Пероксидні процеси та стан системи оксиду азоту в судинній стінці щурів різного віку (автореферат)

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ

НІЖАНКОВСЬКА ОКСАНА ВЛАДИСЛАВІВНА

УДК 577.126:612.67.015.33:611.13.018.74

Пероксидні процеси та стан системи оксиду азоту в судинній стінці щурів
різного віку

03.00.04 — біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України, лабораторії
регуляції метаболізму.

Науковий керівник — доктор медичних наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН
України,

завідувач лабораторії
регуляції метаболізму.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Мхітарян Лаура Сократівна,

Інститут кардіології ім. М.Д.
Стражеска АМН України,

керівник відділу біохімії;

кандидат медичних наук

Геруш Ігор Васильович,

Буковинський державний медичний
університет МОЗ України,

доцент кафедри медичної хімії.

Провідна установа — Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця МОЗ України,

кафедра біоорганічної,
біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ.

Захист відбудеться 18.05.2006 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 в Інституті геронтології АМН
України, 04114, м. Київ,

вул. Вишгородська, 67.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту
геронтології АМН України, м. Київ, вул. Вишгородська, 67.

Автореферат розісланий 12.04.2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук
Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вікові зміни серцево-судинної системи значно
обмежують адаптаційні можливості у похилому та старечому організму і є
важливим фактором розвитку різноманітної вік -залежної патології
(Чеботарев Д.Ф., 1993; Фролькис В.В., 1994; Robert L., 1999; Lakatta
E.G., 2003; Коркушко О.В., 2004).

Встановлено, що одним з основних патогенетичних чинників виникнення
вік-залежної патології є порушення ендотеліальних факторів регуляції
судинного тонусу-ендотеліальної дисфункції (Frolkis V.V., Bezrukov V.V.,
Kulchitsky O.K., 1996; DeMeyer G.R.Y., 1997; Затейщикова А.А., 1998;
Малая Л.Т., 2000; Коркушко О.В., 2004). В свою чергу, метаболічною
основою порушень функціональних властивостей судин за цих умов є
дисбаланс між вазоконстрикторними (ендо-, гідропероксиди, вільні
радикали, ендотелін-I) та вазодилататорними (простацикліни, оксид азоту)
ендотелійзалежними факторами регуляції судинного тонусу (Tschudi M.R.,
1996; Ткаченко М.М., 1997; Toprakci M., 2000; Зотова И.В., 2002;
Кульчицкий О.К., 2002; McCann S.M., 2002).

Ключова роль у виникненні подібного дисбалансу відводиться змінам в
синтезі та секреції оксиду азоту (NO). Синтез NO в організмі
відбувається як за участю кисню — родиною NO-синтаз (NOS), так і в
безкисневих умовах за участю гемовмісних білків (гемоглобін, міоглобін,
цитохроми). Реакція утворення NO за участю цих механізмів, їх регуляція
шляхом прямих та зворотніх зв`язків об`єднані в цикл оксиду азоту
(Реутов В.П., 1998; Меньщикова Е.Б., 2000).

Встановлено, що продукція NO супроводжується вивільненням активних
форм кисню, підвищенням рівня супероксид-аніону, гідроксил-радикалів,
пероксинітриту, надлишок яких зумовлює цитотоксичну дію NO (Violi F.,
1999; Данилович Ю.В., 2003). Однак, за фізіологічних концентрацій NO
може гальмувати процеси пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), виступаючи
в ролі антиоксиданта (Соловьев А.И., 2003). Це зумовлює тісний
регуляторний зв`язок системи NO з процесами ПОЛ.

З іншого боку відомо, що оксидативний стрес за умов старіння і
патології призводить до пошкодження клітинних структур, справляє
цитотоксичний ефект, зокрема на ендотеліоцити (Биленко М.В., Федосова
С.В., 1998; Spiteller G., 2001; Дубинина Е.Е., 2001; ).

Проте питання про вікові зміни стану та взаємовпливу цих систем
саме в судинній стінці залишається мало вивченним.

З`ясування цієї проблеми сприятиме розумінню біохімічних механізмів
порушень судинного тонусу при старінні та може бути експериментальним
обгрунтуванням пошуку нових фармакологічних засобів регуляції стану
судин.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана в рамках науково-дослідної роботи лабораторії регуляції
метаболізму Інституту геронтології АМН України «Вікові особливості дії
ліпопротеїнів різної щільності на ліпідний склад та перекисні процеси
судинної стінки» (№ держреєстрації 0101U002024); «Стан ліпідної
пероксидації та синтез оксиду азоту в міокарді та стінці аорти щурів
різного віку за дії стресових факторів» (№ держреєстрації 0104U002278).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — порівняльна оцінка стану
процесів пероксидації ліпідів, синтезу та рівня оксиду азоту в судинній
стінці експериментальних тварин різного віку.

Відповідно до поставленої мети вирішували наступні задачі:

Дослідити стан процесів пероксидного окиснення ліпідів і фосфоліпідного
складу в судинній стінці щурів різного віку.

Визначити рівень стабільних метаболітів оксиду азоту (нітрит- та
нітрат-аніони) в судинній стінці щурів різного віку.

Дати оцінку стану ферментної ланки синтезу оксиду азоту в судинній
стінці щурів різного віку.

Оцінити вплив ліпопротеїнів атерогенних класів плазми крові на процеси
ліпопероксидації та рівень продукції стабільних метаболітів NO в
судинній стінці.

Оцінити поєднаний вплив L-аргініну та рибоксину на рівень стабільних
метаболітів NO та ферментативну активність конститутивної NO-синтази в
судинній стінці щурів різного віку.

Об`єкт досліджень — вікові зміни процесів ліпопероксидації та
синтезу оксиду азоту в стінці аорти експериментальних тварин.

Предмет досліджень — інтенсивність процесів ПОЛ та фосфоліпідний
склад, зміни окисного та неокисного перетворювання L-аргініну в судинній
стінці у щурів різного віку.

Методи досліджень. Для кількісної оцінки біохімічних показників у
моделях in vitro та в умовах in vivo використовувались біохімічні та
статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше дана характеристика
вікових порушень різних ланок процесу пероксидації ліпідів,
фосфоліпідного і жирнокислотного складів в судинній стінці щурів та
встановлено різноспрямований характер цих змін.

Вперше встановлено зниження сумарного рівня стабільних метаболітів
NO в судинній стінці старих тварин, яке обумовлено зниженням вмісту
нітрит-аніону.

Вперше досліджені вікові особливості окисного (NO-синтази) та
неокисного (аргінази) перетворень L-аргініну (основного субстрату
синтезу NO) в судинній стінці.

Вперше доведена наявність різноспрямованих змін ферментативної
активності різних ізоформ NO-синтаз в судинній стінці тварин в
залежності від віку.

Вперше показано, що атерогенні ліпопротеїни (ЛПДНГ, ЛПНГ) плазми
крові щурів пригнічують процеси вільнорадикального окиснення ліпідів і
мають інгібуючий вплив на продукцію оксиду азоту в судинній стінці як у
дорослих, так і у старих тварин.

Вперше доведено, що вазодилататорний ефект при введені L-аргініну
та рибоксину реалізується через активацію синтезу та підвищення рівня NO
в судинній стінці переважно старих тварин.

Практичне значення отриманих результатів. Отриманні в роботі
експериментальні дані обгрунтовують позитивний ефект L-аргініну з
рибоксином на підвищення продукування NO та поліпшення вазодилататорних
властивостей в судинній стінці старих тварин. Ці дані були використані
при розробці лікарського засобу кардіологічної дії, який проходить ІІ
фазу клінічних випробовувань.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто виконані патентні
дослідження та аналіз науково-медичної інформації за темою дисертаційної
роботи, визначена мета та поставлені задачі дослідження, розроблено
протокол реєстрації результатів дослідження, проведені відбір
експериментальних тварин, виконані біохімічні дослідження, статистична
обробка, аналіз та інтерпретація результатів, їх зіставлення з
літературними даними, сформульовані висновки та практичні рекомендації,
розроблено дизайн рукопису дисертаційної роботи, а також підготовлені
матеріали до друку. В працях опублікованих одноосібно та в
співавторстві, дисертант самостійно провів експериментальні дослідження
та брав участь в оцінці та узагальненні одержаних даних, написанні та
підготовці праць до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
оприлюднені на ІV Українській конференції молодих вчених, присвяченій
пам`яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2003); міжнародній конференції
«Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії»
(Тернопіль, 2004); V Українській конференції молодих вчених, присвяченій
пам`яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); науковій конференції
«Актуальні проблеми старіння», присвяченній пам`яті академіка В.В.
Фролькіса (Київ, 2005); науково-практичній конференції з міжнародною
участю «Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії» (Чернівці,
2005); ІV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ,
2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 9
наукових праць, з них — 4 статті у фахових наукових виданнях,
затверджених ВАК України, та 5 тез доповідей у матеріалах конгресів та
конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 110 cторінках
машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і
методів досліджень, 3 розділи власних досліджень, узагальнення одержаних
результатів, висновки, практичні рекомендації, список використаної
літератури, який містить 269 джерела, з них 153-латиницею. Дисертація
ілюстрована 20 таблицями та 9 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлена інформація про
роль ендотелію судинного русла, шляхи утворення оксиду азоту в
організмі, а також розглянутий взаємозв`язок між NO та процесами
вільнорадикального окиснення ліпідів. Викладено сучасні уявлення про
розвиток ендотеліальної дисфункції та можливість корекції дефіциту
оксиду азоту в організмі.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на
безпорідних щурах-самцях, які були поділені на дві вікові групи: 6-10
місяців — дорослі; 24-28 місяців — старі. Після декапітації у тварин
видаляли аорту (грудний та черевний відділи) через торако-абдомінальний
розріз і зберігали у рідкому азоті до моменту експерименту. У роботі
використовували хімічно чисті реагенти фірми Sigma (США),
Хімлаборреактив ( Україна ), Філіст-Діагностика (Україна).

Вміст первинних та вторинних продуктів ліпопероксидації в судинній
стінці визначали спектрофотометричним методом (Костюк В.А., 1984;
Волчегорский И.А., Шарапов В.Ф., 2002), рівень кінцевих продуктів
визначали у трихлороцтовому екстракті за реакцією з тіобарбітуровою
кислотою (ТБК-АП) (Каган В.Е., 1986). В хлороформному екстракті
визначали вміст сумарних фосфоліпідів (ФЛ) після мінералізації шляхом
«мокрого» спалювання в суміші сірчаної та хлорної кислот (1:1) (Svanborg
A., Svenercholm L., 1961). Визначення жирнокислотного складу судинної
стінки проводили методом газової хроматографії, попередньо метильованих
жирних кислот (Кейтс М., 1975). При визначенні вмісту нітрит- та
нітрат-аніонів гомогенат тканини і плазму крові щурів попередньо
депротеїнізували за допомогою 30% розчину ZnSO4 (Moshage H., 1995).
Рівень нітрит-аніонів визначали спектрофотометричним методом з
використанням реактиву Грису (Green L.C., 1982); рівень нітрат-аніонів —
за допомогою відновника («цинковий пил») (Орлова Е.А., 2002). Активність
конститутивної NO-синтази (cNOS) в судинній стінці визначали
комбінованим методом, пристосованим до спектрофотометричного вимірювання
окисненого в результаті реакції NADPH+H+ (Онуфриев М.В., Гуляева Н.В.,
1995; Сумбаев В.В., 2000); активність індуцибельної NO-синтази (iNOS)
визначали модифікованим методом, в якому використовували 1 мМ ЕДТА для
зв`язування ендогенних іонів кальцію (Chou T.C., 1998). Рівень сечовини
(карбаміду) та активність аргінази в судинній стінці вимірювали методом
спектрофотометрії в 5 мМ бікарбонатному буфері, рН 9,5 (Сагач В.Ф.,
2001). Виділення ліпопротеїнів атерогенних класів (ліпопротеїни дуже
низької густини та ліпопротеїни низької густини) з плазми крові щурів
різного віку проводили методом препаративного ультрацентрифугування в
градієнті щільності NaBr (Новікова С.М., Сабко В.Е., 1994). Білок
визначали модифікованим методом Лоурі (Markwell M.A.K., 1978).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили методом
Ст`юдента-Фішера. Для оцінки вірогідності використовували критерій
t-Ст`юдента. При обробці отриманих даних застосовували кореляційний
аналіз. Вірогідним вважали результати, якщо р < 0,05 (Лапач С.Н., 2000). РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Стан процесів пероксидного окиснення ліпідів. Виявлено вікові особливості вмісту первинних молекулярних продуктів ПОЛ в судинній стінці, які визначали роздільно в гептановій та ізопропаноловій фазах ліпідного екстракту. Так, в стінці аорти старих щурів вміст дієнових і триєнових кон`югатів, які екстрагуються ізопропанолом у порівнянні з дорослими знижується: відповідно на 37% та 40%. (табл. 1). Таблиця 1 Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів в судинній стінці дорослих та старих щурів Показники Фази ліпідного екстракту Дорослі, 6 - 10 міс., n = 10 Старі, 24 - 28 міс., n = 10 Дієнові кон`югати, нмоль/мг білка гептанова 20,4 ± 0,8 18 ± 0,8 ізопропанолова 4,6 ± 0,6 2,9 ± 0,3* Триєнові кон`югати, нмоль/мг білка гептанова 2,8 ( 0,8 2,1 ( 0,6 ізопропанолова 16,5 ( 1,2 9,9 ( 0,9*** Сполуки з ізольованими подвійними зв`зками, Е214/мг білка гептанова 0,078 ± 0,004 0,054 ±0,006** ізопропанолова 0,59 ± 0,03 0,43 ± 0,02*** * - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,05; ** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,01; *** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,001. Разом з тим, у старих тварин в обох фазах ліпідного екстракту реєструється зменшення кількості сполук з ізольованими подвійними зв`язками. При цьому ступінь окиснення ліпідів (Е278 / Е214), які розчинні в ізопропанолі, у старих щурів нижче на 8,7 % у порівнянні з дорослими, про що свідчить індекс окиснення ліпідів (табл. 2). Таблиця 2 Індекс окисленості ліпідів за Волчегорським в судинній стінці щурів різного віку Показники Фази ліпідного екстракту Дорослі, n = 10 Старі, n = 10 Е232 / Е214 гептанова 1,621 ± 0,070 2,074 ± 0,101** ізопропанолова 0,058 ± 0,002 0,054 ± 0,002 Е278 / Е214 гептанова 0,205 ± 0,025 0,222 ± 0,025 ізопропанолова 0,140 ± 0,005 0,123 ± 0,005* * - різниця вірогідна порівняно дорослими, р<0,05; ** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,01. Такі вікові зміни можуть бути пов`язані зі зниженням вмісту і/або ступеня ненасиченості полієнових жирних кислот, які є основними субстратами процесів пероксидації ліпідів і в цілому можуть свідчити про зменшення вмісту загальних ліпідів. Необхідно враховувати, що при екстракції ліпідів з тканини аорти в ізопропаноловій фазі реєструються переважно фосфоліпіди, а в гептановій - нейтральні ліпіди. Встановлено, що сумарний вміст фосфоліпідів (ФЛ) у дорослих вищий на 51,7 % у порівнянні зі старими тваринами. Це підтверджує той факт, що рівень залишків поліненасичених жирних кислот (сполуки з ізольованими подвійними зв`язками), які входять до складу фосфоліпідів, у старих щурів нижчий у порівнянні з дорослими. Спостерігаються вікові зміни і в жирнокислотному складі судинної стінки. Так, в стінці аорти старих щурів відносний рівень олеїнової (С18:1) ненасиченої жирної кислоти, яка входить до складу ФЛ, у порівнянні з дорослими тваринами знижується на 25 % і підвищується відсоток насичених жирних кислот. В результаті цього на 40 % збільшується коефіцієнт насиченості жирнокислотних залишків ФЛ. Останнє може бути пов`язане зі збільшенням в судинній стінці вільних жирних кислот, які екстрагуються гептаном. Встановлено вікові зміни вмісту лізоформ ФЛ, які входять до складу структурних ліпідів. Так, в судинній стінці старих тварин рівень лізофосфатидилхоліну вищий в 4,8 разів у порівняннні з дорослими, що можливо обумовлено активацією фосфоліпази А2. Також змінюється рівень кислих ізоформ ФЛ. Вміст фосфатидилсерину в судинній стінці старих щурів вище на 17% у порівнянні з показником дорослих тварин. Збільшення рівня цієї фракції фосфоліпідів при старінні може змінювати активність та регуляторні властивості трансмембраних ферментних комплексів. 2. Вплив ліпопротеїнів атерогенних класів на ПОЛ в судинній стінці у щурів різного віку. Добре відомо, що ендотеліоцити і ліпопротеїни (ЛП) плазми крові в організмі людини та тварин піддаються процесам ПОЛ (Биленко М.В., 1998). Це залежить від вихідного рівня активності вільнорадикальних процесів в судинному ендотелії та/або ЛП-комплексів. Тому in vitro було досліджено активність процесів ПОЛ (рівень продукції ТБК-АП) при взаємодії з ЛП атерогенних класів, які були вилучені з плазми крові дорослих і старих щурів, з аортою тварин двох вікових груп. ЛП атерогенних класів, вилучені з плазми крові дорослих, спричинюють зниження вмісту продукції ТБК-АП в аорті дорослих тварин на 14 % і в аорті старих щурів - на 12,3 %. ЛП атерогенних класів, вилучені з плазми крові старих тварин, спричиняють зниження рівня ТБК-АП в аорті старих тварин на 23,6 % і в аорті дорослих тварин - на 8,2 % (рис.1). Рис. 1. Вплив ЛП атерогенних класів на рівень продукції ТБК-АП в судинній стінці щурів. * - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,05; ** - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,001. Таке зниження рівня ТБК-АП за рахунок впливу ЛП атерогенних класів плазми крові старих тварин скоріше за все обумовлено структурно-метаболічними особливостями в тканині стінки аорти у щурів різного віку, станом про-, антиоксидантних систем, наявністю субстратів ПОЛ як в судинній стінці, так і в самих ЛП атерогенних класів. Зниження активності процесів ПОЛ за сумісної інкубації аорти з ЛП атерогенних класів, викликано пригніченням ліпопероксидації у самій стінці аорти, внаслідок включення холестеролу ЛП-комплексів в клітинні мембрани. Такі ж зміни спостерігалися при дослідженні впливу ЛП різних класів на Na+,K+-АТРазну активність плазматичних мембран гепатоцитів і кардіоміоцитів (Кульчицький О.К., Потапенко Р.І., 2001). 3. Особливості стану окисного та неокисного шляхів перетворення L - аргініну в судинній стінці за старіння. Розщеплення L-аргініну, як основного субстрату синтезу оксиду азоту, відбувається за рахунок ферментативної активності NOS та аргінази (Palmer R.M., 1988, Граник В.Г., 2003). Конститутивні ізоформи NO-синтаз, функціонально пов'язані з плазматичною мембраною, постійно експресовані і забезпечують базальне вивільнення NO. Цей тип ферменту має в своїй структурі місце для зв'язування НАДФ+, ФАД, тетрагідробіоптерину (ВН4) і їх активність регулюються комплексом Са++-кальмодулін (Вознесенский Н.А., 1999; Зотова И.В., 2002). Індуцибельна NOS (iNOS) експресується під впливом бактеріальних ліпополісахаридів, інтерлейкінами-1, -2, інтерферон-г (Cernadas M., 1998). Головна відмінність двох підтипів NOS є в тому, що в iNOS кальмодулін є субодиницею ферменту, і тому активність цієї ізоформи NOS не залежить від змін концентрацій внутрішньоклітинного Са++ (Busse R., 1995). Функції аргінази пов`язані з деградацією L-аргініну для виділення надлишкового білкового азоту у вигляді сечовини (карбаміду) (Сагач В.Ф., 2000). Нами було проведені дослідження, в яких визначали рівень стабільних метаболітів (NO-2 i NO-3) та ферментну ланку синтезу NO в судинній стінці експериментальних тварин. Вміст NO-2 i NO-3 в аорті щурів різного віку наведений в таблиці 3. Таблиця 3 Рівень стабільних метаболітів оксиду азоту в стінці аорти у щурів різного віку AE o ‚ 3/4 - 8 8 ? 1/4 3/4 A A Ae AE E E I I a ae AE 0 A & & ? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? ”y% ‘ ‘ ‘ ”y% ‘ ‘ ‘ ”y% ‘ ‘ ‘ ”y% ‘ ‘ ‘ ”y% ‘ ‘ ‘ ** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р< 0,01 Так, в судинній стінці сумарний рівень стабільних метаболітів NO ( NO?2 та NO?3 ) у старих тварин на 23 % нижчий у порівнянні з дорослими. Ці зміни відбуваються за рахунок зниження частки нітрит-аніону (NO?2 ) на 40 %, тоді як, кількість нітрат-аніону (NO?3 ) з віком достовірно не змінювалась. Зниження сумарного вмісту стабільних метаболітів NO в судинній стінці пов`язане зі зниженням продукції NO клітинами ендотелію в судинній стінці за умов старіння. Для підтвердження цього факту в дослідах in vitro вивчено здатність сегментів аорт дорослих і старих тварин до продукції стабільних метаболітів NO. За рівень продукції брали сумарний вміст NO?2 та NO?3 в гомогенаті інкубованої аорти і інкубаційній суміші в розрахунку на 1 г тканини за 90 - хвилинну інкубацію при температурі 37°С. Сумарний вміст NO?2 та NO?3 в стінці аорти дорослих щурів достовірно вищий ніж у старих. Це пов'язано з тим, що в віковій групі старих щурів рівень нітрит-аніону на 45%, а рівень нітрат-аніону на 28 % нижчий, ніж у дорослих (табл. 4). Таблиця 4 Продукція стабільних метаболітів оксиду азоту в судинній стінці у щурів різного віку за умов дослідження in vitro Показники Дорослі, n = 10 Старі, n = 10 NO?2 , нмоль / г тканини 156, ± 9,4 87,0 ± 12,2** NO?3 , нмоль / г тканини 86,0 ± 11,0 62,0 ± 6,1* NO?2 + NO?3 , нмоль / г тканини 242,0 ± 29,2 149,0 ± 15,7* Частка NO?2 від NO?2 +NO?3 , % 64 58 *-різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,05; ** -різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,01; Наведені дані підтверджують і безпосередньо свідчать про зменшення продукції стабільних метаболітів NO в судинній стінці, яке може відбуватися за рахунок зниження ферментативної активності конститутивної NOS (сNOS ) за умов старіння. Дійсно, як показали наступні дослідження в судинній стінці ферментативна активність сNOS у старих тварин на 48 % нижча у порівнянні з дорослими тваринами (табл. 5). Таблиця 5 Активність NOS в судинній стінці щурів різного віку Групи тварин cNOS iNOS Р нмоль / год / мг білка Дорослі, n = 10 180,5 ± 2,9 147,1 ± 3,5*** <0,001 Старі, n = 10 94,4 ± 1,9*** 218,2 ± 3,9 <0,001 Таке падіння сNO-синтазної активності в судинній стінці, яке відбувається за старіння, може бути пов'язане зі зменшенням експресії гену, який локалізується в 7 хромосомі, накопиченням в ендотеліоцитах кальцію, який пригнічує сNOS- кальцій-кальмодулін-залежний механізм (Marsden P.A., 1998). При дослідженні ферментативної активності індуцибельної NO-синтази (iNOS) в судинній стінці встановлено, що у старих тварин вона на 48 % вища ніж у дорослих (табл. 5). При проведені кореляційного аналізу виявлено достовірний прямий кореляційний зв'язок між рівнем первинних продуктів - кон'югованих дієнів гідроперекисів поліненасичених жирних кислот (ДК) та активністю іNOS в судинній стінці старих тварин (r=0,7, p<0,05). Таке зростання ферментативної активності іNOS призводить до надлишкової продукції та накопичення в тканинах високотоксичного пероксинітриту, динітрозильних активних метаболітів NO (S-нітрозотіолів, нітрозоамінів) в процесі старіння (Ванин А.Ф., 1998; Stathopulos P., 2001). При вивченні аргіназного шляху перетворення L-аргініну виявлено закономірні вікові зміни в судинній стінці. Наведені в таблиці 6 дані свідчать, що рівень сечовини (карбаміду) у старих щурів на 60 % нижчий і активність аргінази нижча на 42 % в аорті старих у порівняні з дорослими тваринами. Таблиця 6 Рівень сечовини та активність аргінази в судинній стінці щурів різного віку Групи тварин Сечовина (карбамід), нмоль / мг білка Аргіназа, нмоль / год / мг білка Дорослі, n = 10 6,6 ± 0,2 14,1 ± 0,8 Старі, n = 10 2,7 ± 0,1*** 8,1 ± 0,4** ** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,01; *** - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,001. Таким чином, в судинній стінці з віком спостерігається зниження NO-синтазного і аргіназного шляхів перетворення L - аргініну, основного субстрату синтезу оксиду азоту. 4. Вплив ЛП атерогенних класів плазми крові на рівень стабільних метаболітів оксиду азоту в судинній стінці щурів різного віку. Відомо, що на рівень продукції NO в судинній стінці можуть впливати порушення складу та співвідношення плазмових ліпопротеїнів (Orlandi A., 2000). Ми досліджували вплив ЛП атерогенних класів (ЛПДНГ+ЛПНГ) плазми крові щурів різного віку на рівень стабільних метаболітів оксиду азоту у смужках судинної стінки в дослідах in vitro. Атерогенні (ЛПНГ, ЛПДНГ) ліпопротеїни плазми крові пригнічують продукцію NO аортою дорослих і старих тварин. Продукція стабільних метаболітів NO - NO?2 та NO?3- аортою старих щурів за умов сумісної інкубації з атерогенними ліпопротеїнами як "свого" віку, так і від дорослих пригнічується на 39 та 33 %, проти 45-23 % відповідно у дорослих. У старих щурів найнижча частка продукції нітрит-аніонів від сумарного вмісту NO?2 + NO?3 спостерігається на відміну від дорослих за умов взаємодії аорти з атерогенними ліпопротеїнами від дорослих тварин, тобто " чужих". Про це свідчить значно менший рівень вмісту NO-2 і NO-3 ( інкубаційна суміш+аорта) за умов сумісної інкубації ліпопротеїнів з аортою щурів обох вікових груп (рис. 2). Рис. 2. Вплив ЛПДНГ + ЛПНГ на рівень NO-2 і NO-3 в судинній стінці щурів різного віку. ** - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,001 Отриманні дані свідчать про те, що ЛП атерогенних класів плазми крові зумовлють зниження рівня стабільних метаболітів NO за рахунок можливого впливу на ферментативну активність сNOS в судинній стінці внаслідок модифікації мембранних клітинних структур, в тому числі і зовнішньої мембрани ендотеліоцитів. За сумісної інкубації аорти з ЛП атерогенних класів плазми крові відбувається додаткове "вбудовування" холестеролу в мембрани, і це призводить до порушення динамічності взаємодії кальвеол із зовнішньою мембраною, і як наслідок цього зменшення ферментативної активності сNOS. На це вказують дані, щодо вікових особливостей вмісту стабільних метаболітів NO в судинній стінці, а також послаблення здатності смужок аорти старих щурів до продукції NO в дослідженнях in vitro. 5. Поєднаний вплив L-аргініну та рибоксину на рівень NO-2 / NO-3 і ферментативну активність сNOS в судинній стінці у щурів різного віку. Зменшення в серцево-судинній системі вазодилататорної здатності судинної стінки при старінні значною мірою пов'язане з ендотеліальною дисфункцією (Bonetti P.O., Lerman L.O., 2002; Коркушко О.В., 2003). При віковому пошкодженні ендотеліальної вистілки судин, розвитку вік-залежної патології відбувається порушення ендотеліальних факторів регуляції судинного тонусу (Фролькис В.В., Безруков В.В., Кульчицкий О.К.,1994). Тому, на сьогоднішний день актуальним є пошук засобів, дія яких спрямована на активацію метаболічних процесів в організмі та стимуляцію синтеза NO. В серії досліджень було вивчено поєднаний вплив відомих засобів - рибоксину та попередника синтезу NO - L-аргініну на стан системи NO у дорослих та старих тварин. Як видно з рисунку 3, при додаванні субстрату NO - L-аргініну в фізіологічній концентрації 10 -6 моль/л та рибоксину в концентрації 10 -6 моль/л до реакційної суміші, рівень нітрит-аніону в гомогенаті судинної стінки достовірно збільшувався : у дорослих щурів на 108 %, а у старих - на 229 %. Рис. 3. Поєднаний вплив L-аргініну/рибоксину на рівень NO-2 в аорті щурів різного віку. ** - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,001; ## - різниця вірогідна порвіняно з дорослими, р<0,001. Отже, при поєднаному впливі L-аргініну та рибоксину у старих тварин відбувається більший приріст продукції оксиду азоту у порівнянні з контрольним рівнем. При визначенні ферментативної активності конститутивної NOS в умовах досліду у дорослих тварин була на 61 % вища ніж у контролі, а у старих щурів приріст NO-синтазної активності складав 68 % (рис. 4). Рис. 4. Поєднаний вплив L-аргініну/рибоксину на активність cNOS в аорті щурів різного віку. * - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,01; # - різниця вірогідна порівняно з дорослими, р<0,01. Для підтвердження факту прямого впливу L-аргініну та рибоксину на активність cNOS ми досліджували їх комбіновану дію після попереднього введення неселективного інгібітора фермента - NG-нітро-L-аргінін-метилестер (L-NAME, "Sigma", США), який вводили внутрішньоочеревинно, одноразово у дозі 30 мг/кг ваги тіла експериментальних тварин. Результати дослідження не показали достовірного підвищення ферментативної активності сNOS в судинній стінці як у дорослих, так і у старих тварин. Це свідчить, що вазодилататорний ефект L-аргініну з рибоксином реалізується через безпосередню активацію cNOS. Можна вважати, що виявлений позитивний ефект поєднаного впливу L-аргініну та рибоксину на реактивність судинної стінки дорослих і старих щурів має потенційно важливе значення, оскільки відновлює ендотелійзалежні вазодилататорні реакції, нормалізує функцію ендотелію, запобігає розвитку деструктивних процесів в судинах. ВИСНОВКИ В дисертаційній роботі наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання, що полягає у виявленні вікових змін в судинній стінці експериментальних тварин процесів окиснювальної модифікації ліпідів та стану окисного та аргіназного шляхів перетворень L-аргініну. Виявлені порушення в судинній стінці можуть свідчити про розвиток ендотеліальної дисфункції при старінні. З віком змінюються метаболічні перетворення продуктів окиснювальної модифікації ліпідів. У старих тварин знижується рівень первинних та вторинних продуктів ліпопероксидації, підвищується рівень лізоформ фосфоліпідів та вміст насичених жирних кислот. У старих тварин спостерігається зниження рівня стабільних метаболітів оксиду азоту в плазмі крові та судинній стінці. Виявлена вікова різниця в різних ланках синтезу оксиду азоту. У старих тварин знижується ферментативна активність сNOS, але зростає ферментативна активність iNOS, що корелює з рівнем первинних продуктів ліпопероксидації. В судинній стінці у старих тварин спостерігаються зниження аргіназної активності та рівня сечовини (карбаміду), що свідчить про порушення в неокисному шляху обміну L-аргініну. 6. Встановлено, що ліпопротеїни атерогенних класів плазми крові пригнічують процеси ПОЛ та знижують продукцію стабільних метаболітів оксиду азоту в судинній стінці як у дорослих, так і у старих експериментальних тварин. 7. Застосування субстрату NO - L-аргініну разом з метаболічним агентом - рибоксином в фізіологічній концентрації (10-6моль/л) сприяють підвищенню рівня NO2? в судинній стінці старих тварин переважно за рахунок активації сNOS в ендотеліальних клітинах. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1.Кульчицкий О.К., Потапенко Р.И., Новикова С.Н., Нижанковская О.В. Процессы пероксидации липидов в стенке аорты крыс разного возраст // Пробл. старения и долголетия. - 2004. - Т.13, № 4. - С. 502 - 509. (Дисертанту належать результати визначення продуктів ПОЛ та їх похідних в судинній стінці). 2.Кульчицький О.К., Потапенко Р.І., Ніжанковська О.В. Рівень стабільних метаболітів оксиду азоту в плазмі крові та судинній стінці у щурів при старінні // Мед. хімія. - 2004. - Т.6, № 4. - С. 95 - 97. (Дисертанту належать результати визначення стабільних метаболітів оксиду азоту ). 3.Безруков В.В., Сикало Н.В., Кульчицький О.К., Ніжанковська О.В. Вікові особливості порушень функції ендотелію та їх фармакологічна корекція (експериментальне дослідження) // Журнал АМН України. - 2005. - Т.11, № 1. - С. 128 - 135. (Дисертанту належать результати визначення рівня нітрит та нітрат-аніонів, ферментативної активності конститутивної NOS). 4.Потапенко Р.І., Ніжанковська О.В., Новікова С.М., Бурчинська М.К., Кульчицький О.К. Вплив ліпопротеїнів на продукцію стабільних метаболітів оксиду азоту аортою дорослих і старих щурів // Бук.мед. вісник. - 2005. - Т.9, № 2.- С.210 - 212. (Дисертанту належать результати визначеня рівня стабільних метаболітів оксиду азоту). 5.Ніжанковська О.В. Вікові особливості ліпідного складу та перекисних процесів в аорті щурів // Тези доп. IV Укр. конф. молодих вчених, присвяченої пам`яті акад. Фролькіса В.В. - К.: Ін-т геронтології. - 2003. - С.168 - 169. 6.Ніжанковська О.В. Вікові особливості системи оксида азота в аорті та плазмі щурів різного віку // Тези доп. V Укр. конф. молодих вчених, присвяченої пам`яті акад.Фролькіса В.В. - К.: ін-т геронтології. - 2004. - С.130 - 131. 7.Ніжанковська О.В. Особливості системи оксиду азоту при старінні в судинній стінці та плазмі крові щурів // Тези доп. Міжнародної конференції "Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії". - Тернопіль (Мед. хімія). - 2004. - Т. 6, № 3. - С. 146. 8.Ніжанковська О.В. Вплив препарату "Кораргін" (L-аргінін-рибоксин) на активність ендотеліальної NO-синтази в судинній стінці щурів при старінні // Тези доп. Наук. конф. молодих вчених "Актуальні проблеми старіння" присвячена пам`яті академіка Фролькіса В.В. - К.: Ін-т геронтології. - 2005. - С. 125 - 126. 9.Потапенко Р.І., Ніжанковська О.В., Новікова С.М., Бурчинська М.К., Кульчицький О.К. Перекисні процеси та стан системи оксида азоту в судинній стінці щурів різного віку // Тези доп. IV національного конгресу геронтологів і геріатрів України. - Київ (Пробл. старения и долголетия). - 2005. - Т. 14, приложение. - С. 47. (Дисертанту належать результати дослідження продуктів ПОЛ, стабільних метаболітів NO і ферментативної активності конститутивної та індуцибельної NOS ). АНОТАЦІЯ Ніжанковська О.В. Пероксидні процеси та стан системи оксиду азоту в судинній стінці щурів різного віку. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут геронтології АМН України, Київ, 2006. В дисертації наведені результати дослідження вікових змін процесів ПОЛ та змін окисного і неокисного шляхів обміну L-аргініну, як основного субстрату синтезу NO в судинній стінці експериментальних тварин. Показано, що за старіння відбуваються зміни метаболічних перетворювань продуктів окисної модифікації ліпідів в стінці аорти. Виявлена вікова різниця в різних ланках синтезу NO. У старих щурів спостерігається зменшення рівня стабільних метаболітів NO за рахунок зниження активності NO-синтази та аргінази в судинній стінці. Встановлено, що ліпопротеїни атерогенних фракцій пригнічують процеси ПОЛ та знижують продукцію стабільних метаболітів NO в судинній стінці у щурів обох вікових груп. При введені in vivo щурам L-аргініну та рибоксину у фізіологічних концентраціях (10?6 моль/л) спостерігається підвищення рівня нітрит-аніону в стінці аорти старих тварин переважно за рахунок підвищення активності cNOS в ендотеліоцитах, що обумовлює позитивний вазодилататорний ефект. Ключові слова: оксид азоту, NO-синтаза, ліпопротеїни, судинна стінка, старіння. АННОТАЦИЯ Нижанковская О.В. Пероксидные процессы и состояние системы оксида азота в сосудистой стенке крыс разного возраста. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт геронтологии АМН Украины, Киев, 2006. В диссертации приведены результаты исследования возрастных изменений процессов ПОЛ и изменений оксигеназного и неоксигеназного путей обмена L-аргинина, как основного субстрата синтеза NO, в сосудистой стенке экспериментальных животных. Показано, что при старении происходят изменения метаболических преобразований продуктов окислительной модификации липидов в стенке аорты. Так, содержание диеновых и триеновых конъюгат, которые регистрируются в изопропаноловой фазе липидного экстракта, с возрастом снижается. Уровень остатков полиненасыщенных жирных кислот (соединения с изоллированными двойными связями), входящих в состав фосфолипидов, у старых животных снижается в стенке аорты. В возрастом наблюдается падение относительного уровня ненасыщенных жирных кислот и повышается содержание насыщенных жирных кислот, вследствии этого повышается коэффициент насыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов в сосудистой стенке. Обнаружена возрастная разница в различных звеньях синтеза NO. Установлены закономерные возрастные изменения уровня стабильных метаболитов NO в сосудистой стенке. Так, у старых крыс суммарное содержание нитрит- и нитрат-анионов ниже по сравнению со взрослыми животными. Такое снижение происходит за счет падения сNO-синтазной активности в стенке аорты, которое может быть связано с накоплением в эндотелиоцитах кальция, угнетающего сNOS-кальций-кальмодулин-зависимый механизм, а также с уменьшением экспрессии гена. У старых животных достоверно возрастает ферментативная активность iNOS в сосудистой стенке, приводящая к избыточной продукции и накоплению в ткани аорты пероксинитрита, динитрозильных активных метаболитов NO. Изучение аргиназного обмена L-аргинина, как основного субстрата NO, показало закономерные изменения при старении: снижение уровня мочевины (карбамида) и активности аргиназы в сосудистой стенке. Установлено, что липопротеины атерогенных фракций угнетают процессы ПОЛ (снижается уровень ТБК-АП) и снижают суммарное содержание стабильных метаболитов NO в сосудистой стенке у крыс обеих возрастных груп. Такие изменения скорее всего обусловлены структурно-метаболическими особенностями ткани аорты, наличием субстратов ПОЛ, состоянием про-, антиоксидантных систем. Показано, что при введении in vivo крысам L-аргинина и рибоксина в физиологических концентрациях (10?6 моль/л) наблюдается повышение уровня нитрит-аниона в стенке аорты старих животных преимущественно за счет повышения активности cNOS в эндотелиоцитах. Чтобы подтвердить прямое влияние этих субстанций, экспериментальным животным обеих возрастных групп внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг массы тела был введен ингибитор cNOS. Достоверного повышения ферментативной активности cNOS у животных не наблюдалось. Таким образом, результаты этого исследования свидетельствуют о сосудорасширяющемся действии L-аргинина с рибоксином, которое происходит за счет активации cNOS. Ключевые слова: ПОЛ, оксид азота, L-аргинин, NO-синтаза, липопротеины, аорта, старение. ANNOTATION Nizhankovska O.V. Peroxide processes and the state of nitric oxide system in the vessel wall in the rats of different age. - Manuscript. Dissertation for the candidate of medical science degree in the specialty 03.00.04 – biochemistry. - Institute of Gerontology of the Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev, 2006. This dissertation has been focused on study of age-related changes in the lipid peroxidation and changes in the oxidative and non-oxidative pathways of arginine metabolism as a major substrate of the nitric oxide synthesis in the vessel wall of the experimental animals. According to the author’s findings, metabolic transformations of oxidative lipid products in the aortal wall undergo changes in aging. In the old rats, there were age-dependent differences found in the various links of NO synthesis. That is, there was a decrease in a level of the stable NO metabolites, resultant from reduced NO-synthase and arginase activities in the aortal wall. The lipoproteins of atherogenic fractions were shown to suppress lipid peroxidation and to decrease production of stable NO metabolites in the wall in animals of both age groups. Upon in vivo administration of L-arginine and riboxine in the physiological concentration 106 mol/l, there was an observation of increase in the nitrite-anion in the aortal wall of old animals, mainly, owing to an increased cNOS activity in the endotheliocytes thus leading to a positive vasodilatory effect. Keywords: nitric oxide, NO-synthase, lipoproteins, vessel wall, aging. PAGE 3

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *