні ланки метаболічних порушень
за хімічних та променевих уражень: антиоксидант та мембранопротектор
тіотриазолін, ентеросорбент фібросил, імуномодулятор тималін, а також
екстракт та суха трава з конюшини лучної, які проявили антиоксидантні та
сорбуючі властивості.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено фітохімічні,
біохімічні та біофізичні дослідження, статистична обробка результатів,
оформлення роботи, обговорення отриманих результатів. Імунологічні
дослідження проведено з допомогою співробітників Центральної
науково-дослідної лабораторії Тернопільського державного медичного
університету імені І.Я. Горбачевського та імунологічної лабораторії
діагностичного центру ТДМУ, за що автор висловлює їм щиру подяку.

За керівництво у виконанні дисертаційної роботи автор висловлює щиру
подяку завідувачу кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою
Тернопільського державного медичного університету
імені І.Я. Горбачевського, доктору біологічних наук,
професору Фірі Людмилі Степанівні.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які
проводились в ході виконання дисертаційної роботи, доповідались на
науково-практичних конференціях з міжнародною участю, присвячених
питанням біологічного окиснення (Тернопіль, 2004, 2006), Всеукраїнській
науково-практичній конференції „Хімія природних сполук” (Тернопіль,
2005), ІХ-ому Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених
(Тернопіль, 2005), VI-ий національний з’їзд фармацевтів України (Харків,
2005), Міжнародній конференції (Пущино, 2006), I-ій Міжнародній
науково-практичній конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація
технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль,
2006). II-ій Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів
(Львів, 2006).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, з
яких 6 у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 7
робіт у матеріалах і тезах симпозіумів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів власних
досліджень, аналізу та узагальнення досліджень, висновків, практичних
рекомендацій та списку використаної літератури із 286
найменувань (з них 64 іноземних джерел). Загальний обсяг дисертаційної
роботи становить 173 сторінки. Основна частина роботи викладена на 104
сторінках, містить 35 таблиць і 16 рисунків. Загальний обсяг ілюстрацій
і таблиць – 28 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури присвячений вивченню механізмів впливу солей кадмію,
кобальту та низьких доз радіаційного опромінення на організм тварин та
людини, зокрема, на перебіг вільнорадикальних процесів, стан захисних
систем та клітинних мембран. В огляді висвітлено основні методи корекції
метаболічних порушень, які застосовують для зниження ендогенної
інтоксикації в ураженому важкими металами та радіацією організмі.

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на білих безпородних
щурах-самцях масою тіла 150-170 г, які утримувались на стандартному
раціоні у віварії. У дослідах використано 234 тварини.

Моделями токсичного ураження тварин слугувала інтоксикація солями важких
металів (хлоридами кадмію та кобальту), на тлі радіаційного опромінення.
Хлорид кадмію та кобальту тварини отримували триразово (через день)
інтрагастрально з допомогою зонда у вигляді водного розчину в дозі 3,4
мг/кг (для CdCl2) та 2,4 мг/кг (CoCl2), що становить 1/25 від ЛД50
(Бандман А.Л. и др., 1988; Ершов Ю.А., Плетенова Т.В., 1989) для
відповідних солей.

Тварин піддавали одноразовому опроміненню за допомогою рентгенівського
апарату РУМ-17. Поглинута доза становила 1 Гр, яку контролювали
дозиметром. Евтаназію проводили з використанням тіопенталу натрію на 1,
7, 14 та 21-шу доби після опромінення та введення солей важких металів
(Блюгер А.Ф., Карташева О.Я., 1983). Кров забирали із серця тварин.

Об’єктом дослідження слугували гомогенат печінки, цільна кров та
сироватка крові.

Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1 – контроль –
здорові щури; 2 – тварини, отруєні солями CdCl2 та CoCl2 на тлі
радіаційного опромінення (уражені); 3 – уражені тварини, що отримували
екстракт з конюшини; 4 – уражені тварини, яким щоденно вводили фібросил;
5 – уражені тварини, які піддавались корекції тималіном; 6 – уражені
тварини, яким протягом експерименту вводили тіотриазолін; 7 — уражені
тварини, які отримували суху подрібнену траву конюшини, суспензовану на
1 % розчині крохмалю.

Тіотриазолін вводили внутрішньом’язево щоденно у вигляді
водного розчину в дозі 20 мг/кг протягом всього експерименту
(Мазур И.А., 2005). Тималін вводили внутрішньоочеревинно щоденно
протягом експерименту в дозі 20 мг/кг (Корда М.М., 1998). Фібросил
тварини отримували щоденно внутрішньошлунково у вигляді крохмальної
суспензії в дозі 1 г/кг маси тіла (Фіра Л.С., 2002). Аналогічно
фібросилу вводили суху траву конюшини. Екстракт із трави конюшини (10
%-ий водний) щури отримували внутрішньошлунково в дозі 1,7 мл на
тварину.

Вміст ТБК-реагуючих продуктів визначали в реакції з тіобарбітуровою
кислотою (Стальная И.Д., 1977), активність каталази [КФ 1.11.1.6]
досліджували фотоелектроколориметричним методом за інтенсивністю
забарвлення комплексу, який утворюється при взаємодії пероксиду водню з
молібдатом амонію (Королюк М.А. и др., 1988), вміст відновленого та
окисненого глутатіону – за методом Ellmanа (G.L.Ellman, 1959). Про
ступінь ендогенної інтоксикації організму судили за вмістом МСМ
(Габриєлян Н.И. и др., 1983), ЕІІ (Тогайбаев А.А. и др.,
1988), а також за вмістом MetHb, який визначали ціангідриновим методом
(Покровський А.А., 1969). Проникність плазматичних мембран гепатоцитів
вивчали за активністю АсАТ [КФ 2.6.1.1] та АлАТ [КФ 2.6.1.2] — в
реакції з 2,4-динітрофенілгідразином (Покровский А.А., 1969). Стан
гуморальної ланки імунної системи організму оцінювали за вмістом ЦІК в
реакції преципітації з поліетиленгліколем 6000, а також за вмістом
імуноглобулінів А, G, M, які визначали спектрофотометричним методом
(Чернушенко Е.Ф., 1978). Неспецифічну резистентність визначали за
фагоцитарною активністю нейтрофілів, яку досліджували, враховуючи
кількість поглинутих мікроорганізмів нейтрофільними лейкоцитами при їх
контакті з добовою культурою Staphylococcus aureus Р-209 (Козлюк А.С.,
1987).

Фітохімічним дослідженням піддавали суху траву конюшини лучної. У
сировині методом титрування 2,6-дихлоріндофенолятом натрію визначали
вміст вітаміну С (ДФ ХІ, 1987), за окисненням дубильних речовин
перманганатом калію встановлювали вміст вітаміну Р (Березов Т.Т.
и др., 1976), екстракцією гексаном з подальшим визначенням оптичної
густини спектрофотометрично досліджували вміст вітаміну К (Бензель Л.В.,
1995). Загальну суму флавоноїдів з рослинної сировини екстрагували 95 %
етанолом і визначали при довжині хвилі 410 нм (Комарова М.Н., 1998),
вміст каротиноїдів – спектрофотометрично після екстракції гексаном
(Бензель Л.В.,1995). Методом атомно-абсорбційної хроматографії
встановлювали вміст макроелементів (калій, натрій, магній, кальцій) та
мікроелементів (цинк, залізо, марганець, мідь) у траві та квітках
конюшини (Єрмаков А.И.,1987).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер
Е.В., 1978), який проводили з використанням критерію Ст’юдента. Зміни
вважали достовірними при р<0,05. Результати дослідження та їх обговорення Метаболічні порушення в організмі тварин, викликані поєднаною дією солей кадмію та кобальту на тлі радіаційного опромінення. Показано, що при одночасній дії вказаних чинників у сироватці крові вміст ТБК-реагуючих продуктів вірогідно (р<0,05) зростав на 7-у, 14-у та 21-у доби дослідження і становив відповідно 19,48±1,60; 14,15±0,82 та 17,37±1,16 мкмоль/л у порівнянні з 8,62±0,53 мкмоль/л у тварин контрольної групи. Аналогічну тенденцію до зростання цього показника відзначено і у печінці уражених тварин. Найвищим вміст ТБК-реагуючих продуктів був на 14-у добу експерименту і становив 570 %. На 21-у добу їх вміст знизився, але ще на 108 % перевищував норму (рис. 1). Рис. 1. Вміст ТБК-реагуючих продуктів у печінці шурів, уражених солями Cd, Co та радіаційним опроміненням, % Ураження тварин важкими металами призводить до нагромадження АФК, які у свою чергу, активують вільнорадикальні процеси в організмі. Низькодозове радіаційне опромінення посилює цей процес, в організмі різко збільшується кількість ендогенних токсинів. Активація вільнорадикальних процесів в організмі тварин супроводжується деструкцією білкових молекул. Про це свідчать результати досліджень вмісту МСМ, які є продуктами деградації білків-ферментів, структурних білків, гормонів. Як у сироватці крові, так і в печінці уражених хлоридами кадмію та кобальту тварин на тлі радіаційного опромінення відзначено вірогідне підвищення вмісту фракцій МСМ (СМ1 – переважають ланцюгові амінокислоти та СМ2 – переважають ароматичні амінокислоти). Найвищий їх вміст припадав на 7-у та 14-у доби дослідження, що свідчить про розвиток деструктивних процесів саме у цей період. Підтвердженням цьому є вивчення еритроцитарного індексу інтоксикації (ЕІІ) та вмісту метгемоглобіну (MetHb) у крові уражених тварин. Через 7 днів з моменту ураження вміст MetHb зріс у 2,3 рази, а через 14 днів – у 2,6 рази. Уже на 1-у добу з початку дії токсинів відзначено вірогідне збільшення ЕІІ (р<0,05), тобто підвищилась проникність еритроцитарної мембрани. Відсоток проникності еритроцитарної мембрани (судили за еритроцитарним індексом інтоксикації) збільшувався до кінця експерименту і на 21-у добу на 32 % перевищував таку в контрольних тварин. Це зумовило надходження в кров багатьох внутрішньоклітинних компонентів. Нами відзначено вірогідне підвищення (р<0,05) активності амінотрансфераз у сироватці крові. У випадку пошкодження мембран гепатоцитів, відбувається вихід у сироватку крові цих ферментів, де нами відзначено високу їх активність Підвищення активності АсАТ і АлАТ спостерігалось також у печінці щурів після ураження досліджуваними токсичними чинниками (табл. 1). Таблиця 1 Активність АсАТ та АлАТ у печінці щурів, уражених солями Cd, Co та радіаційним опроміненням, мкмоль/кг·год (М±m; n=6) Показники Контрольні тварини Строки дослідження, доби 1-а 7-а 14-а 21-а АсАТ 31,75± 1,50 34,75± 2,24 р>0,05 37,67± 1,80

р<0,05 35,58± 2,50 р>0,05 33,33± 1,95

р>0,05

АлАТ 86,50± 2,80 97,50± 3,08

р<0,05 94,00± 3,30 р>0,05 98,33± 2,30

р<0,05 99,89± 3,27 р<0,05 У перші терміни дослідження (7-а доба) відзначено підвищення активності каталази в сироватці крові, що може бути адаптогенною реакцією на утворення великої кількості вільнорадикальних продуктів в ураженому організмі. На 14-у добу з початку експерименту активність каталази знизилась на 73 %, а на 21-у – на 51 %. У ці ж терміни спостерігалось зниження активності каталази в печінці. В усі періоди експерименту у сироватці крові щурів ураженої групи вірогідно зростав (р<0,05) вміст відновленого глутатіону. Його кількість на 21-у добу зросла у 2,5 рази у порівнянні з контрольними тваринами (6,44± 0,28 мкмоль/л). З отриманих результатів видно, що глутатіонова система швидко включається у захист організму від вільних радикалів. При визначені вмісту відновленого глутатіону в печінці дослідних тварин нами встановлено зниження його протягом всього періоду дослідження. Позитивним прогнозом для ураженого організму є підвищення редокс-індексу (співвідношення між окисненою та відновленою його формами) глутатіонової системи. Відразу після ураження щурів досліджуваними токсичними чинниками різко знижувався цей показник, але до кінця експерименту він дещо підвищувався, що може вказувати на пригнічення окиснювальних процесів у пізні терміни. Відомо, що антиоксидантна система перебуває в реципрокній залежності з імунною. При дослідженні вмісту ЦІК в сироватці крові уражених тварин встановлено підвищення їх кількості протягом всього експерименту (табл. 2) в порівнянні з контрольною групою тварин (40,60 ±3,67 ум.од./л). Таблиця 2 Вміст ЦІК у сироватці крові та фагоцитарна активність лейкоцитів у щурів, уражених солями Cd, Co та радіаційним опроміненням, (М±m; n=6) Показники Контрольні тварини Строки дослідження, доби 1- а 7- а 14 – а 21 – а ЦІК, ум.од/л 40,60 ±3,67 46,00 ±2,32 р> 0,05 51,50 ±3,53

Р< 0,05 64,80 ±4,58 р< 0,05 58,40 ±5,50 р<0,05 Фагоцитарне число, % 3,40 ±0,25 2,60±0,15 р<0,05 2,25±0,12 Р<0,05 1,85±0,08 р<0,05 2,30±0,10 р<0,05 Фагоцитарний індекс, % 25,00±2,00 22,00±1,20 р>0,05 18,40±1,00

Р<0,05 15,70±0,90 р<0,05 18,20±1,20 р<0,05 Нами відмічено зміни клітинного імунітету, а зокрема, фагоцитарного числа та фагоцитарного індексу. Встановлено суттєве пригнічення, як фагоцитарного числа, так і фагоцитарного індексу протягом всього експерименту. На 14-у та 21-у доби експерименту фагоцитарне число було відповідно в 1,8 та 1,5 рази нижчим від рівня контрольних тварин (3,40 ±0,25 %). Аналогічна тенденція до зниження виявилась і для фагоцитуючих лейкоцитів (табл. 2). Відсоток їх зменшився в останні терміни дослідження був найбільшим і становив 63 % і 73 % на 14-у та 21-у доби від рівня контрольних тварин (25,00±2,00 %). Таким чином, введення в організм щурів солей кадмію та кобальту на тлі радіаційного опромінення призводить до активації гуморальної ланки імунітету та пригнічення фагоцитарної здатності нейтрофілів. Вплив тіотриазоліну, фібросилу, тималіну та субстанцій з трави конюшини лучної на метаболічні порушення в організмі тварин, уражених солями кадмію та кобальту на тлі радіаційного опромінення. Введення досліджуваним тваринам солей Cd та Co викликає активацію процесів перекисного окиснення ліпідів, проміжні та кінцеві продукти яких призводять до деградації ліпідних та білкових компонентів мембран. З метою створення нових лікарських засобів з антиоксидантними та сорбтивними властивостями на основі рослинної сировини нами досліджено хімічний склад конюшини лучної, яка зростає на території Тернопільської області. Встановлено, що трава конюшини містить велику кількість поліфенольних сполук, зокрема, флавоноїдів, які можуть проявляти антиоксидантні властивості (табл. 3). . V ? O ae ? , . Z ? O & r ? TH & @&^„`„? o o o o o o ¤µ¦µ?µL?TH»th3/4F=111 o `„Aea$ Таблиця 3 Вітамінний склад та вміст флавоноїдів в траві конюшини лучної (на 100 г сировини), мг (М±m; n=6) Показник Трава Вітамін С 97,00±8,23 Вітамін Р 0,61±0,01 Вітамін К 0,044±0,006 Каротиноїди 10,30±0,60 Флавоноїди 221,03±12,01 Крім того, в траві конюшини в значних кількостях знаходяться вітамін С (97,00±8,23 мг на 100 г сировини) та каротиноїди (10,30±0,60 мг на 100 г сировини). Це дозволило нам використати субстанції з рослини в експерименті на тваринах з метою виявлення їх коригуючого впливу на уражений організм в умовах радіаційно-хімічної інтоксикації. Найефективніший вплив на вміст ТБК-реагуючих продуктів у сироватці крові проявив тіотриазолін, який протягом 3-ох останніх термінів дослідження вірогідно їх знизив і був на 7-у добу на 33 % нижчим рівня уражених тварин, на 14-у та 21-у доби – на 41 % та 89 % відповідно. Субстанції з трави конюшини та фібросил виявились менш ефективними, хоча протягом всього експерименту після їх введення в організм уражених тварин вміст ТБК-реагуючих продуктів знижувався як у сироватці крові, так і в печінці дослідних щурів. Активація процесів ВРО та токсичні продукти, що при цьому утворюються спричиняють деструктивний вплив на мембрани клітин, чим поглиблюють інтоксикацію організму. Відомо, що про ступінь ендогенної інтоксикації судять за вмістом у сироватці крові та тканинах МСМ. Позитивний вплив на вміст СМ1 у сироватці крові проявили всі використані коригуючі чинники, крім тималіну. У тварин, які отримували фібросил та тіотриазолін вміст СМ2 знижувався в усі періоди дослідження та вірогідно (р<0,05) відрізнявся від вмісту такого в уражених тварин. Вірогідне зниження цього показника зареєстровано нами під впливом 10 %-го екстракту конюшини лучної та трави конюшини (54,33±0,95 та 52,67±1,12 ум.од./л відповідно в порівнянні з ураженими тваринами – 72,00±1,55 ум.од./л ) на 7-у добу від початку експерименту. Аналогічна тенденція до зниження вмісту МСМ спостерігалась і в печінці уражених тварин після введення тіотриазоліну, фібросилу та субстанцій з конюшини лучної. Таким чином, використані нами коригуючі чинники викликали вірогідне (р<0,05) зниження МСМ в досліджуваних тканинах. Найефективнішими для даного показника були фібросил та трава конюшини лучної, які проявили сорбтивні властивості, очевидно, за рахунок великого вмісту клітковини. Одним із показників посилення пероксидних процесів є метгемоглобін. Всі використані нами коригуючі середники позитивно впливали на вміст метгемоглобіну в крові уражених тварин на 7-у та 14-у доби. Найефективнішими виявилися трава конюшини та тіотриазолін, які на 14-у добу експерименту в 2,5 рази знизили високий вміст метгемоглобіну після ураження (4,68 ± 0,16 г/л). Нами досліджено проникність еритроцитарних мембран (ЕІІ) та плазматичних мембран гепатоцитів (АсАТ, АлАТ) після введення в організм уражених тварин коригуючих чинників. Встановлено, що введення в організм фібросилу, екстракту з конюшини лучної та тіотриазоліну проявило позитивний вплив на еритроцитарний індекс інтоксикації. Після застосування вищеназваних коригуючих чинників проникність мембрани вірогідно (р<0,05) зменшувалась. При ураженні тварин солями Cd та Co на тлі радіаційного опромінення відзначено значне зростання активності АлАТ та АсАТ в сироватці крові. Тіотриазолін і фібросил протягом всіх термінів дослідження ефективно знижували активність АлАТ та АсАТ. Менш ефективними виявились екстракт та суха трава конюшини. У печінці відзначено зниження активності АлАТ під впливом використаних нами коригуючих чинників. Введення в уражений організм щурів фібросилу, екстракту з конюшини та сухої трави вірогідно (р<0,05) підвищували знижену після отруєння активність каталази в сироватці крові на 14-у добу дослідження, тіотриазолін ефективно впливав на активність каталази протягом всього експерименту (рис. 2). У печінці уражених тварин позитивний вплив проявили фібросил та тіотриазолін. Рис 2. Зміни активності каталази у сироватці крові уражених щурів після введення коригуючих середників, % Після застосування тіотриазоліну в сироватці крові уражених тварин зменшувався вміст відновленого глутатіону в порівнянні з тваринами, які не отримували коригуючого чинника. У печінці уражених тварин вміст відновленого глутатіону після введення 10 %-го екстракту з конюшини лучної, трави конюшини лучної, фібросилу, тіотриазоліну збільшився протягом всього експерименту в порівнянні з ураженими тваринами (після ураження він був вірогідно нижчим). Таким чином, найефективніший вплив на показники антиоксидантної системи в організмі щурів після ураження проявили тіотриазолін, фібросил та 10 %-ий екстракт з конюшини лучної. Це вказує на їх антиоксидантні властивості та дозволяє рекомендувати для подальшого вивчення з метою пригнічення активованих процесів ВРО, а також відновлення та нормалізації функціонування в ураженому організмі системи антиоксидантного захисту. При вивченні гуморальної ланки імунної системи ми відзначили значне зростання вмісту ЦІК у сироватці крові уражених тварин протягом всього експерименту. Вірогідне (р<0,05) зниження кількості ЦІК встановлено під впливом тималіну. Виражений вплив проявив тималін і на вміст імуноглобулінів А, G, М, наближаючи його до рівня контрольної групи тварин протягом всього періоду дослідження. Загальну тенденцію до нормалізації показників гуморальної ланки відзначено після використання екстракту конюшини, що наводить на думку про імуномодулюючі властивості БАР, що є в складі цієї рослини. Ефективний вплив на процес фагоцитозу в уражених тварин проявили тималін та тіотриазолін. До кінця експерименту (на 21-у добу) відсоток фагоцитуючих нейтрофілів під їх впливом підвищувався майже до рівня контрольних тварин. Фагоцитарне число підвищилось (р<0,05) після введення в уражений організм всіх коригуючих чинників. Найефективніший вплив на гуморальну та клітинну ланки імунітету в організмі тварин проявили тималін та тіотриазолін. Отримані нами результати дозволяють рекомендувати використання тіотриазоліну, тималіну, фібросилу для корекції уражень хімічними токсинами та радіаційним опроміненням, а також продовжити вивчення коригуючих властивостей субстанцій з конюшини лучної з метою створення фітопрепаратів для використання їх у медичній практиці. ВИСНОВКИ У дисертації відповідно до мети і завдань, отримано нові дані стосовно метаболічних порушень, стану захисних систем, зокрема, антиоксидантної та імунної, мембранних структур (гепатоцитів та еритроцитів) та ступеня ендогенної інтоксикації за умов ураження щурів хлоридами Cd та Co на тлі радіаційного опромінення. З метою корекції виявлених порушень вперше вивчено вплив на уражений організм антиоксиданта тіотриазоліну, ентеросорбента фібросилу, імуномодулятора тималіну та субстанцій з трави конюшини лучної. У результаті вирішення поставлених завдань зроблено наступні висновки: 1. Ураження тварин хлоридами Cd та Co у поєднанні з радіаційним опроміненням призводить до активації процесів ліпопероксидації, що підтверджується збільшенням (в 2 рази) вмісту ТБК-реагуючих продуктів у сироватці крові та печінці тварин протягом 21-ї доби. Це призводить до зміни проникності мембран еритроцитів та гепатоцитів, на що вказує значне збільшення активності аспартат- та аланінамінотрансфераз у досліджуваних тканинах та підвищення еритроцитарного індексу інтоксикації (до кінця експерименту на 35 %). 2. Поєднане радіаційно-хімічне ураження організму посилює ендогенну інтоксикацію за рахунок нагромадження в крові та печінці молекул середньої маси та продуктів вільнорадикального окиснення. У досліджуваних тканинах зростає вміст фракцій середніх молекул у яких переважають ароматичні та ланцюгові амінокислоти, їх максимум зареєстровано на 7-у (в печінці у 3 рази) та 14-у (в сироватці крові у 2,5 рази) доби експерименту. 3. Активація процесів вільнорадикального окиснення та поглиблення ендогенної інтоксикації викликають зміни в антиоксидантній та імунній системах організму. Після ураження знижується активність каталази в сироватці крові та печінці щурів, а також редокс-індекс. Найменший рівень останнього в печінці відмічено на 7-у (93 %) добу від початку експерименту, що вказує на активацію окиснювальних процесів та максимальний розвиток метаболічних порушень у цей період. 4. За умов поєднаного ураження щурів хімічними токсинами та низькодозовим радіаційним опроміненням активується гуморальна ланка імунітету – протягом всього періоду дослідження збільшується вміст циркулюючих імунних комплексів, максимум яких припадає на 14-у та 21-у доби (180 % та 160 % відповідно). Активація гуморальної ланки імунітету супроводжується зниженням фагоцитарної активності нейтрофілів за даних умов. На 14-у добу експерименту активність нейтрофілів була найменшою (близько 50 % від контролю становили фагоцитарне число та фагоцитарний індекс). 5. Застосування за умов радіаційно-хімічної інтоксикації антиоксиданта тіотриазоліну призводить до пригнічення вільнорадикальних процесів і стабілізації мембранних структур гепатоцитів та еритроцитів. Це супроводжується зменшенням ендогенної інтоксикації організму (знижується активність аспартат-, аланінамінотрансфераз, вміст молекул середньої маси та еритроцитарний індекс інтоксикації), а також нормалізацією показників антиоксидантної системи. 6. Використання ентеросорбента фібросилу викликає зменшення вмісту ендогенних токсинів в організмі щурів (ТБК-реагуючі продукти, молекули середньої маси), нормалізуються показники антиоксидантної та імунної систем (каталаза, відновлений глутатіон, циркудюючі імунні комплекси). 7. Встановлено коригуючий вплив імуномодулятора тималіну на показники імунної системи за умов ураження тварин солями Cd, Co та радіаційним опроміненням. Після його введення в отруєний організм різко зменшується вміст циркулюючих імунних комплексів та підвищується фагоцитарний індекс та фагогцитарне число нейтрофілів. 8. У траві конюшини встановлено високий вміст біологічно активних речовин з антиоксидантними властивостями, зокрема, флавоноїдів (2,21 мг на 100 г сировини), вітамінів С (97,00 мг на 100 г сировини) і Р (0,61 мг на 100 г сировини) макро- та мікроелементів у траві конюшини лучної, що дозволило використати її для корекції виявлених порушень за умов радіаційно-хімічного токсикозу. 9. Екстракт з трави конюшини та трава конюшини проявили ефективний вплив на вміст ТБК-реагуючих продуктів (на 21-у добу в сироватці крові знизився на 30 %, у печінці – на 65 % у порівнянні з ураженими тваринами після введення 10 %-го екстракту та на 68 % і 72 % відповідно після введення трави), молекул середньої маси та активність амінотрансфераз. Практичні рекомендації Для діагностики ступеня ураження організму в умовах радіаційно-хімічної інтоксикації рекомендується визначати вміст молекул середньої маси та ТБК-реагуючих продуктів в сироватці крові. Для зниження ендогенної інтоксикації після ураження хімічними токсинами та радіаційним опроміненням доцільним є використання ентеросорбента фібросилу. Рекомендується з метою пригнічення активованих вільнорадикальних процесів за інтоксикації важкими металами та низькодозовим радіаційним опроміненням використовувати антиоксидант тіотриазолін. Список праць, опублікованих за темою дисертації Лихацький П.Г. Вивчення елементного складу надземної частини конюшини лучної // Медична хімія. – 2005. – Т. 7, № 4. – С. 58–60. Лихацький П.Г. Оцінка стану імунної системи та ступеня ендогенної інтоксикації організму тварин в умов рентген-хімічного токсикозу // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія: Біологія. – 2006. – Вип. 19. – С. 32-34. Лихацький П.Г. Застосування антиоксидантів та ентеросорбентів за умов ураження щурів солями кадмію, кобальту та рентгенпроменями // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2006. – № 3-4. – С. 126-131. Лихацький П.Г., Фіра Л.С. Використання конюшини лугової як перспективного лікарського засобу // Медична хімія. – 2005. – № 2. – С. 108-110. (Автором самостійно проведено аналіз літературних даних щодо властивостей, хімічного складу та застосування конюшини лучної, як об’єкта дослідження та оформлення матеріалів). Лихацький П.Г., Фіра Л.С. Біологічно активні речовини конюшини лучної як джерела нових лікарських засобів // Медична хімія. – 2006. – № 4. – С. 121-124. (Автором проведено дослідження вмісту вітамінів С, Р, К, каротиноїдів та флавоноїдів, систематизовано отримані результати). Лихацький П.Г., Фіра Л.С., Лісничук Н.Є. Метаболічні порушення в організмі щурів за умов Rg-хімічного токсикозу // Екологія та ноосферологія. – 2006. – № 4. – С. 97-100. (Дисертант визначав вміст ТБК-реагуючих продуктів, МСМ, відновленого глутатіону, активність каталази та амінотрансфераз). Лихацький Петро. Порівняльна характеристика вмісту вітаміну С в різних органах конюшини лугової (Trifolium pratense L.) // Матеріали ІХ Міжнар. мед. конгресу студентів і молодих учених (Тернопіль, 21–22 квітня 2005 р.). – Тернопіль: Укрмедкнига, 2005. – С. 220. Лихацький П.Г. Стан імунної системи організму тварин за комплексної дії солей кобальту та кадмію на тлі низькодозованого Rg-опромінення // Тези ІІ-ї Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (21-24 березня 2006 р., м. Львів). – Львів, 2006. – С. 201. Лихацкий П.Г. Показатели эндогенной интоксикации и иммунной системы организма животных в условиях рентгено-химического токсикоза // Материалы научно-практической конференции молодых ученых. – Пущино, 2006. – С. 289. Вивчення вмісту аскорбінової кислоти в деяких видах лікарських рослин. / Л.С. Фіра, І.З. Кернична, О.В. Цибульська, П.Г. Лихацький // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок. Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю (м. Тернопіль). – Укрмедкнига. – 2004. – С. 131-133. (Автором визначено вміст вітаміну С в траві конюшини лучної та систематизовані одержані результати). Кернична І.З., Цибульська О.В., Лихацький П.Г. Вивчення вмісту біофлавоноїдів у деяких видах лікарських рослин // Міжнародна науково-практична конференція “Сучасний стан і проблеми еспериментальної та клінічної біохімії (11-12 листопада, м. Тернопіль) // Медична хімія. – 2004.– № 3. – С. 174. (Автором визначено вміст флавоноїдів в траві конюшини лучної та проведена статистична обробка). Фіра Л.С., Кернична І.З., Лихацький П.Г. Мікроелементний склад деяких рослин Тернопільської області // Матер. VI Національного з’їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (28-30 вересня 2005 р. м. Харків) / Ред. кол.: В.П. Черних та ін. – Х.: Вид-во НФаУ, 2005. – С. 789-790. (Автором проведені дослідження з визначення вмісту мікроелементів та зроблені узагальнення результатів роботи). Дослідження вмісту флавоноїдів у лікарській рослинній сировині /Л.С. Фіра, С.М. Марчишин, М.І. Шанайда, П.Г. Лихацький, І.З. Кернична, О.І. Грималюк, Р.Є. Нечай // Матеріали 1-ї Міжнародної науково-практичної конференції “Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (6-7 квітня 2006 р., м. Тернопіль). – Тернопіль: Укрмедкнига, 2006. – С. 43. (Дисертантом проведено визначення вмісту флавоноїдів та здійснена статистична обробка результатів дослідження). Анотація Лихацький П.Г. Поєднаний вплив солей кадмію, кобальту та радіаційне опромінення на захисні системи тварин та шляхи корекції виявлених порушень. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біології тварин УААН. – Львів, 2007. Дисертація присвячена вивченню впливу кадмію, кобальту та радіаційного опромінення на організм білих щурів за умов їх перорального введення. Встановлено, що першочерговим механізмом у розвитку патологічного стану є активація вільнорадикальних процесів, що призводить до оксидативного стресу в організмі. Це викликає поглиблення ендогенної інтоксикації, зміни проникності еритроцитарних мембран (підвищення еритроцитарного індексу та вмісту метгемоглобіну) та цитоліз плазматичних мембран гепатоцитів (підвищення активності амінотрансфераз в сироватці крові та печінці тварин) після ураження. Відмічено зниження активності ферментативної ланки антиоксидантної системи, підвищення активності гуморальної ланки імунітету (збільшення вмісту ЦІК) та зниження фагоцитарної здатності лейкоцитів. Ефективний вплив на метаболічні порушення в організмі уражених тварин проявили антиоксидант тіотриазолін, ентеросорбент фібросил та імуномодулятор тималін. Вперше було досліджено ефективність застосування за даної патології субстанцій з конюшини лучної і доведено доцільність її використання за умов радіаційно-хімічної інтоксикації. Ключові слова: хлорид кадмію, хлорид кобальту, радіаційне опромінення, ліпопероксидація, ендогенна інтоксикація, антиоксидантна система, імунна система, мембранні структури, коригуючі чинники, рослинна сировина. Аннотация Лихацкий П.Г. Совместное влияние солей кадмия, кобальта и рентгенлучей на защитные системы животных и пути коррекции обнаруженных нарушений. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биологии животных УААН. – Львов, 2007. Диссертация посвящена изучению влияния кадмия, кобальта и радиоционного облучения на организм белых крыс при условии их перорального введения. Установлено, что первоочередным механизмом в развитии патологического состояния является активация свободнорадикальных процессов, что проявляется оксидативным стрессом в организме. Образованные АФК проявляют деструктивное влияние на липидные компоненты мембран и вызывают активацию проццесов ПОЛ, что подтверждается накапливанием в исследуемых тканях ТБК-реагирующих продуктов. Это приводит к углублению эндогенной интоксикации, а в частности, повышению в сыворотке крови и печени опытных животных содержания МСМ. Максимальное накапливание ТБК-реагирующих продуктов и МСМ как в сыворотке крови, так и в печени пораженных животных приходилось на 7-е и 14-е сутки исследования, что свидетельствует о развитии токсикогенной фазы в этот период. Отмечено усиление процессов пероксидации в эритроцитах и образование значительного колличества MetHb в эти сроки. Образованные токсичные продукты ПОЛ и эндогенные токсины оказывают деструктивное влияние на плазматические и цитоплазматические мембраны клеток. При поражении животных солями тяжелых металлов и радиациооным облучением установлено повышение проницаемости эритроцитарной мембраны, на что указывает увеличение ЭИИ, тоесть повышение проницаемости эритроцитарной мембраны для внутриклеточных компонентов. Под воздействием использованных нами ксенобиотиков отмечено цитолиз гепатоцитов, что подтверждается увеличением активности АлАТ и АсАТ в исследуемых тканях после поражения. Причем, активность АлАТ увиличивалась значительно больше чем АсАТ, что объясняется, видимо, локализацией этих ферментов (АлАТ в цитозоле, АсАТ в мембранах) Все это вызвало изменения в защитных системах организма. Снижалась активность ферментативной антиоксидантной системы, (активность каталазы в исследуемых тканях) отмечались фазовые изменения в неферментативном ее звене (содержание востановительного глутатиона). Нами отмечено повышение на протяжении эксперимента редокс-индекса (соотношение востановленой и окисленной формы гютатиона), что указывает на развитие и усиление окислительных процессов в этот период. Снижение активности антиоксидантной системы привело к повышению гуморального звена иммунитета и снижению ативности клеточного его звена. В процессе исследования на протяжении всего эксперимента повышалось содержание ЦИК в сыворотке крови, отмечались фазовые изменения в содержании иммуноглобулинов A, G, M и снижалась фагоцитарная активность лейкоцитов. Эффективное влияние на процессы метаболизма в организме пораженных животных проявил антиоксидант тиотриазолин, энтеросорбент фибросил и иммуномодулятор тималин. Найболее положительное влияние на процессы липопероксидации и показатели эндогенной интоксикации проявил антиоксидант тиотриазолин, который к концу эксперимента нормализовал содержание ТБК-реагирующих продуктов, МСМ. Впервые была исследована эффективность применения при данной патологии субстанций из клевера лугового и доказана целесообразность его использования в условиях радиоционно-химической интоксикации. Более эффективным оказался экстракт из клевера в сравнении с сухой травой из этого растения. Возможно, антиоксидантные свойства экстракта объясняются наличием в нем большого колличества полифенольных соединений, в частности флавоноидов и витаминов С, Р, каротиноидов. Это дает возможность дальнейшего его изучения в качестве антиоксидантного средства с целью введения субстанций из клевера лугового в пратическую медицину. Ключевые слова: хлорид кадмия, хлорид кобальта, радиационное облучение, липопероксидация, эндогенная интоксикация, антиоксидантная система, иммунная система, мембранные структуры, корригирующие факторы, растительное сырье. Summary Luhatsky P.G. Combined influencing of salts of cadmium, cobalt and Х-rays on the protective systems of animals and ways of correction of found revealed violations. Manuscript. Dissertation on the receipt of scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 biochemistry. Institute of biology of animals of UAAS Lvov, 2007. Dissertation is devoted to the study of influencing of cadmium, cobalt and X-rays on the organism of white under on conditions of their peroral introduction. It is set in the process of researches, that a primary mechanism in development of the pathological state is activating of free-radical processes, which results in oxidation stress in an organism. It causes the deepening of endogenous intoxication, and in particular, accumulation of MMM in blood serum and liver of experimental animals. Toxic products of lipid peroxidation and endogenous toxins have destructive influence on plasmatic and cytoplasmatic membranes of cells. In the process of defeat the increase of permeability of membrane of red corpuscles, increase maintenance methemoglobins in blood is set. Under action of used xenobiotics hepatocyte cytolysis is marked, that is confirmed by increased activity of АlАТ and АsАТ in the explored tissues after a defeat. All this it caused changes in the protective systems of organism. Activity of enzymatic antioxidant system lowered, the changes of phases in its non-enzymatic link were marked. The decline of activity of antioxidant system resulted in the increase of humoral link of immunity and decline of aspecific resistanse of organism. In the process of research maintenance of csrculating immune complexes in blood serum increased and phagocytic activity of leucocytes lowered. Effective influence on the processes of metabolism in the organism of the injured animals showed antioxidant of thiotriazolin, enterosorbent fibrosil and immune modulator thymalin. Efficiency of application at this pathology of substances from the clover was first explored and the expediency of its under conditions of radiation-chemical intoxication use is proved. Key words: chloride of cadmium, chloride of cobalt, X-rays, lipid peroxidation, endogenous intoxication, antioxidation system, immune system, membrane structures, correctings factors, plant raw material. PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *