Патогенетичні механізми взаємодії ліпополісахаридів бактерій з моноцитами і лімфо-цитами крові людини in vitro (автореферат)

Міністерство охорони здоров’я України

Луганський державний медичний університет

Косенко Юрій Валерійович

УДК 616-002.3-097:579:6/2.1

Патогенетичні механізми взаємодії ліпополісахаридів бактерій з
моноцитами і лімфоцитами крові людини in vitro

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Луганськ-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ
України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Флегонтова Вероніка
Валентинівна, Луганський державний медичний університет МОЗ України,
професор кафедр патофізіології та мікробіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський
державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри клінічної
імунології, алергології та ендокринології

доктор медичних наук, професор Файфура Василь Васильович, Тернопільський
державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України,
професор кафедри патологічної фізіології

Провідна установа: Кафедра загальної та клінічної патологічної
фізіології ім. В.В. Підвисоцького, Одеський державний медичний
університет МОЗ України, м. Одеса

Захист відбудеться “03” листопада 2006 р. об 11.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 29.600.02 при Луганському державному
медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного
медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)

Автореферат розісланий “02” жовтня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько
В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В другій половині ХХ сторіччя декілька разів
відбувалася зміна видового складу мікрофлори, яка викликає
гнійно-запальні захворювання (Бєлобородов В.Б., 2001). У 1940-50-х рр. з
гнійних осередків виділяли переважно грампозитивні коки і кишкову
паличку; з 1980-90-х рр. головне значення набули умовно-патогенні
грамнегативні бактерії та неспорові анаероби (Гайдаш І.С. і ін., 2000;
Martin C., 1997; Sugawara S. et al., 2000). Ці етіологічні агенти,
виділені з осередків, як правило, асоціюють з аеробними та анаеробними
споровими бактеріями.

У формуванні захисних, компенсаторних і адаптаційних реакцій організму
істотна роль належить системі мононуклеарних фагоцитів (Хаитов Р.М.,
Пинегин Б.В., 1995; Мазуров Д.В. та ін., 2001). У зв’язку з цим
зрозумілий закономірний інтерес дослідників до вивчення фагоцитарної
активності моноцитів периферійної крові при різних патологічних процесах
бактеріальної етіології (Aderem A., 1999). Спочатку імунні порушення
створюють сприятливі умови для адаптації і розмноження бактерій, надалі
ж сприяють поширенню осередків враження і хронічного перебігу процесу
(Хаитов Р.М. і ін., 1998; Карпова М.Р., 1999; Бєлобородова Н.В.,
Бачинская Е.Н., 2000). У фагоцитозі беруть участь, в основному, 2 групи
клітин: гранулоцити і моноцити (макрофаги). Роль макрофагів складається
в розпізнаванні, фагоцитозі, процесінгу і тривалій презентації
детермінант етіологічних агентів інфекційних захворювань (Ярилин А.А.,
1998). Одночасно з антигенною презентацією відбувається синтез
цитокінів, зокрема, інтерлейкіну-1 (ІЛ-1). Цитокіни у високих
концентраціях при виході в кров забезпечують сигнальні функції,
пов’язані з формуванням генералізованої запальної реакції (Cuzzola M. et
al., 2000).

Екологічні катастрофи останніх років призвели до істотного зниження
резистентності організму людей, що, природно, викликало зміну
сформованих мікробіоценозів різних відкритих порожнин організму людини,
у тому числі і ротової порожнині (Кисельова А.Ф. та ін., 1994; Бірюкова
С.В., 1999). На фоні цих процесів генетично детерміновані властивості
патогенності і вірулентності бактерій одержали свій фенотипний розвиток
у напрямку їх посилення. Вірулентні мікроорганізми в ході свого
еволюційного розвитку виробили спеціальну систему пристосувань,
спрямованих на пригнічення фагоцитарної активності організму. Одним із
цих факторів є ліпополісахарид (ЛПС) — структурний компонент клітинної
стінки грамнегативних бактерій (Борисова Е.В., 1999). ЛПС виконує дві
важливі функції: визначає антигенну специфічність і є головним фактором
патогенності — це компонент ендотоксину (Васильєв Н.В. та ін., 1984).
Він викликає імунні реакції, у тому числі поліклональну активацію
імунокомпетентних клітин, спроможність стимулювати або пригнічувати
відповідь на антигени, індукувати поліклональну імунну толерантність і
т.п. (Платонов А.Е. і ін., 1999). ЛПС сприяє виділенню моноцитами
цитостатичного фактора білкової природи — фактора некрозу пухлини (ФНП).
Рецептори до ЛПС є на плазматичних мембранах макрофагів, моноцитів,
нейтрофілів і ендотеліоцитів. Ефекти ЛПС характеризуються
дозозалежністю: малі дози стимулюють інтенсивність фагоцитозу, великі —
знижують фагоцитарну активність і діють цитотоксично (Анненков А.Е. та
ін., 1987). ЛПС запускає продукцію ІЛ-1?, -6, -8, -10, ФНП-(,
інтерферону, ейкозаноїдів, фактора активації тромбоцитів та ін.
(Couturier C. et al., 1992; Baqui A.A. et al., 2000). Доведено, що
цитокіни, як основні прозапальні медіатори, індукуються в макроорганізмі
грамнегативними і грампозитивними бактеріями, і визначають “велику”
запальну природу бактеріальних інфекцій. Незважаючи на тотожність
структури, ЛПС різних видів бактерій відрізняються за хімічним складом і
біологічними властивостями. Розчинний ЛПС облігатно патогенних бактерій,
який не пригнічує гіперчутливість уповільненого типу самостійно,
можливо, здатний наділяти імуносупресивними властивостями живі бактерії
(Борисов В.А., Фролов А.Ф., 1990).

Антигенна стимуляція імунокомпетентних клітин, здійснена при дефіциті
факторів, які забезпечують проліферацію, може призвести до
запрограмованої загибелі активованої імунокомпетентної клітини, одним із
механізмів якої є апоптоз (Самохин А.В. та ін., 1997; Маянский Н.А.,
2001). Апоптоз — це фізіологічна, активна, програмована загибель клітин,
інформація про яку закодована в клітинному геномі і піддається
регуляції. Порушення процесу програмованої клітинної загибелі убік
посилення або ослаблення грає істотну роль у патогенезі
імунопатологічних процесів у людини, у тому числі вторинних
імунодефіцитів, автоімунних й онкологічних захворювань, хронічних
запальних процесів, вірусних та інших інфекцій. У культурах клітин
апоптоз спроможні посилювати або послабляти мікроби та їх структурні
компоненти (Казімірко Н.К. та ін., 2000; Талаев В.Ю. і ін., 2001).

У доступній літературі нами не були знайдені дані про комплексне
вивчення дозозалежного і видоспецифічного впливу ЛПС на секреторну
активність його головних мішеней — моноцитів (продукція ІЛ-1?, -6,
ФНП-?) і Тh1-клітин (продукція ІЛ-2); фагоцитарну активність моноцитів;
впливу ЛПС на апоптоз моноцитів і лімфоцитів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом
наукової роботи кафедри патофізіології Луганського державного медичного
університету № державної реєстрації 0198U005713 “Запалення як наслідок
дії бактерій”.

Мета дослідження: Вивчити роль ЛПС грамнегативних бактерій —
етіологічних агентів хронічного пародонтиту в порушеннях функціональної
активності моноцитів і лімфоцитів периферійної крові людини.

Для досягнення мети поставлені такі окремі задачі:

Дослідити in vitro продукцію моноцитами крові людини ІЛ-1?, -6 і ФНП-(
під впливом ЛПС грамнегативних бактерій.

Вивчити секрецію ІЛ-2 Тh1-клітинами під впливом ЛПС грамнегативних
бактерій.

Визначити фагоцитарну активність моноцитів крові людини під впливом ЛПС
грамнегативних бактерій.

Вивчити вплив ЛПС грамнегативних бактерій на апоптоз моноцитів і
лімфоцитів крові людини.

Визначити кореляційні зв’язки між показниками, які характеризують
секрецію цитокінів моноцитами і лімфоцитами, фагоцитарну активність
моноцитів і експресію молекул CD95 на поверхні моноцитів і лімфоцитів.

Об’єкт дослідження: моноцити та лімфоцити периферійної крові людини.

Предмети дослідження: вплив ЛПС грамнегативних бактерій — етіологічних
агентів хронічного пародонтиту на: секреторну активність моноцитів та
лімфоцитів, фагоцитарну активність моноцитів і експресію молекул
апоптозу на моноцитах і лімфоцитах периферійної крові людини in vitro;
кореляційні зв’язки між показниками, що характеризують секреторну
активність моноцитів і лімфоцитів, фагоцитарну активність моноцитів і
готовність до реалізації апоптозної програми моноцитами і лімфоцитами.

Методи дослідження: бактеріологічні (виділення ЛПС), імунологічні
(виділення моноцитів та лімфоцитів, визначення експресії молекул CD95 на
поверхні клітин), біохімічні (визначення активності ФНП, ІЛ),
експериментальні (визначення фагоцитарної активності моноцитів та
апоптогенної активності ЛПС), статистичні (метод параметричної
кореляції, метод аналізу таблиць спряженості).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлений дозозалежний
і видоспецифічний вплив ЛПС умовно-патогенних грамнегативних бактерій на
здатність моноцитів і лімфоцитів крові людини продукувати цитокіни, на
фагоцитарну активність і апоптоз моноцитів, апоптоз Т- і В-лімфоцитів.
Показано, що в міру збільшення діючої на моноцити і лімфоцити
концентрації ЛПС відбувається прогресивне збільшення продукції ІЛ-1?,
-2, -6, ФНП-(; посилення апоптозу моноцитів, Т- і В-лімфоцитів,
пригнічення фагоцитозу моноцитів. Більш значно впливали на функціональну
активність моноцитів і лімфоцитів крові людини in vitro ЛПС
факультативно анаеробних бактерій — Escherichia fergusonii, Proteus
vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менш значно —
ЛПС облігатно анаеробних бактерій — B. fragilis, P. melaninogenicus,
Fusobacterium necroforum.

Практична значимість отриманих результатів. Визначено теоретичні підходи
до трактування патогенезу хронічних пародонтитів, викликаних
грамнегативними умовно-патогенними бактеріями, на основі вивчення
біологічної активності їх ЛПС відносно моноцитів і деяких субпопуляцій
лімфоцитів крові людини. Отримані дані використовуються в лекційному
курсі і при проведенні практичних занять на кафедрах патофізіології і
мікробіології Луганського державного медичного університету, що
підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, планування
експерименту були здійснені разом з науковим керівником роботи. Автором
самостійно проведений: інформаційний пошук, аналіз літератури, виконана
експериментальна частина роботи, написані всі розділи дисертації та
автореферат.

Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та
обговорені на: Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів,
молодих вчених й інтернів “Нові технології в лікуванні
акушерсько-гінекологічної патології” (Луганськ, 10-11 листопада 2005
р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, молодих
вчених та інтернів “Актуальні проблеми фундаментальної медицини
(англійською мовою)” (Луганськ, 1-2 грудня 2005 р.), а також на
засіданнях Луганських обласних товариств патофізіологів і мікробіологів
у 2003-2005 рр.

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 7 наукових працях – 6
статтях та 1 тезах (6 – одноосібні).

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 126 сторінках
комп’ютерного набору, складається з вступу, огляду літератури, 6
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних
результатів, висновків і списку літератури. Робота ілюстрована 18
таблицями і 1 малюнком. Список літератури включає 145 джерел вітчизняних
та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Об’єктом дослідження були 120 культур
моноцитів і 110 культур лімфоцитів периферійної крові практично здорових
чоловіків віком від 20 до 24 років. Забір крові в обсязі 20 мл проводили
з ліктьової вени в ранковий час (07.00-08.00) до їжі. Кров вносили в
стерильні скляні пробірки, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували і
для одержання плазми відстоювали протягом 2 годин у термостаті при 37?С.
Отриману плазму крові надалі використовували для виділення моноцитів і
лімфоцитів.

ЛПС одержували з культур умовно-патогенних бактерій родів Escherichia,
Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella,
Fusobacterium, виділених від 120 хворих на хронічні пародонтити, які
звертались по стоматологічну допомогу в приватну стоматологічну клініку
“Посмішка” (м. Луганськ) з 2003 р. по 2005 р. Встановлення родової
приналежності культур і видову ідентифікацію бактерій проводили згідно з
наказом МЗ СРСР № 535 від 22.04.1985 р. Ідентифікацію бактерій проводили
з використанням діагностичних наборів “Ентеротест 24”, “Нефермтест 16”,
“Колітест” та “Анаеротест 23” виробництва АТ “Лахема”, Чехія. Препарати
ЛПС виділяли з клітинної стінки бактерій водно-феноловою екстракцією при
65°С. Використовували наступні робочі концентрації ЛПС (мкг/мл): 10,0;
50,0; 100,0.

Популяції моноцитів і лімфоцитів периферійної крові людини одержували за
допомогою центрифугування на градієнті щільності фікол-верографін.
Визначення фагоцитарної активності моноцитів проводили чашковим методом.
Підраховували фагоцитарний індекс (ФІ) і фагоцитарне число (ФЧ).
Визначення ІЛ-1?, -2, -6 і ФНП-? проводили в супернатантах моноцитів і
лімфоцитів імуноферментним методом.

Вивчення потенційної апоптогенної активності ЛПС умовно-патогенних
бактерій відносно лімфоцитів і моноцитів проводили морфологічним
методом. Для морфологічної оцінки апоптозу завись клітин (моноцитів, Т-
і В-лімфоцитів, Т-хелперів) наносили на предметне скло, підсушували та
фарбували акридином оранжевим. Розчин акридину оранжевого в
дистильованій воді (0,1 % розводили перед використанням у 10 %
фосфатному буфері до рН=6,0-6,5 додаванням 0,1 М розчину NaH2PO4).
Предметне скло покривали барвним розчином на 15 хвилин, далі видаляли
його фільтрувальним папером і промивали свіжою порцією закисленого
фосфатного буфера. Препарати досліджували за допомогою люмінесцентного
мікроскопа із синім світлофільтром. Експресію молекул СD95 на поверхні
моноцитів, Т- і В-лімфоцитів вивчали методом непрямої імунної
флуоресценції з використанням моноклональних антитіл виробництва НВЦ
“Медбіоспектр” (Москва, РФ).

Отримані цифрові результати обробляли статистично на персональному
комп’ютері методами варіаційної статистики. Достатньою вважали ймовірну
помилку менше 5 % (p<0,05). Подальшу обробку цифрових показників здійснювали за допомогою параметричного кореляційного аналізу та аналізу таблиць часток і пропорцій. Для дослідження взаємозв'язків між досліджуваними показниками нами був використаний метод параметричної кореляції (кореляція Пірсона). Вплив ЛПС умовно-патогенних грамнегативних бактерій на секреторну активність моноцитів. Моноцити крові людини in vitro при відсутності в середовищі культивування бактеріальних ЛПС продукували ІЛ-1?, -6 і ФНП-? у середніх концентраціях (пг/мл) 37,0(2,2, 53,0(3,1 і 40,0(2,4 відповідно, що було прийнято в якості референтної норми. Внесення в культуру моноцитів ЛПС E. fergusonii у дозі 10 мкг/мл супроводжувалося збільшенням продукції ІЛ-1? порівняно з нормою в 4,6 разів, ІЛ-6 - у 3,8 рази, ФНП-( - у 4,1 разів (р<0,05). При збільшенні концентрації ЛПС до 50 мкг/мл продукція ІЛ-1?, -6 та ФНП-( зросла у 18,0, 12,0 і 11,4 разів відповідно, до 100 мкг/мл – в 54,0, 31,2 і 37,6 разів. ЛПС P. vulgaris у дозі 10 мкг/мл викликали збільшення продукції ІЛ-1? порівняно з нормою в 4,4 разів, ІЛ-6 і ФНП-( - в 3,3 і 3,8 рази відповідно; в дозі 50 мкг/мл – у 14,8, 10,5 і 11,2 разів; в дозі 100 мкг/мл – у 45,0, 27,3 і 34,7 разів. При використанні мінімальної концентрації ЛПС P. aeruginosa продукція ІЛ-1? збільшувалась порівняно з нормою в 3,5 рази, ІЛ-6 - у 3,0 рази, ФНП-( - у 3,2 рази (р<0,05). Підвищення дози ЛПС P. aeruginosa до 50 мкг/мл вело до ще більшої активації секреторної функції моноцитів. При використанні ЛПС P. aeruginosa у дозі 100 мкг/мл стимуляція секреції монокінів була найбільшою, що виявлялося збільшенням концентрації ІЛ-1? в 39,2 разів, ІЛ-6 - у 20,9 разів, ФНП-( - у 29,8 разів. Потенціал ЛПС H. influenzae був менш вираженим порівняно з потенціалом ЛПС ентеробактерій і P. aeruginosa. ЛПС облігатних анаеробів стимулювали продукцію моноцитами ІЛ-1?, -6 і ФНП-(, проте в цілому потенціал ЛПС представників родів Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium був нижчим такого для факультативно анаеробних патогенів. Найменш активними з усіх досліджуваних ЛПС виявились ЛПС F. necroforum. Вплив ЛПС умовно-патогенних грамнегативних бактерій на секреторну активність Тh1-лімфоцитів. Спонтанна продукція Т1-хелперами ІЛ-2 склала 1,6(0,15 мкг/мл, що і було прийнято в якості норми. Найбільш активними у плані стимуляції утворення ІЛ-2 виявились ЛПС E. fergusonii, найменш активними - ЛПС F. necroforum. При використанні ЛПС E. fergusonii у дозі 10 мкг/мл кратність збільшення продукції ІЛ-2 склала 1,8 рази; 50 мкг/мл - 5,3 разів; 100 мкг/мл – 13,8 разів проти норми. При концентрації ЛПС P. vulgaris 10 мкг/мл продукція ІЛ-2 Тh1-клітинами перевищувала референтний показник у 1,7 рази, при 50 і 100 мкг/мл - у 5,5 і 12,8 разів відповідно. При використанні ЛПС P. aeruginosa і H. influenzae у дозі 10 мкг/мл ступінь збільшення продукції ІЛ-2 складав 1,6 рази (P. aeruginosa) і 1,75 рази (H. influenzae), при 50 і 100 мкг/мл - відповідно 4,6, 5,1 і 11,6, 12,2 разів. Серед облігатно анаеробних бактерій найбільшим стимулюючим потенціалом володіли ЛПС B. fragilis. Внесення до середовища культивування лімфоцитів ЛПС P. melaninogenicus у концентрації 10 мкг/мл вело до збільшення синтезу ІЛ-2 проти норми в 1,6 рази, при концентраціях 50 і 100 мкг/мл - у 4,6 і 8, 4 разів відповідно. Для ЛПС F. necroforum ступінь збільшення синтезу ІЛ-2 при 10 мкг/мл склав 1,4 рази, при 50 мкг/мл - 3,4 рази, при 100 мкг/мл - 7,4 разів. Вплив ЛПС умовно-патогенних бактерій на фагоцитарну активність моноцитів. При відсутності в середовищі культивування ЛПС ФІ і ФЧ моноцитів склали, відповідно, 36(2,0 % і 3,5(0,2 у.о. (референтна норма). a a D F a a X Z ? O X Z \ A o Z \ „ + у концентрації 100 мкг/мл показники ФІ і ФЧ були нижчими норми в 3,8 і 3,9 рази відповідно (р<0,05). Аналогічний вплив на ФАМ спостерігали також при використанні ЛПС інших факультативних анаеробів. Вплив ЛПС строгих анаеробів на фагоцитоз був аналогічним такому для факультативно анаеробних бактерій, але менш вираженим. Так, внесення до середовища культивування моноцитів ЛПС B. fragilis у концентрації 10 мкг/мл викликало збільшення ФІ і ФЧ моноцитів у 1,3 рази проти норми, що було аналогічно змінам, які виникали при використанні ЛПС E. fergusonii у такій же концентрації. При впливі на моноцити ЛПС B. fragilis у дозах 50 і 100 мкг/мл ФІ виявився зниженим у 1,4 і 2,6 рази, а ФЧ - у 1,2 і 2,2 рази відповідно (р<0,05). Експресія молекул СD95 на поверхні моноцитів і лімфоцитів під впливом ЛПС умовно-патогенних бактерій. При фарбуванні мазків моноцитів та лімфоцитів акридином оранжевим ДНК у ядрах клітин, які не вступили на шлях апоптозу, офарблювалась в зелений колір, а РНК у ядерцях і цитоплазмі - у червоний. При апоптозі зелене фарбування проникало в цитоплазму, а фрагментоване ядро мало вигляд зелених кульок. Більшість загиблих клітин мали морфологічні зміни, характерні для апоптозу. При вивченні потенційної апоптогенної активності ЛПС на основі дослідження експресії молекул CD95 на поверхні моноцитів і лімфоцитів встановлено, що ЛПС E. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, H. influenzae, B. fragilis, P. melaninogenicus і F. necroforum незначно впливали на апоптоз моноцитів. Цей вплив виражався у вірогідному збільшенні кількості моноцитів, які несли на поверхні своєї цитоплазматичної мембрани маркер апоптозу СD95, тільки при стимуляції високими концентраціями ЛПС, переважно 100 мкг/мл. Малі дози ЛПС (10-50 мкг/мл) не викликали апоптоз моноцитів крові людини. Кількість моноцитів, які експресували in vitro на своїй поверхні молекули CD95 при відсутності впливу ЛПС, склала 5,5(0,3 %, що і було прийнято нами за референтну норму. Встановлено, що незалежно від видової належності, ЛПС у концентраціях 10-50 мкг/мл не викликали вірогідного збільшення експресії молекул CD95 на поверхні моноцитів in vitro. Виняток склали ЛПС H. influenzae, які у дозі 50 мкг/мл викликали підвищення експресії CD95 в 1,2 рази проти норми (р<0,05). Внесення до середовища культивування моноцитів ЛПС у концентрації 100 мкг/мл супроводжувалося збільшенням рівня СD95-клітин від 1,15 рази (P. melaninogenicus) до 1,55 рази (H. influenzae). Найменш активними виявилися ЛПС облігатно анаеробних бактерій. ЛПС E. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, H. influenzae, B. fragilis, P. melaninogenicus і F. necroforum посилювали експресію молекул CD95 на поверхні Т- і В-лімфоцитів. Кількість Т- і В-лімфоцитів, які експресували на своїй поверхні молекули CD95, при відсутності в середовищі культивування даних клітин ЛПС, була прийнята нами в якості референтної норми, яка для загальної кількості Т-, В-лімфоцитів і субпопуляції Т-хелперів склала 6,4(0,4 %, 4,5(0,3 % і 3,7(0,2 % відповідно. Внесення до середовища культивування лімфоцитів ЛПС сприяло збільшенню кількості клітин, які експресували кластер диференціювання CD95, що свідчило про готовність лімфоцитів до апоптозу. Рівень лімфоцитів, які експресували на своїй поверхні молекули CD95, істотно підвищувався в міру збільшення концентрації ЛПС і був найбільшим при дозі ЛПС 100 мкг/мл. Відносно загального пулу Т-лімфоцитів найбільшу апоптогенну активність виявляли ЛПС H. influenzae, менш значним апоптогенним потенціалом володіли ЛПС P. aeruginosa, хоча виявлені відмінності не були вірогідними. Третє місце за здатністю індукувати апоптоз Т-лімфоцитів посідали ЛПС E. fergusonii, четверте - ЛПС P. vulgaris. Найменший вплив на експресію на поверхні Т-лімфоцитів молекул CD95 мали ЛПС облігатно анаеробних бактерій родів Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium. На рівень експресії на своїй поверхні молекул CD95 Т-хелперами/індукторами найбільше впливали ЛПС H. influenzae, приблизно однаковий потенціал з ними мали ЛПС P. aeruginosa. Потенціал ЛПС P. vulgaris був найменшим серед ЛПС факультативно анаеробних бактерій. Разом з цим, він істотно перевищував такий для ЛПС строгих анаеробів. Аналіз впливу ЛПС на експресію молекул CD95 В-лімфоцитами залежно від видової приналежності показав, що найбільшим потенціалом володіли ЛПС P. aeruginosa та ЛПС H. influenzae. Менш значне посилення експресії маркерів апоптозу зареєстровано при тестуванні ЛПС E. fergusonii і P. vulgaris. Найменшу здатність посилювати експресію маркерів апоптозу на поверхні В-лімфоцитів виявляли ЛПС облігатно анаеробних бактерій. Істотних розходжень між потенціалами ЛПС B. fragilis, P. melaninogenicus і F. necroforum не виявлено. Кореляційний аналіз та аналіз таблиць спряженості. Для дослідження взаємозв'язків між досліджуваними показниками нами був використаний метод параметричної кореляції (кореляція Пірсона). Визначали кореляційні зв'язки між такими показниками: ІЛ-1? моноцитів (пг/мл), ІЛ-6 моноцитів (пг/мл), ФНП-( моноцитів (пг/мл), ІЛ-2 лімфоцитів (пг/мл), ФІ моноцитів, %, ФЧ моноцитів (у.о.), кількість CD95-моноцитів (%), кількість CD95-Т-лімфоцитів (%), кількість CD95-Т-хелперів першого типу (%), кількість CD95-В-лімфоцитів (%). При концентрації ЛПС 10 мкг/мл нами спостерігався дуже сильний позитивний кореляційний зв'язок між рівнями продукції ІЛ-1?, ІЛ-6 і ФНП-( моноцитами (між ними існує фізичний взаємозв'язок). З іншого боку, спостерігали не настільки очевидні статистичні зв'язки між продукцією ФНП-( моноцитами і секрецією ІЛ-2 лімфоцитами, як показник кореляційного зв'язку між секреторною активністю моноцитів і лімфоцитів, а також між ФНП-( і кількістю CD95-Т-хелперів першого типу, що можна трактувати як взаємозв'язок між функціональною активністю моноцитів (ФНП-() і показниками їх готовності до реалізації апоптозної програми. Крім того, ми спостерігали зв'язок між кількістю CD95-Т-лімфоцитів, CD95-Т-хелперів першого типу, CD95-В-лімфоцитів - ці показники, які характеризують процес підготовки лімфоцитів до апоптозу, мали між собою тісний фізичний зв'язок. При концентрації ЛПС у тест-середовищі 50 мкг/мл просліджували такі ж сильні позитивні кореляційні зв'язки: між секрецією ІЛ-1?, ІЛ-6 і ФНП-( моноцитами, секрецією лімфоцитами ІЛ-2, тобто показниками секреторної активності моноцитів і лімфоцитів; між кількістю CD95-моноцитів, CD95-Т-лімфоцитів, CD95-Т-хелперів першого типу і CD95-В-лімфоцитів - показниками експресії молекул CD95 на поверхні моноцитів і лімфоцитів. Ці закономірності були очевидні і мали реальну фізичну природу. Але при цій концентрації ЛПС просліджували і нові цікаві взаємозв'язки: так, відзначали зворотний кореляційний зв'язок між ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-( моноцитів - показниками, які характеризують секреторну активність моноцитів з однієї сторони і ФЧ моноцитів - показником фагоцитарної активності моноцитів - з іншої. Цю цікаву закономірність, можливо, слід трактувати таким чином: при менших дозах ЛПС знижується імунне навантаження та активується, в основному, система гуморального імунітету. Сильна позитивна кореляція між ФІ і ФЧ моноцитів цілком з'ясовна - це різні показники одного процесу - фагоцитарної активності моноцитів. І ще ряд цікавих зворотних кореляцій між ФІ та ФЧ моноцитів з однієї сторони і рівнем CD95-Т-лімфоцитів, CD95-Т-хелперів першого типу - з іншої. Відповідно до цих даних, активація фагоцитозу моноцитами гальмує експресію на поверхні Т-лімфоцитів молекул CD95. При концентрації ЛПС 100 мкг/мл зберігались і посилювались усі виявлені попередні закономірності. Чітко просліджували позитивні внутрішньогрупові кореляції перемінних імунних клітин, які характеризують секреторну активність: продукція моноцитами ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-(, секреція лімфоцитами ІЛ-2 і зворотні кореляційні зв'язки з іншим блоком перемінних: ФІ і ФЧ моноцитів - показників фагоцитарної активності моноцитів. Таким чином, існує зворотний кореляційний взаємозв'язок між системою клітинного і гуморального імунітету. Нами був використаний метод аналізу таблиць спряженості для встановлення зв'язку між концентрацією ЛПС з одного боку і фагоцитарною активністю моноцитів і готовністю моноцитів і лімфоцитів до реалізації апоптозної програми - з іншого. Аналіз таблиць спряженості фагоцитарної активності моноцитів показав, що існує статистично вірогідний взаємозв'язок між концентрацією ЛПС і силою фагоцитарної реакції. Аналіз таблиць спряженості показників експресії на поверхні клітин молекул CD95 давав більш неоднозначну картину. Аналіз цих чотирьох таблиць дозволив підтвердити отриманий нами в експерименті результат - готовність моноцитів і лімфоцитів до реалізації апоптозної програми активувалась з підвищенням діючої концентрації ЛПС етіологічних агентів хронічних пародонтитів для Т-лімфоцитів і В-лімфоцитів, а для моноцитів і Тh1-клітин ступінь готовності до реалізації апоптозної програми був дозонезалежним параметром. Підводячи підсумок, можна констатувати, що отримані нами результати свідчать про істотне значення біологічних властивостей ліпополісахаридів умовно-патогенних бактерій - етіологічних агентів хронічних пародонтитів завдяки їх здатності змінювати секреторну функцію і готовність до реалізації апоптозної програми моноцитів і лімфоцитів, а також поглинальну здатність моноцитів. ВИСНОВКИ В дисертації викладене теоретичне обгрунтування ролі ЛПС грамнегативних умовно-патогенних бактерій родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium - етіологічних агентів хронічного пародонтиту в зміні функціональної активності моноцитів і лімфоцитів крові людини in vitro. ЛПС грамнегативних бактерій родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium за умов in vitro стимулюють секреторну функцію моноцитів і Тh1-лімфоцитів крові людини. Під впливом ЛПС підвищується продукція моноцитами ІЛ-1? і -6, ФНП-( і продукція ІЛ-2 Тh1-лімфоцитами. Цитокінстимулююча активність ЛПС є дозозалежною і видоспецифічною. Продукція зазначених цитокінів прогресивно зростає в міру збільшення діючої на моноцити і лімфоцити концентрації ЛПС. Найбільшу цитокінстимулюючу активність мають ЛПС E. fergusonii, P. aeruginosa, H. influenzae, найменшу – ЛПС B. fragilis, P. melaninogenicus, F. necroforum. ЛПС грамнегативних бактерій родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium впливають на фагоцитарну активність моноцитів за умов in vitro. Малі дози ЛПС (10 мкг/мл) стимулюють фагоцитоз моноцитів, великі дози (50-100 мкг/мл) - пригнічують його тим сильніше, чим вища діюча доза ЛПС. Найбільший імуносупресивний потенціал мають ЛПС E. fergusonii, P. aeruginosa, H. influenzae, найменший - ЛПС B. fragilis, P. melaninogenicus, F. necroforum. ЛПС грамнегативних бактерій родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium за умов in vitro стимулюють апоптоз моноцитів, Т- і В-лімфоцитів, що виявляється експресією на цих клітинах маркера апоптозу CD95 і збільшенням кількості клітин з морфологічними ознаками апоптозу. Здатність ЛПС грамнегативних бактерій посилювати експресію молекул CD95 на поверхні імунокомпетентних клітин, а також викликати морфологічні зміни, специфічні для апоптозу, зростає в міру збільшення діючої на моноцити і лімфоцити концентрації ЛПС, і більш виражена у представників родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, ніж у представників родів Bacteroides, Prevotella і Fusobacterium. При концентрації ЛПС 10 мкг/мл спостерігали сильний позитивний кореляційний зв'язок між рівнями продукції ІЛ-1?, -6 і ФНП-( моноцитами; не настільки очевидні статистичні зв'язки - між продукцією ФНП-( моноцитами і секрецією ІЛ-2 лімфоцитами, а також між ФНП-( і кількістю CD95-Т-хелперів. При концентраціях ЛПС 50 і 100 мкг/мл простежували ті ж сильні позитивні кореляційні зв'язки. Встановлений вірогідний взаємозв'язок між концентрацією ЛПС і силою фагоцитарної реакції. Аналіз таблиць спряженості показників експресії на поверхні клітин молекул CD95 дозволив підтвердити отриманий в експерименті результат - готовність моноцитів і лімфоцитів до реалізації апоптозної програми активувалась з підвищенням діючої концентрації ЛПС для Т- і В-лімфоцитів, а для моноцитів і Т-хелперів ступінь готовності до реалізації апоптозної програми був дозонезалежним параметром. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Косенко Ю.В. Влияние липополисахаридов бактерий на апоптоз моноцитов // Український медичний альманах. – 2004. - № 6. – С. 66-68. Косенко Ю.В. Влияние липополисахаридов этиологических агентов хронического пародонтита на фагоцитарную активность моноцитов // Український медичний альманах. – 2005. - № 5. – С. 66-68. Косенко Ю.В. Влияние липополисахаридов бактерий – этиологических агентов хронического пародонтита у беременных на секреторную активность моноцитов и лимфоцитов in vitro // Український медичний альманах. – 2005. - № 6. – С. 199-202. Косенко Ю.В., Перфільєва М.Ю. Вплив ліпополісахаридів етіологічних агентів хронічного пародонтиту на фагоцитарну активність моноцитів in vitro // Загальна патологія та патологічна фізіологія. – 2006. - № 1. – С. 16-19. (Дисертант провів експеримент, узагальнив одержані результати, написав статтю). Косенко Ю.В. Нормальная микрофлора полости рта // Загальна патологія та патологічна фізіологія. – 2006. - № 1. – С. 19-21. Kosenko Yuri V. Influence of bacterial lipopolysaccharides on secretory activity of T1-helpers // Загальна патологія та патологічна фізіологія. – 2006. - № 2. – С. 40. Косенко Ю.В. Корреляционный анализ и анализ таблиц сопряжённости показателей активности моноцитов и лимфоцитов крови человека под влиянием липополисахаридов // Український медичний альманах. – 2006. - № 3. – С. 74-77. АНОТАЦІЯ Косенко Ю.В. Патогенетичні механізми взаємодії ліпополісахаридів бактерій з моноцитами і лімфоцитами крові людини in vitro. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. – Луганський державний медичний університет. - Луганськ, 2006. Дисертацію присвячено питанням вивчення впливу ліпополісахаридів грамнегативних бактерій – збудників хронічних пародонтитів на функціональну активність моноцитів та лімфоцитів крові людини. При цьому використовували бактеріологічні, імунологічні, біохімічні та експериментальні методи з проведенням порівняльного факторного аналізу отриманих цифрових результатів. Встановлений дозозалежний і видоспецифічний вплив ліпополісахаридів грамнегативних бактерій на цитокінпродукуючу спроможність моноцитів і лімфоцитів крові людини, на фагоцитарну активність і апоптоз моноцитів, апоптоз Т- і В-лімфоцитів. Результати дослідження впроваджені в навчальний процес 2 кафедр медичного вузу України. Ключові слова: ліпополісахариди, бактерії, моноциті, лімфоцити, взаємодія. АННОТАЦИЯ Косенко Ю.В. Патогенетические механизмы взаимодействия липополисахаридов бактерий с моноцитами и лимфоцитами крови человека in vitro. - Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. – Луганский государственный медицинский университет. - Луганск, 2006. Диссертация посвящена вопросам изучения влияния липополисахаридов грамотрицательных бактерий – этиологических агентов хронических пародонтитов на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека. При этом использовали бактериологические, иммунологические, биохимические и экспериментальные методы с проведением сравнительного факторного анализа полученных цифровых результатов. Впервые установлено дозозависимое и видоспецифическое влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий на цитокинпродуцирующую способность моноцитов и лимфоцитов крови человека, на фагоцитарную активность и апоптоз моноцитов, апоптоз Т- и В-лимфоцитов. Показано, что по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов грамотрицательных бактерий происходит прогрессивное увеличение продукции интерлейкинов-1?, -2, -6, фактора некроза опухоли-?; усиление апоптоза моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, угнетение фагоцитоза моноцитов. Более значимо влияли на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека in vitro липополисахариды Escherichia fergusonii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менее существенно - липополисахариды Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenicus, Fusobacterium necroforum. Определены подходы к трактовке патогенеза хронических пародонтитов, этиологическими агентами которых являются условно-патогенные грамотрицательные бактерии, на основе изучения биологической активности липополисахаридов. Полученные данные внедрены в учебный процесс 2 кафедр медицинского вуза Украины. Ключевые слова: липополисахариды, бактерии, моноциты, лимфоциты, взаимодействие. SUMMARY Kosenko Yu.V. Pathogenetic mechanisms of interaction of bacterial lipopolysaccharides with human blood monocytes and lymphocytes in vitro. - Manuscript. The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of biological sciences on speciality 14.03.04 – pathological physiology. – Lugansk State Medical University. - Lugansk, 2006. The thesis is dedicated to problems of analysis of influencing of Gram-negative causative agents of chronic parodontitis lipopolysaccharides on functional activity of monocytes and lymphocytes of human blood. Thus have used bacteriological, immune, biochemical and experimental methods with realisation of the comparative factor analysis of the obtained digital outcomes. It was established dose-dependent and species-specific influence of Gram-negative bacteria lipopolysaccharides on cytokine-productive capacity of monocytes and lymphocytes of human blood, on cytophagous activity and apoptosis of monocytes, apoptosis of T- and B - lymphocytes. The outcomes of research are used in educational process of 2 departments of medical higher schools of Ukraine. Keywords: lipopolysaccharides, bacteria, monocytes, lymphocytes, interaction. Підписано до друку “01” жовтня 2006 р. Формат 60*90/16. Папір офсетний. Умовних. друк. арк. 0,8. Наклад 120 прим. Замовлення № 30. ПП Гайдаш І.С., Україна, 91007, Луганськ, вул. Привізна, 47а. PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *