Осмотична поведінка ооцитів і ембріонів миші на різних етапах кріоконсервування (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Пішко Ольга Володимирівна

УДК: 577.352.462:591.465.12:615.014.41

Осмотична поведінка ооцитів і ембріонів миші на різних етапах
кріоконсервування

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу
низькотемпературного консервування, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр
Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків

кандидат біологічних наук Лісіна Катерина Геннадіївна, Інститут
тваринництва УААН, старший науковий співробітник відділу біотехнології
репродукції сільськогосподарських тварин, м. Харків

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ експериментальних
клітинних систем, м. Київ

Захист відбудеться “15” листопада 2005 р. о 1330 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15,
вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано “14” жовтня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кріоконсервування ооцитів і ембріонів ссавців – одна
з найбільш актуальних проблем сучасної кріобіології, яка обумовлюється
необхідністю збереження генетичних ресурсів рідких і зникаючих видів
тварин [Karrow A.M., Critser J.K., 1997], створення кріобанків для
підтримки різноманітних ліній лабораторних тварин та пов’язана із
розробкою медичних програм, спрямованих на лікування різних форм
безплідності людини [Грищенко В.И. и др., 1990; Wood E.C. et al, 1997;
Abir R. et. al, 1998].

На сьогодні існує великий досвід низькотемпературного консервування
яйцеклітин і ембріонів ссавців [Whittingham D.G., et al 1972; Rall W.F.,
Fahy G.M., 1985; Trounson A.O.,1987], однак залишаються невирішеними
питання, які пов’язані з оптимізацією вже існуючих методів
кріоконсервування, ефективністю їх застосування для консервування
ембріонів ранніх стадій розвитку, а також пошуком нових кріопротекторів.
Незважаючи на певні успіхи в кріоконсервуванні ооцитів і ембріонів,
частота настання вагітностей після трансплантації деконсервованих
ембріонів дотепер залишається низькою. Внаслідок цього актуальними є
фундаментальні дослідження щодо вивчення біофізичних характеристик
клітин, які поряд з їх геометричними параметрами визначають оптимальні
умови процедури низькотемпературного консервування (концентрація і вид
кріопротектора, тривалість еквілібрації в кріозахисному середовищі,
швидкість заморожування і відігрівання, спосіб видалення кріопротектора
з деконсервованих клітин).

Використання ооцитів і ембріонів лабораторних тварин, зокрема
лабораторної миші, у дослідженнях, спрямованих на вивчення процесів
масообміну, обумовлено їхньою доступністю, невисокою вартістю і тим, що
загальні закономірності процесів масообміну в ембріонах миші можна
використовувати як аналог при розробці методів кріоконсервування ооцитів
і ембріонів інших видів ссавців. Крім того, дані, отримані для ембріонів
миші, можна розцінювати як характерні для плацентарних ссавців, однак їх
екстраполяція на ембріони й ооцити інших видів ссавців потребує деякої
корекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР Інституту проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України у відділі низькотемпературного консервування в
рамках теми «Експериментальне вивчення і кількісне моделювання процесів,
що відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних
об’єктів» (№ державної реєстрації 0101U003479).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення кінетики
транспорту води і кріопротекторів (етиленгліколю і 1,2-пропандіолу)
через плазматичні мембрани ооцитів і ембріонів миші ранніх стадій
розвитку на різних етапах кріоконсервування.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Вивчити осмотичну поведінку ооцитів і ембріонів миші в розчинах
етиленгліколю (ЕГ) і 1,2-пропандіолу (1,2-ПД). На основі даних про
кінетику зміни клітинного об’єму з використанням фізико-математичної
моделі Kedem-Katchalsky визначити коефіцієнти проникності плазматичних
мембран клітин для молекул води і кріопротектора та залежність швидкості
насичення клітин кріопротектором від виду, концентрації і методу
додавання кріозахисних речовин.

2. Провести теоретичне дослідження осмотичної поведінки клітин у різних
кріобіологічних ситуаціях на основі отриманих коефіцієнтів проникності.

3. Визначити можливість використання методу швидкого заморожування для
кріоконсервування 2-клітинних ембріонів миші під захистом ЕГ і 1,2-ПД.

4. Оцінити внесок процесів дегідратації в кріопошкодження і
внутрішньоклітинне кристалоутворення.

Об’єкт дослідження. Кінетика процесів масопереносу в ооцитах і ембріонах
миші на етапах додавання та виведення кріопротекторів, а також при
заморожуванні-відтаванні.

Предмет дослідження. Ооцити і передімплантаційні ембріони миші

1-, 2-, 8-клітинних стадій розвитку.

Методи дослідження. Одержання ооцитів і ембріонів миші проводили
хірургічним методом. Кріоконсервування здійснювали методом швидкого
заморожування. Для оцінки функціональної збереженності ембріонів
використовували метод культивування іn vіtro. Для морфологічного аналізу
та вивчення осмотичних процесів в клітинах при їх експозиції у
гіпертонічних розчинах кріопротекторів застосовували світлову
мікроскопію і волюмометрію. Параметри проникності клітинних мембран
розраховували за допомогою фізико-математичного моделювання з
використанням рівнянь лінійної нерівновагової термодинаміки.
Прогнозування осмотичної поведінки клітин на різних етапах
кріоконсервування здійснювали з використанням тієї ж моделі. Процеси
дегідратації і регідратації клітин при заморожуванні-відігріванні
ізольованих клітин вивчали за методом кріомікроскопії.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше визначено кількісні
значення коефіцієнтів проникності плазматичних мембран 1-, 2-,
8-клітинних ембріонів миші для молекул води, ЕГ та 1,2-ПД. Встановлено,
що стадія розвитку ембріона істотно не впливає на коефіцієнти
проникності їхніх мембран для молекул води і вказаних кріопротекторів.

З використанням визначених в експерименті коефіцієнтів проникності для
молекул води і ЕГ проведено моделювання осмотичної поведінки ембріонів
миші на етапах експозиції в розчині кріопротектора, заморожування і
видалення кріопротектора. Описано кінетику насичення клітин
кріопротекторами при різній їх концентрації у позаклітинному середовищі.

Показано, що використання в складі кріозахисного середовища 5,37 М ЕГ і
0,7 М сахарози та швидкого заморожування при кріоконсервуванні
2-клітинних ембріонів миші (однієї з найбільш чутливих до впливу різних
фізико-хімічних факторів стадій розвитку) дозволяє забезпечити
збереженість і життєздатність більш 60% ембріонів.

З залученням методу кріомікроскопії показано, що дегідратація ембріонів,
навіть у 1 М розчині NaCl не дозволяє уникнути внутрішньо-клітинної
кристалізації. Отримано експериментальні дані, що підтверджують
можливість вітрифікації позаклітинного і внутрішньоклітинного середовища
ембріонів у етиленгліколь-сахарозному розчині, який використовувався при
швидкому заморожуванні.

Практичне значення одержаних результатів. Показано, що ЕГ може
застосовуватися для розробки методів кріоконсервування з використанням
процедури швидкого заморожування 2-клітинних ембріонів миші. Одержані в
роботі дані про транспортні характеристики плазматичних мембран ооцитів
і передімплантаційних ембріонів миші можуть бути використані при
розробці методичних підходів кріоконсервування ембріонів ссавців.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно отримано
експериментальні дані, підготовлено аналітичний огляд літератури за
темою дисертації. Разом з науковим керівником дисертантом було здійснене
обговорення і узагальнення результатів дослідження та сформульовані
остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях
особистий внесок здобувача полягає:

? у роботі [1] у дослідженні щодо вивчення осмотичної поведінки
8-клітинних ембріонів миші у розчинах гліцерину;

? у роботах [3,4,5,7,8] у самостійному проведенні експериментів щодо
вивчення осмотичних реакцій ооцитів і ембріонів миші у розчинах
етиленгліколю та 1,2-пропандіолу, розрахуванні коефіцієнтів проникності
мембран ооцитів та ембріонів для молекул води і кріопротекторів,
статистичній обробці результатів досліджень;

? у роботі [4] в участі у дослідженні впливу часу експозиції
2-клітин-них ембріонів миші у кріоконсервуючому середовищі на їх
життєздатність;

? у роботі [6] у самостійному виконані експериментів щодо отримання
ембріонів та попередньої обробки їх розчинами осмотично активних
речовин; в участі у обговоренні результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на щорічних конференціях молодих учених
ІПКіК (Харків, 2003, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції
“Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2004); І
Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики” (Харків, 2004); Міжнародній конференції “Сохранение генетических
ресурсов” (Санкт-Петербург, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, у
тому числі 6 статей у фахових журналах і 2 тези доповідей на міжнародних
і національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 140
сторінках друкованого тексту, з яких 120 сторінок основного змісту;
складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи”,
трьох розділів з описом та обговоренням результатів власних досліджень,
висновків і списку цитованої літератури, що включає 211 джерел. Робота
ілюстрована 43 рисунками і 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

У роботі було використано ооцити та 1-, 2- і 8-клітинні ембріони миші
лінії СВА віком 6-8 тижнів.

Для одержання великої кількості яйцеклітин використовували метод
суперовуляції. Самкам проводили внутрішньочеревинну ін’єкцію 5 МО
гонадотропіну сироватки жеребних кобил (ГСЖК) і 7,5 МО людського
хоріонічного гонадотропіну (лХГ) з інтервалом 46-48 годин. Самок для
одержання ембріонів підсаджували до самців тієї ж лінії для запліднення.
Ооцити й ембріони отримували шляхом промивання відпрепарованих
яйцепроводів самок мишей фізіологічним середовищем Дюльбекко при
кімнатній температурі за стандартною методикою [Манк М., 1990]. Ооцити
одержували через 12-16 годин, а 1-, 2-, 8-клітинні ембріони – через
20-22, 46-48 і 72 години відповідно після ін’єкції лХГ.

Осмотичну поведінку клітин у розчинах NaCl, ЕГ і 1,2-ПД досліджували з
використанням методу світлової мікроскопії і з подальшим аналізом
фотографічних зображень.

Параметри проникності мембран ооцитів та ембріонів для молекул води і
кріопротектора визначали за допомогою модифікованої фізико-математичної
моделі Kedem-Katchalsky [Гордиенко Е.А., 1994 ].

Кріоконсервування ембріонів здійснювали з використанням методу швидкого
заморожування шляхом прямого занурення в рідкий азот у пластикових
соломинах (об’єм 100 мкл) [Исаченко В.В. и др., 1994]. Ембріони у
рідкому азоті зберігали протягом 5 – 7 діб.

Життєздатність ембріонів оцінювали за допомогою культивування іn vіtro у
краплях (100 мкл) середовища М16 під мінеральною олією в СО2-інкубаторі
при температурі 38оС в атмосфері 5%-го СО2. Життєздатними вважали
ембріони, що досягли стадії розширеної бластоцисти.

Процеси заморожування-відігрівання вивчали за допомогою методу
кріомікроскопії [Кулешова Л.Г., 2004 ].

Cтатистичну обробку експериментальних даних проводили за методом
Стьюдента — Фішера.

Експерименти на тваринах проводили відповідно до правил “Європейської
конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються з
експериментальною і іншою науковою метою” (Страсбург, 1986).

Результати досліджень та їх обговорення.

Осмотичні реакції ооцитів та ембріонів миші ранніх стадій розвитку в
розчинах проникаючих кріопротекторів. У процесі низькотемпературного
консервування клітини піддаються впливу змін осмотичного тиску
позаклітинного середовища, що впливає на величину їхнього об’єму,
ступінь деформації мембранних структур і вміст внутрішньоклітинної води.

Дослідження осмотичної поведінки ооцитів і ембріонів ссавців у розчинах
кріопротекторів різних концентрацій дозволяє одержати інформацію про
транспортні характеристики клітин, оцінити стійкість ооцитів і ембріонів
до дії цих кріопротекторів, а також прогнозувати поведінку клітин на
різних етапах кріоконсервування.

Отримані нами експериментальні залежності відносного об’єму ооцитів та
бластомерів 1-, 2- і 8-клітинних ембріонів миші від часу експозиції в
розчинах ЕГ і 1,2-ПД являють собою двофазні криві. Об’єм клітин швидко
зменшується за рахунок осмотичного відтоку води, а далі поступово
відновлюється в процесі проникнення кріопротектора в клітину, яке
супроводжується потоком води, що підтримує осмотичну рівновагу. На рис.1
наведено приклади осмотичної реакції ембріонів різних стадій розвитку в
10%-му розчині ЕГ, який виготовлено на фізіологічному середовищі
Дюльбекко (об’єм/об’єм). Зменшення клітинного об’єму на етапі
зневоднення склало 0,46V0±0,05V0, де V0 – початковий об’єм клітини у
фізіологічному розчині. Клітини стискувалися рівномірно і відновлювали
свій об’єм протягом 15 хвилин експозиції в розчині кріопротектора.
Дослідження осмотичної поведінки ембріонів у 10%-му розчині 1,2-ПД, який
виготовлено на фізіологічному середовищі Дюльбекко (об’єм/об’єм)
показало, що зневоднення клітин у цьому розчині було меншим
(0,63V0±0,03V0), ніж в розчині ЕГ такої ж концентрації, клітини
стискувалися нерівномірно. Відновлення об’єму в розчині 1,2-ПД
відбувалося за більш короткий проміжок часу (10 хвилин), ніж у розчині
ЕГ.

За умов збереження бар’єрних властивостей плазматичних мембран для поза-
і внутрішньоклітинних іонів зміна клітинного об’єму і процеси масообміну
(води і проникаючого кріопротектора) на всіх етапах кріоконсервування
визначаються такими біофізичними параметрами клітини, як її
поверхнево-об’ємне відношення, коефіцієнти проникності плазматичних
мембран для молекул води і кріопротектора та осмотично неактивний об’єм
клітини. Ці параметри входять як феноменологічні коефіцієнти у
фізико-математичну модель Kedem-Katchalsky, що описує супряжений
транспорт речовин крізь клітинну мембрану. За допомогою даної моделі ми
розрахували коефіцієнти проникності мембран ооцитів і ембріонів для
молекул води та кріопротектора. На рис.1 (суцільна лінія) подано
результат підбору коефіцієнтів проникності 1-, 2-, 8-клітинних ембріонів
миші в 10%-му розчині ЕГ.

Рис. 1. Експериментальна (?) і теоретична (–) залежності відносного
об’єму (V/V0) 1-клітинного (а), 2-клітинного (б), 8-клітинного (в)
ембріонів миші від часу експозиції в 10%-му розчині ЕГ.

Визначення коефіцієнтів проникності для молекул води LP і кріопротектора
kp проводили в два етапи. На першому етапі встановлювали значення Lp,
домагаючись збігу теоретичної кривої з ділянкою експериментальної
кривої, що відповідає фазі дегідратації; на другому – одержане таким
способом значення LP підставляли в рівняння моделі і намагалися отримати
найкращий збіг рішення теоретичної моделі з ділянкою експериментальної
кривої, яка відповідає фазі регідратації, підбираючи і визначаючи
значення kp.

Визначені значення параметрів проникності мембран ооцитів і ембріонів
миші для молекул ЕГ наведено в табл.1.

Таблиця 1

Коефіцієнти проникності мембран ооцитів і ембріонів миші для молекул
води і ЕГ

Концентрація ЕГ, % Стадія розвитку LP?1014м3/Н?с kP?107м/с

10 Ооцит

Зигота

2-клітинний ембріон

8-клітинний ембріон 4,5?0,3

4,26?0,78

3,43?0,17

2,44?0,11 1,2?0,2

1,12?0,6

1,25?0,1

0,64**?0,13

20 Зигота

2-клітинний ембріон

8-клітинний ембріон 4,58?1,48

3,99?0,19

1,98?0,17 4,88*?2,21

1,37?0,42

1,1**?0,12

30 Зигота

2-клітинний ембріон

8-клітинний ембріон 4,25?1,35

3,9?0,46

1,3?0,11 6,88*?3,19

1,26?0,32

1,6**?0,16

Примітка: статистично вірогідна розбіжність у порівнянні: * – з 10%-ою
концентрацією; ** –з 1- та 2-клітинними ембріонами, р<0,05 Зазначимо, що стадія розвитку істотно не впливає на значення коефіцієнта проникності плазматичних мембран ембріонів для молекул води, однак простежується тенденція до зниження цього транспортного коефіцієнта для 8-клітинних ембріонів миші. Не спостерігається вірогідних відмінностей коефіцієнтів проникності мембран 1- і 2-клітинних ембріонів для молекул ЕГ, які було виміряно у розчинах 10%-ї концентрації, а значення kр 8-клітинного ембріона приблизно в два рази нижче, ніж для ембріонів більш ранніх стадій розвитку. Проникність 1-клітинних ембріонів, на відміну від 2- і 8-клітинних, помітно підвищується в 20 і 30%-х розчинах ЕГ. Важливо, що зростання потоку ЕГ в зиготу, як правило, не супроводжувалося набряканням бластомерів. Отримані дані дозволяють припустити, що експозиція 1-клітинних ембріонів у розчинах ЕГ з концентраціями вище за 10% не призводить до порушень вибірних властивостей плазматичних мембран під дією осмотичного стресу, але може ініціювати збільшення проникності для самого кріопротектора [Meryman, 1971]. Мембрани 2- і 8-клітинних ембріонів виявилися більш стійкими до підвищених концентрацій ЕГ, про що свідчить відсутність залежності коефіцієнтів проникності їхніх мембран від концентрації позаклітинного кріопротектора. Експозиція ембріонів у 20 і 30%-х розчинах 1,2-ПД призводила до перевищення початкових об’ємів клітин у 1,6 рази, що свідчить про пошкоджуючу дію високих концентрацій 1,2-ПД на ембріони досліджуваних стадій розвитку. Внаслідок цього розрахувати коефіцієнти проникності у розчинах 1,2-ПД вказаних концентрацій неможливо. В табл. 2 наведено коефіцієнти проникності ооцитів та ембріонів миші для молекул води і 1,2-ПД у 10%-му розчині кріопротектора. Таблиця 2 Коефіцієнти проникності мембран ооцитів і ембріонів миші для молекул води та 1,2-ПД Стадія розвитку 1,2-ПД LP?1014 м3/Н?с kP?107 м/с Ооцит 4,10?0,20 2,50?0,10 Зигота 4,34?0,51 3,10?0,40 2-клітинний ембріон 3,52?0,30 2,08?0,34 8-клітинний ембріон 2,94?0,33 2,77?0,21 Дані щодо проникності плазматичних мембран ембріонів миші в розчинах 1,2-ПД свідчать, що kр для молекул 1,2-ПД не залежить від стадії розвитку, принаймні, у межах трьох перших дроблень. Запліднення також не впливає на коефіцієнт проникності клітинних мембран для молекул 1,2- ПД. Значення коефіцієнта проникності для молекул 1,2-ПД як найменше у 1,5 рази вище, ніж для молекул ЕГ. Коефіцієнт проникності мембран ооцитів і ембріонів статистично вірогідно не змінюється у ряді “ооцит – зигота – 2-клітинний – 8-клітинний ембріон миші”, а чисельні значення LP, які було встановлено при використанні 1,2-ПД, близькі до значень цього параметра в розчинах ЕГ. Аналіз осмотичної поведінки клітин при різних процедурах кріоконсервування дає можливість визначити найбільш оптимальні умови насичення клітин кріопротектором і видалення його з них, погоджувати процедуру експозиції в розчині кріопротектора з процедурою наступного заморожування. Використовуючи обчислені коефіцієнти проникності і відповідні геометричні параметри клітин, проведено моделювання осмотичної поведінки клітин на етапі додавання кріопротектора до ембріонів, заморожування ембріонів з різними швидкостями охолодження і видалення кріопротектора з клітин. На рис. 2 наведено теоретичні залежності відносного об’єму ембріонів миші різних стадій розвитку від температури при охолодженні зі швидкістю 1оС/хв. Рис. 2. Теоретичні залежності відносного об’єму (V/V0) ранніх ембріонів миші різних стадій розвитку від температури при охолодженні зі швидкістю 1оС/хв. 8 h u h h h h h h EH h h h h h h h h @ @ h $ @ $ @ 1/4 h h h h h h 1/4 1/4 1/4 @ $ @ @ @ oaeOaeoaeOaeOeae?E?1/4?ae?ae?E?«ae?aeOae?ae?aeOae1/4aeOae?¤?¤?«?ae??ae?? E?E?E?E? h h h h h h h h h h h ??????мбріонів більш високі швидкості охолодження з меншим ризиком появи внутрішньоклітинної кристалізації. Рис. 3. (1) ілюструє прогнозуєму зміну відносного об’єму зиготи миші при послідовній зміні розчинів на етапі додавання кріопротекторів (ЕГ і сахарози). Рис. 3. Теоретична залежність відносного об’єму зиготи миші (V/V0) при двоетапному додаванні (10?30%) етиленгліколю (1) та в присутності на другому етапі непроникаючої добавки (сахарози) 450 мОсм (2) і 750 мОсм (3) від часу експозиції. Результати прогнозування осмотичної поведінки 1-, 2- і 8-клітинних ембріонів миші при кріоконсервуванні підтвердили також необхідність додавання на другому етапі перед процедурою швидкого заморожування непроникаючої добавки в концентрації ~750 мОсм (для зменшення вірогідності внутрішньоклітинного кристалоутворення) і показали те, що етап відмивання від кріопротектора є надзвичайно важливим у процедурі кріоконсервування. Вплив різних етапів кріоконсервування на морфологічну і функціональну збереженість ембріонів миші. Існуючі методи швидкого заморожування ембріонів орієнтовані в основному на 8-клітинні ембріони та ембріони більш пізніх стадій розвитку. Мета даного розділу дослідження – вивчення можливості кріоконсервування 2-клітинних ембріонів миші методом швидкого заморожування шляхом прямого занурення в рідкий азот. Кріопротектором було обрано ЕГ. З одного боку, він виявився ефективним для кріоконсервування 8-клітинних ембріонів миші [Кривохарченко А.С., 1995], а з іншого боку, у наших дослідженнях його дія на ембріони всіх стадій розвитку виявилася більш щадящою, ніж дія 1,2-ПД. Вивчення осмотичної поведінки ембріонів миші в експериментах, що моделюють реальні кріобіологічні ситуації, важливе у виявленні залежності збереженості клітин після кріоконсервування від застосованих процедур і є теоретичною основою оптимізації основних етапів низькотемпературного консервування. Осмотична поведінка 2-клітинного ембріона миші при послідовній зміні кріозахисних розчинів в циклі, що послідовно моделює всі етапи кріоконсервування (крім заморожування-відігрівання) зображена на рис. 4. Рис. 4. Залежність відносного об’єму (V/V0) бластомера 2-клітинного ембріона миші від часу експозиції при послідовній зміні розчинів: I – 10% розчин ЕГ на фізіологічному середовищі Дюльбекко; II – середовище заморожування (5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози); III – 0,5М розчин сахарози; IV – фізіологічне середовище Дюльбекко. Незважаючи на багаторазову зміну величини клітинного об’єму (за рахунок зневоднення, насичення кріопротектором, видалення кріозахисної речовини з клітини) у процесі послідовної зміни розчинів кріопротекторів, бластомери 2-клітинного ембріона миші при переносі у фізіологічне середовище відновлюють свій початковий об’єм, що свідчить про стійкість даної стадії розвитку до подібної процедури обробки ЕГ і відмивання від нього. У роботі вивчено вплив часу експозиції 2-клітинних ембріонів у кріозахисному середовищі (5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози) на рівень їхньої життєздатності. Показано, що 1,5-хвилинна експозиція не впливає на життєздатність ембріонів, але вже при 3-хвилинній експозиції спостерігається тенденція до зниження їх життєздатності (рис. 5, а). Тому при подальшому кріоконсервуванні ембріони миші витримували у кріозахисному середовищі протягом 1,5 хвилин. Також було досліджено можливість скорочення часу експозиції ембріонів у середовищі заморожування до 45 секунд. Рис. 5. Рівень життєздатності 2-клітинних ембріонів миші після експозиції в розчинах ЕГ і сахарози (а) та після кріоконсервування методом швидкого заморожування (б). Результати кріоконсервування 2-клітинних ембріонів миші свідчать про відсутність вираженої залежності життєздатності деконсервованих ембріонів від часу еквілібрації в середовищі заморожування у діапазоні 45 – 90 секунд (рис. 5, б). Отриманий у роботі досить високий рівень життєздатності 2-клітинних ембріонів миші після швидкого заморожування в присутності ЕГ підтвердив доцільність подальших пошуків оптимальних схем використання ЕГ у кріоконсервуванні ембріонів ранніх стадій розвитку. Кріомікроскопічне дослідження процесів заморожування-відтавання ембріонів миші. Кріомікроскопія дотепер залишається єдиним методом, який дозволяє візуально спостерігати процеси, що протікають при заморожуванні і відтаванні як клітинних суспензій, так і ізольованих клітин. Основна інформація, яку можна одержати при використанні даного методу стосується процесів дегідратації і регідратації, утворення і плавлення поза- і внутрішньоклітинного льоду, рекристалізації, а також ролі цих процесів в ушкодженні клітин на всіх етапах кріоконсервування. Згідно з двофакторною теорією кріопошкодження загибель незахищених клітин при охолодженні зі швидкістю більш високою, ніж оптимальна, обумовлена внутрішньоклітинним кристалоутворенням, а при охолодженні зі швидкістю нижче за оптимальну – надмірною дегідратацією клітин [Mazur P., 1972]. У зв'язку з цим, основною задачею даного етапу роботи було експериментальне дослідження залежності внутрішньо-клітинного кристалоутворення від ступеня дегідратації клітин при їх заморожуванні у гіпертонічних розчинах хлористого натрію і сахарози, а також дослідження кристалізаційних процесів у клітинах, які захищені проникаючим кріопротектором ЕГ. При дослідженні залежності внутрішньоклітинної кристалізації від ступеня зневоднення клітини показано, що дегідратація клітини в 0,5 и 1 М розчинах NaCl та сахарози не захищає її від внутрішньоклітинної кристалізації (рис. 6), внаслідок чого відбувається пошкодження клітинної мембрани і вихід внутрішньоклітинного вмісту в позаклітинний простір (як і при охолодженні клітини, що не була зневоднена). Ушкодження в обох випадках спостерігали як у результаті дії позаклітинних кристалів (розриви і тріщини zona pellucіda), так і в результаті внутрішньоклітинної кристалізації (розриви мембран бластомерів). У 0,5 М розчині NaCl льодоутворення супроводжувалося утворенням дрібних кристалів, у той час як у 1 М розчині NaCl формувалися різноспрямовані лінійні структури (рис. 6.3). Рекристалізаційні процеси в обох випадках призводили до укрупнення кристалічних зерен (рис. 6.4). При відігріванні пошкодження плазматичних мембран зигот миші спостерігалися одразу після закінчення плавлення внутрішньоклітинних кристалів. У розчинах 0,5 і 1,0 М сахарози рівень зневоднення зигот і 2-клітинних ембріонів був нижче, ніж у розчинах хлориду натрію, оскільки ці розчини менш осмотично активні. При охолодженні розмір і морфологія дегідратованих клітин зберігалися. Льодоутворення в позаклітинному розчині супроводжувалося формуванням більш здрібненої структури, ніж у сольовому середовищі, що обумовлено підвищеною в'язкістю кріозахисного середовища, що містить сахарозу. При заморожуванні у даних середовищах як зигот, так і 2-клітинних ембріонів відзначався зсув температури внутрішньоклітинного фазового переходу у порівнянні з температурою кристалізації позаклітинного розчину. Переохолодження цитоплазми ембріонів складало не більш 1оС. У зв'язку з тим, що попереднє зневоднення ранніх ембріонів миші в розчинах непроникаючих речовин не дозволило запобігти внутрішньоклітинної кристалізації, яка неминуче призводила до виражених ушкоджень клітин, було використано підхід спільного впливу двох факторів: одночасного зневоднення і насичення ранніх ембріонів миші проникаючим кріопротектором у висококонцентрованих розчинах. Таким розчином було кріозахисне середовище на основі ЕГ і сахарози. Використання проникаючого в клітини кріопротектора ЕГ при заморожуванні ембріонів миші дозволяє уникнути внутрішньоклітинної кристалізації (рис.7). Рис. 6. Кінетика заморожування-відтавання зиготи миші в 1,0 М розчині NaCI: 1 – інтактна клітина; 2 – зневоднення зиготи миші в 1,0 М розчині NaCI; 3,4 – охолодження; 5-8 – відігрів. Рис. 7. Кінетика заморожування-відтавання 2-клітинного ембріона миші в етиленгліколь-сахарозному середо-вищі: 1 – інтактна клітина; 2 – зневоднення 2-клітинного ембріону миші в етиленгліколь-сахарозному середовищі; 3 – охолодження; .4-9 – відігрів. Показано, що середовище заморожування (5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози) має здатність до склування (рис.7.3) навіть при малих швидкостях охолодження (5оС/хв). Але на етапі відігрівання в області температур -62?-60оС було зафіксовано утворення в позаклітинному середовищі невеликої кількості кристалічних зародків у вигляді дендритних розеток (рис. 7.4). При подальшому підвищенні температури кристалічні структури не встигали збільшуватися, і поступово плавилися, що виключило вірогідність безпосереднього контакту клітин із кристалами льоду, які утворилися. Дані, що було отримано, свідчать про необхідність присутності кріопротектора в клітині для ефективного запобігання внутрішньоклітинної кристалізації. Показано можливість вітрифікації поза- і внутрішньоклітинного середовища ембріонів, що заморожуються в присутності 5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози з використанням малих швидкостей охолодження. ВИСНОВКИ Вивчення процесів масообміну між клітиною та оточуючим середовищем на головних етапах кріоконсервування дозволяє визначити біофізичні параметри клітин і за допомогою фізико-математичного моделювання прогнозувати різні кріобіологічні ситуації, що складає основу оптимізації режимів кріоконсервування біологічних об’єктів. В дисертації проведено дослідження осмотичних реакцій ооцитів і ембріонів миші у розчинах етиленгліколю і 1,2-пропандіолу та моделювання осмотичної поведінки клітин на різних етапах кріоконсервування; обґрунтовано використання етиленгліколю для кріоконсервування двоклітинних ембріонів миші. Визначено коефіцієнти проникності плазматичних мембран 1-, 2- і 8-клітинних ембріонів миші для молекул води і двох проникаючих кріопротекторів (етиленгліколю і 1,2-пропандіолу). Показано, що проникність мембран ембріонів для молекул 1,2-пропандіолу в 1,5 рази вище, ніж для молекул етиленгліколю. Встановлено, що запліднення і стадія розвитку ембріонів (у межах перших двох дроблень) не впливають на коефіцієнти проникності плазматичних мембран для молекул води і досліджуваних кріопротекторів із 10%-ю концентрацією. Коефіцієнти проникності мембран зигот миші для молекул етиленгліколю збільшуються з ростом концентрації кріопротектора, тоді як для 2-клітинних ембріонів коефіцієнт проникності не залежить від концентрації кріопротектора. На основі фізико-математичного моделювання обґрунтована доцільність використання непроникаючої добавки в середовищі заморожування та у середовищі відмивання; показано, що причини різної кріочутливості при повільному заморожуванні ранніх ембріонів миші можуть бути пов’язані з меншим поверхнево-об'ємним відношенням 1- і 2-клітинних ембріонів в порівнянні з 8-клітинними ембріонами. Встановлено, що використання кріоконсервуючого середовища, в склад якого входять 5,37 М етиленгліколю і 0,7 М сахарози та швидкого заморожування забезпечує збереженість і життєздатність більш 60% 2-клітинних ембріонів. Показано, що дегідратація ембріонів у розчині непроникаючої речовини не є достатньою умовою для виключення внутрішньоклітинної кристалізації. Охолодження з малими швидкостями забезпечує можливість вітрифікації поза- і внутрішньоклітинного середовища ембріонів у розчині, що містить 5,37 М етиленгліколю і 0,7 М сахарози і використовується при швидкому заморожуванні. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В., Пишко О.В. Влияние эквилибрации в среде замораживания на осмотическую устойчивость и жизнеспособность 8-клеточных эмбрионов мыши // Проблемы криобиологии. – 2004. – №1. – С.3-11. Пишко О.В. Влияние концентрации етиленгликоля на проницаемость мембран одно- и двухклеточных эмбрионов мыши // Проблемы криобио-логии. – 2004.–№2. – С.56-61. Пишко О.В., Смольянинова Е.И., Коваленко И.Ф., Коваленко С.Е., Розанов Л.Ф. Прогнозирование осмотического поведения эмбрионов мыши на основных этапах криоконсервирования // Проблемы криобиологии. – 2004. – №3. – С.3-8. Пішко О.В., Смольянінова Є.І., Розанов Л.Ф. Осмотична поведінка ооцитів та ембріонів миші в гіпертонічних розчинах етиленгліколю // Біологія тварин.– 2004. – Т.6, № 1,2. – С.373-377. Пишко О.В., Смольянинова Е.И., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф. Проницаемость мембран ооцитов и эмбрионов мыши для молекул 1,2-пропандиола и повреждающее действие его концентрированных растворов // Проблемы криобиологии. – 2004. – №4. – С.3-7. Кулешова Л.Г., Пишко О.В. Криомикроскопический анализ замораживания эмбрионов мыши ранних стадий развития // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т.15, №2. – С.119-128. Пишко О.В., Смольянинова Е.И., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф. Проницаемость мембран ооцитов и эмбрионов ранних стадий развития для воды и двухатомных спиртов // Тези доповідей І Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”. – Харків, 2004. – С.123. Пишко О.В., Смольянинова Е.И., Розанов Л.Ф. Подготовка эмбрионов мыши к процедурам медленного и быстрого замораживания с применением проникающих криопротекторов // Материалы Международной конференции „Сохранение генетических ресурсов”.– Санкт-Петербург, 2004.– С.835. АНОТАЦІЇ Пішко О.В. Осмотична поведінка ооцитів і ембріонів миші на різних етапах кріоконсервування.- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2005. Дисертаційна робота присвячена вивченню осмотичної поведінки ооцитів і ембріонів миші на різних етапах кріоконсервування та визначенню транспортних параметрів клітин. Показано, що стадія розвитку суттєво не впливає на значення коефіцієнта проникності плазматичних мембран ембріонів для молекул води. Не встановлено вірогідних відмінностей коефіцієнтів проникності мембран 1- та 2-клітинних ембріонів для молекул етиленгліколю (виміряних у розчинах 10%-ї концентрації), і тільки для 8-клітинного ембріона спостерігається тенденція до зниження цього показника. Встановлено, що запліднення і стадія розвитку не впливають на коефіцієнт проникності плазматичних мембран ембріонів миші для молекул 1,2-пропандіолу в межах перших трьох дроблень. Обґрунтовано використання етиленгліколь-сахарозного кріо-консервуючого середовища для заморожування чутливих до дії факторів кріопошкодження 2-клітинних ембріонів миші. Ключові слова: ооцит, ембріон, кріоконсервування, 1,2-пропандіол, етиленгліколь, фізико-математичне моделювання, коефіцієнт проникності. Пишко О.В. Осмотическое поведение ооцитов и эмбрионов мыши на различных этапах криоконсервирования.- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2005. Диссертационная работа посвящена изучению осмотического поведения ооцитов и эмбрионов мыши на различных этапах криоконсервирования и определению транспортных параметров клеток. С помощью физико-математического моделирования и волюмометрии определены коэффициенты проницаемости плазматических мембран ооцитов и эмбрионов мыши ранних стадий развития для молекул воды, этиленгликоля (ЭГ) и 1,2- пропандиола (1,2-ПД). Показано, что стадия развития не оказывает существенного влияния на значение коэффициента проницаемости плазматических мембран эмбрионов для молекул воды LP, хотя и наблюдается тенденция к снижению этого транспортного коэффициента для 8-клеточных эмбрионов мыши. Не установлено достоверных отличий коэффициентов проницаемости мембран 1- и 2-клеточных эмбрионов для молекул ЭГ kP (измеренных в растворах 10%-й концентрации), и только для 8-клеточного эмбриона значение этого показателя ниже. Проницаемость 1-клеточных эмбрионов заметно повышается в 20 и 30%-х растворах ЭГ. Тем не менее, их эквилибрация в растворах ЭГ с концентрациями выше 10% не приводит к нарушению свойств избирательной проницаемости плазматических мембран для ионов под действием осмотического стресса. Мембраны 2- и 8-клеточных эмбрионов оказались более устойчивыми к повышенным (20 и 30%) концентрациям ЭГ, чем мембраны зигот. Установлено, что коэффициент проницаемости плазматических мембран эмбрионов мыши для молекул 1,2-ПД не зависит от стадии развития, по крайней мере, в пределах трех первых делений. Оплодотворение также не оказывает влияния на коэффициент проницаемости клеточных мембран для молекул 1,2-ПД. Величина kP для молекул 1,2-ПД как минимум в 1,5 раза выше, чем для молекул ЭГ. Коэффициент проницаемости мембран ооцитов и эмбрионов также не изменяется в ряду “ооцит – зигота – 2-клеточный – 8-клеточный эмбрион мыши”, а численные значения LP, рассчитанные в присутствии 1,2-ПД, близки к значениям этого параметра в растворах ЭГ. Экспозиция эмбрионов в растворах 1,2-ПД с концентрацией 20 и 30% приводит к превышению клетками исходных объемов в 1,6 раза, что свидетельствует о повреждающем действии 1,2-ПД на эмбрионы исследуемых стадий развития. Результаты прогнозирования осмотического поведения 1-, 2- и 8-клеточных эмбрионов мыши при криоконсервировании подтверждают необходимость применения на втором этапе добавления ЭГ перед процедурой быстрого замораживания непроникающей добавки в концентрации ~750 мОсм. Меньшая эффективность применения медленных режимов при замораживании 2-клеточных эмбрионов и зигот (по сравнению с 8-клеточными) может быть связана с более медленным их обезвоживанием в процессе замораживания из-за меньшего поверхностно-объемного отношения бластомеров. Результаты теоретических расчетов свидетельствуют, что этап отмывания от криопротектора является чрезвычайно важным в процедуре криоконсервирования. Оценка динамики изменения концентрации криопротектора в клетке показала, что время 95%-го насыщения 1- и 2-клеточных эмбрионов мыши ЭГ не превышает 2 минут. При криоконсервировании 2-клеточных эмбрионов мыши методом быстрого замораживания путем прямого погружения в жидкий азот было установлено, что быстрое замораживание 2-клеточных эмбрионов мыши в присутствии 5,37 М ЭГ и 0,7 М сахарозы позволяет сохранить жизнеспособными более 60% эмбрионов. Увеличение времени экспозиции 2-клеточных эмбрионов мыши в среде замораживания в диапазоне 45 – 90 секунд не оказывает значительного влияния на жизнеспособность криоконсервированных эмбрионов. Влияние предварительного обезвоживания эмбрионов мыши ранних стадий развития и их насыщения высокой концентрацией ЭГ на вероятность внутриклеточного льдообразования изучено методом криомикроскопии. Показано, что предварительное обезвоживание в 0,5 и 1,0 М растворах хлорида натрия и сахарозы не исключает внутриклеточную кристаллизацию. Установлено, что криоконсервирующая среда, состоящая из 5,37 М ЭГ и 0,7 М сахарозы стеклуется даже при медленных скоростях замораживания (5оС/мин). Ключевые слова: ооцит, эмбрион, криоконсервирование, 1,2-пропандиол, этиленгликоль, физико-математическое моделирование, коэффициент проницаемости. Pishko O.V. Osmotic behavior of mouse oocytes and embryos at the different steps of cryopreservation. – Manuscript. Thesis for a candidate’s degree obtaining (PhD equivalent) on the specialty 03.00.19 – cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2005. The thesis is aimed to study the osmotic behavior of mouse oocytes and embryos at different steps of cryopreservation and to determie the transport parameters of cells. The development stage has been shown not affecting significantly the permeability coefficient for water molecules via embryo plasma membranes. There are no statistically significant differences for coefficients of membrane permeability for one- and two-cell embryos for ethylene glycol molecules (measured in 10% ethylene glycol solutions) and only for 8-cell embryo the tendency to a reduction of this index is observed. It has been established that fertilization and stage of development do not affect permeability coefficient of plasma membranes of mouse embryos for molecules of 1,2-PD within the limits of first three cleavage steps. The use of ethylene-sucrose cryopreservation medium for freezing the two-cell mouse embryos, being sensitive to the effect of cryodamage was substantiated. Key words: oocyte, embryo, cryopreservation, 1,2-propane diol, ethylene glycol, physical and chemical modeling, permeability coefficient. Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук Підписано до друку 10.10.2005 р. Формат 60х84 1/16 Наклад 100 прим. Умов. друк. арк. 0,9. Друк. на ризографі. ПП Степанов В.В. м. Харків, вул. Ак. Павлова, 311 а б в

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *