Окиснення білків і ліпідів у дріжджів saccharomyces cerevisiae та можлива роль каталаз у його запобіганні (автореферат)

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені Юрія ФЕДЬКОВИЧА

ГОСПОДАРЬОВ

Дмитро Валерійович

УДК 577.151.6+579.22+582.282.23

Окиснення білків і ліпідів у дріжджів saccharomyces cerevisiae та
можлива роль каталаз у його запобіганні

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Прикарпатському національному університеті імені
Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

ЛУЩАК Володимир Іванович,

Прикарпатський національний університет

імені Василя Стефаника,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

МЕЩИШЕН Іван Федорович,

Буковинський державний медичний університет,

завідувач кафедри медичної хімії

доктор біологічних наук, професор,

ГОНЧАР Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляторних систем клітини

Провідна установа: Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться “?14?” ?грудня? 2005 року о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 у Чернівецькому національному
університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул.
Лесі Українки, 25, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького
національного університету імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці,
вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий “_6_” _листопада_ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
РОБОТИ

Актуальність теми. Зараз багато уваги приділяють вивченню активованих
форм кисню (АФК), які утворюються в мітохондріях при диханні клітини, а
також у деяких метаболічних шляхах (Vranova E.D. et al., 2002). До АФК
відносять супероксидний і гідроксильний радикали, пероксид водню,
синглетний кисень, озон тощо. З одного боку, вони задіяні у
фізіологічному контролі клітинних функцій та сигнальній трансдукції
(Droege W., 2002; Thannickal V., Fanburg B.L., 2000), а з іншого, здатні
пошкоджувати клітини через окисну модифікацію білків, ліпідів та
нуклеїнових кислот (Eaton J.W., Qian M., 2002). За знешкодження АФК та
репарацію модифікованих молекул відповідальна система антиоксидантного
захисту. Її компонентом є низка ферментів, які безпосередньо
дезактивують АФК, зокрема каталаза [КФ1.11.1.6]. Як один з найзручніших
модельних об’єктів для вивчення метаболізму АФК використовують дріжджі
Saccharomyces cerevisiae. На сьогодні добре вивчені структура та
особливості функціонування каталази в клітині дріжджів. Проте поза
увагою залишилась здатність каталази за певних умов запобігати окисній
модифікації біомолекул через знешкодження пероксиду водню. Відомо, що
окисна модифікація здебільшого ініціюється гідроксильним радикалом, який
утворюється в реакції Фентона. При підсиленій генерації пероксиду водню
ймовірність цієї реакції зростає. Зменшення концентрації пероксиду водню
за рахунок його розкладання в каталазній або пероксидазній реакції є
одним з вирішальних моментів у запобіганні реакції Фентона. Тому
актуальною буде оцінка здатності каталаз запобігати окисній модифікації
білків і ліпідів в умовах, які сприяють розвитку оксидативного стресу у
дріжджів.

Зв’язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
проводилась з 2001 по 2005 рік на кафедрі біохімії Прикарпатського
національного університету ім. В. Стефаника і є частиною наукової
тематики кафедри “Еволюційні аспекти регуляції іонами заліза
вільнорадикальних процесів у живих організмах”, номер держреєстрації –
0102U003439.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – оцінити здатність різних
ізоферментів каталази запобігати окисній модифікації білків і ліпідів у
S. cerevisiae in vivo. Для реалізації мети були поставлені наступні
завдання:

1). Визначити та провести порівняльний аналіз вмісту продуктів окиснення
білків і ліпідів, а також активності антиоксидантних та пов’язаних з
ними ферментів у дефектних за різними ізозимами каталази клітинах S.
cerevisiae, вирощених в середовищах:

а) з різною концентрацією іонів заліза;

б) зі зброджуваним і незброджуваним джерелом вуглецю.

2). Визначити і проаналізувати вміст продуктів окиснення білків і
активність антиоксидантних і пов’язаних з ними ферментів у дріжджів S.
cerevisiae після інкубації з інгібітором каталази
3-аміно-1,2,4-тріазолом.

3). Провести окисну модифікацію in vitro чутливого до окиснення ферменту
S. cerevisiae (глюкозо-6-фосфатдегідрогенази) і порівняти кінетичні
характеристики окисненого та нативного білків.

Об’єкт дослідження – окиснення білків і ліпідів у дріжджів S.
cerevisiae.

Предмет дослідження – показники активності антиоксидантних ферментів та
вміст продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у
дріжджів, дефектних за каталазами.

Методи дослідження – мікробіологічні методи (побудова кривих росту
культур мікроорганізмів, оцінка числа живих клітин в культурі),
біохімічні методи (визначення активності ферментів, вмісту карбонільних
груп білків і тіобарбітурат-активних продуктів, часткове очищення
ферментів, розрахунок кінетичних характеристик ферменту), методи
математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. В дослідженні вперше виявлено, що
при використанні етанолу як джерела вуглецю дефектні за каталазою штами
дріжджів мають вищий вміст продуктів окиснення білків, ніж батьківський
штам. Встановлено, що у дріжджів цитозольна каталаза може запобігати
утворенню продуктів окисної модифікації білків і ліпідів за умов
вирощування на середовищах з етанолом і 0,5 мМ сульфату заліза
відповідно. Вперше проведено інактивацію in vitro
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази S. cerevisiae в системі Fe2+/Н2О2 та
порівняння кінетичних характеристик нативного та окисненого ферменту.
З’ясовано вплив ряду хімічних сполук різної природи на окисну
інактивацію глюкозо-6-фосфатдегідрогенази.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені в роботі
результати поглиблюють знання про роль каталази в еукаріотичних
організмів, зокрема у дріжджів. Отримані дані можна застосувати при
розробці технологій промислового культивування дріжджів. Результати
роботи використовуються при читанні лекцій та проведенні практичних
занять з біохімії, мікробіології та молекулярної біології на кафедрі
біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя
Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений аналіз
наукової літератури, виконана експериментальна частина роботи,
статистична обробка даних і приготування рукописів статей. Планування
роботи, аналіз та обговорення отриманого в дослідженнях матеріалу
проводились з науковим керівником. Технічну допомогу при виконанні
експериментів здійснювали студенти природничого факультету
Прикарпатського національного університету – С. Я. Мандрик, Л. Д.
Паньків, У. Я. Русин та аспірант М. М. Байляк.

Апробація результатів дисертації. Висновки дисертаційної роботи
доповідалися на Установчому З’їзді Українського товариства клітинної
біології (Львів, 2004 р.); X з’їзді Товариства мікробіологів України
(Одеса, 2004 р.); VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука
і освіта ‘2004” (Дніпропетровськ, 2004), звітно-наукових конференціях
Прикарпатського національного університету (Івано-Франківськ, 2002–2005)
та засіданнях кафедри біохімії Прикарпатського національного
університету.

Публікації. Результати роботи опубліковані у п’ятьох статтях та чотирьох
тезах доповідей наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів досліджень, п’яти розділів
результатів досліджень та їх обговорення, аналізу та узагальнення
результатів дослідження, списку використаних джерел. Робота викладена на
126 сторінках машинописного тексту і містить 19 рисунків та 15 таблиць.
Список літератури складається зі 152 джерел і розміщений на 15
сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У першому розділі роботи представлено огляд літератури, в якому подано
узагальнену інформацію про оксидативний стрес та регуляцію системи
антиоксидантного захисту і обміну заліза у дріжджів Saccharomyces
cerevisiae. Розглядаються механізми генерації АФК в клітині та їх роль в
метаболізмі, наводяться загальні відомості щодо антиоксидантної системи
дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Матеріали і методи досліджень

В роботі використовували наступні штами дріжджів Saccharomyces
cerevisiae: YPH250 (MATa trp1-?1 his3-?200 lys2-801 leu2-?1 ade2-101
ura3-52), дикий, або батьківський; YTT7 (MATa trp1-?1 his3-?200
lys2-801 leu2-?1 ade2-101 ctt1::URA3), дефектний за цитозольною
каталазою; YIT2 (MATa his3-?200 lys2-801 leu2-?1 ade2-101 ura3-52
cta1::TRP1), дефектний за пероксисомною каталазою; YWT1 (MATa his3-?200
lys2-801 leu2-?1 ade2-101 ctt1::URA3 cta1::TRP1), дефектний за
цитозольною та пероксисомною каталазами. Штами люб’язно надані доктором
Й. Інуї (Кіотський університет, Японія).

Дріжджі вирощували при 30 °С в середовищі, яке містило в 1 л: 20 г
глюкози, 20 г пептону та 10 г дріжджового екстракту. В дослідах, де
дріжджі необхідно було вирощувати на незброджуваних джерелах вуглецю,
замість глюкози в середовище додавали етанол (20 мл/л). Аерацію
забезпечували шляхом барботажування. Концентрацію клітин в суспензії
визначали шляхом підрахунку їх у лічильній камері Горяєва. При
визначенні кривих виживання, суспензію клітин (106 кл./мл) інкубували в
чашках Петрі протягом 2-ох годин у розчинах FeSO4 різної концентрації.
Для визначення активності ферментів клітини по досягненні культурою
необхідної фази росту збирали центрифугуванням, двічі промивали 50 мМ
калій-фосфатним буфером (рН 7,0) та ресуспендували у тому ж буфері.
Клітини руйнували шляхом вібрації густої клітинної суспензії зі скляними
кульками. В дослідах з окисної інактивації ферменту клітини руйнували
шляхом розтирання в ступці з кварцовим піском.
Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу частково очищували (у 2–4 рази) шляхом
висолювання сульфатом амонію. Безпосередньо перед експериментом препарат
діалізували протягом двох годин проти 1000 об’ємів буферу.

Активність ферментів визначали спектрофотометричним методом при
температурі 20 ± 1 °С. Активність супероксиддисмутази [СОД, КФ 1.15.1.1]
визначали при 400 нм на основі реакції окиснення кверцетину
супероксидним радикалом, за методом, описаним в роботі (Bagnyukova T.V.
et al., 2003). Одну одиницю супероксиддисмутазної активності визначали
як кількість ферменту (на мг білка), яка сповільнює реакцію окиснення
кверцетину на 50% від максимальної швидкості. Активність каталази
визначали, реєструючи розкладання пероксиду водню при довжині хвилі 240
нм. Для розрахунків використовували коефіцієнт молярної екстинкції для
пероксиду водню 39,4 М-1см-1. Активність каталази виражали в мкмоль
Н2О2/хв?мг білка. Активності глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] і
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази [Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49] оцінювали при 340 нм
за кількістю використаного та утвореного НАДФН відповідно. Активність
ферментів виражали в нмоль НАДФН/хв?мг білка.

Вміст карбонільних груп (КБ) білків. Концентрацію
динітрофенілгідразонових похідних, які утворюються при взаємодії
карбонільної групи з 2,4-динітрофенілгідразином, визначали
спектрофотометрично при довжині хвилі 370 нм (Levine R.L. et al., 2000).
Результати виражали в нмолях, віднесених на міліграм білка проби. Вміст
тіобарбітурат-активних продуктів (ТБКАП) визначали спектрофотометрично
при довжині хвилі 535 нм (Rice-Evans C.A. et al., 1991). Результати
досліджень виражали в пмоль, віднесених на міліграм білка супернатанту.

Концентрацію білка визначали методом Бредфорда (Bradford M.M., 1976). Як
стандарт використовували бичачий сироватковий альбумін. Статистичну
обробку і аналіз кінетичних параметрів ферменту проводили за допомогою
комп’ютерних програм “Mynova” та “Kinetics” (Brooks S.P., 1992). В
діаграмах представлено усереднені дані з 4–6 повторів досліду. Рис. 2 та
5 побудовані на основі одиничних спостережень.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив іонів заліза на виживання і ріст дефектних за різними
ізоферментами каталази штамів S. cerevisiae. Дефектні за каталазою штами
виявились чутливішими до дії екзогенного сульфату заліза (II), ніж
вихідний батьківський штам. При інкубації в 1 мМ розчині FeSO4 дефектний
за цитозольною каталазою штам мав на 42% менше клітин, здатних
утворювати колонії (рис. 1). Після обробки FeSO4 в концентрації 10
ммоль/л, штами, дефектні за цитозольною і пероксисомною каталазами,
мали, відповідно, на 81 і 62% менше життєздатних клітин, аніж
батьківський штам.

При глибинному культивуванні в середовищі з 0,5 мМ FeSO4 штами
характеризувались однаковими кривими росту (рис. 2). Подібність кривих
росту різних штамів вказує на те, що відсутність пероксисомної або
цитозольної каталази не впливає на ріст дріжджів у даному експерименті.
Відомо, що за цих умов дріжджі мають невелику кількість пероксисом та
мітохондрій (Ruis H., Kцller F., 1997), які є джерелами АФК. Окрім того,
синтез обох ізоферментів каталази репресується глюкозою і залежить від
рівня аерації клітин.

Вплив іонів заліза на активність антиоксидантних ферментів та вміст
окиснених білків і ліпідів у дефектних за різними ізоферментами каталази
штамів S. cerevisiae. При вирощуванні в середовищі з 0,5 ммоль/л FeSO4
дефектний за цитозольною каталазою штам мав в 1,8 раза вищий вміст ТБКАП
(рис. 3) і у три рази вищу активність СОД, ніж батьківський штам (рис.
4). У клітинах дефектного за пероксисомною каталазою (?cta1) штаму
активність СОД була навпаки – в 1,7 раза нижчою.

Таким чином, ми бачимо, що саме цитозольна каталаза перешкоджає
перетворенням, які призводять до ініціації пероксидного окиснення
ліпідів при надлишку іонів заліза. Відсутність цитозольної каталази та
іони заліза зумовлюють підвищення активності СОД у ?ctt1-штамі. Останній
ефект можна пояснити спектром реакцій, у які здатні вступати іони дво- і
тривалентного заліза за певних умов. Так, супероксидний радикал може
генеруватись в реакції тривалентного заліза з пероксидом водню
(Bueyьksцnmez F. et al., 1998). Ймовірність останньої зростає для
дефектних за каталазою штамів при вирощуванні в середовищі з надлишком
Fe2+.

Особливості антиоксидантного захисту у дикого та дефектних за різними
ізоферментами каталази штамів S. cerevisiae при вирощуванні у середовищі
з етанолом. Відомо, що при утилізації дріжджами етанолу як джерела
вуглецю та енергії, в їхніх клітинах зростає інтенсивність утворення АФК
(Costa V., Moradas-Ferreira P., 2001). Як наслідок, повинна зростати
активність ферментів антиоксидантного захисту. Якщо каталаза відіграє
важливу роль в антиоксидантному захисті дріжджів, то клітини дефектних
за каталазою штамів при вирощуванні на етанолі повинні були б зазнавати
оксидативного стресу. Оксидативний стрес може впливати на розмноження
дріжджових клітин. Тому першим етапом даної серії експериментів була
перевірка швидкості росту культур досліджуваних штамів. З рис. 5 видно,
що культури всіх штамів при вирощуванні на етанолі ростуть повільніше,
тому характеризуються більшим часом подвоєння клітин. Зокрема, культура
батьківського штаму на етанолвмісному середовищі росла у 2,5 раза
повільніше, ніж на середовищі з глюкозою. Дефектні за каталазою штами
YTT7, YIT2 та YWT1 росли відповідно в 4,7, 6,9 та 8,3 раза повільніше.

Для оцінки ролі оксидативного стресу в затримці росту досліджуваних
штамів S. cerevisiae на середовищі з етанолом ми визначали активність
антиоксидантних ферментів.

Виявилось, що клітини як батьківського штаму, так і ctt1?- та
cta1?-штамів, вирощені на етанолі, мають вищу каталазну активність, ніж
при вирощуванні на глюкозі (рис. 6). Проте у ctt1?cta1?-штаму каталазної
активності взагалі не виявлено.

Всі досліджувані штами при вирощуванні на етанолі мають у 2–3 рази вищу
активність СОД (рис. 7). За цих же умов, активності ГР та Г6ФДГ у
батьківського штаму відповідно в 1,6 та 1,9 раза вищі, ніж при
вирощуванні на глюкозі. Вища активність Г6ФДГ при вирощуванні на етанолі
спостерігалась також у штаму YIT2 (рис. 8). Проте клітини подвійного
мутанту при вирощуванні на етанолі мали в 1,6 раза нижчу активність
Г6ФДГ, ніж при вирощуванні на глюкозі.

Вища активність антиоксидантних ферментів у дріжджів, вирощених на
етанолі, швидше за все, пов’язана з тим, що дріжджі утилізують
незброджувані джерела вуглецю (включаючи етанол) шляхом аеробного
окиснення в мітохондріях. Оскільки мітохондрії вважаються одним з
основних джерел АФК, то в клітинах, які вирощуються на етанолі, АФК
можуть генеруватися інтенсивніше. В цьому випадку виживання клітин буде
залежати від потужності систем антиоксидантного захисту. Порушення
функціонування системи антиоксидантного захисту могли б бути причиною
оксидативного стресу, характерною ознакою якого є зростання вмісту
окиснених білків і ліпідів. Дефектні за каталазою штами YIT2, YTT7 та
YWT1 при вирощуванні на етанолі мали відповідно у 1,7, 4,6 та 4,7 раза
вищий вміст КБ, ніж при вирощуванні на глюкозі (рис. 9). Незважаючи на
це, у батьківського штаму вміст КБ був у два рази нижчим при вирощуванні
на етанолі, порівняно з таким у клітинах, вирощених на глюкозі. Нижчий
вміст КБ в клітинах дикого штаму, вирощених на етанолі, може
пояснюватись відмінностями в наборі білків, характерних для тих чи інших
умов вирощування.

Додаткову інформацію можна отримати, порівнявши досліджувані показники
між штамами. При вирощуванні на етанолі, порівняно з батьківським
штамом, подвійний мутант відповідно мав у 1,5 і 3,0 раза нижчу
активність ГР і Г6ФДГ. За цих же умов, дефектні за каталазою штами YIT2,
YTT7 та YWT1 мали відповідно в 2,5, 4,5 та 7,1 раза вищий вміст КБ, ніж
такий у дикого штаму. Ми встановили, що каталазна активність та вміст КБ
негативно корелюють в клітинах, вирощених на етанолі (r2 = 0,857). Тому
можна припустити, що каталаза захищає білки від окиснення, коли клітини
отримують енергію шляхом окисного фосфорилювання.

Відомо, що глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа легко інактивується
активованими формами кисню. Сильна негативна кореляція між вмістом КБ та
активністю Г6ФДГ (r2 = 0,988) дає підстави припустити, що в умовах
нашого експерименту Г6ФДГ може бути одним з білків, карбонільованих у
результаті окиснення. Таким чином, з отриманих результатів може витікати
те, що недостатність каталази у дріжджів призводить до оксидативного
стресу, при якому відбувається накопичення окиснених білків та
інактивація чутливих до дії АФК ферментів. Отже, каталази in vivo можуть
захищати Г6ФДГ від окисної інактивації при оксидативному стресі.

Вплив амінотріазолу на активність каталази Saccharomyces cerevisiae in
vivo. В наступній серії експериментів ми інактивували каталази
3-аміно-1,2,4-тріазолом (АМТ), додаючи його в різних концентраціях в
середовище, де інкубували клітини. Додатковою умовою, яка могла б
сприяти розвитку оксидативного стресу, була нестача поживних речовин.
Показано, що при нестачі джерела вуглецю в дріжджах активуються
регулятори транскрипції генів, продукти яких залучені в утилізації
альтернативних, відмінних від глюкози, джерел вуглецю. Під час
голодування в клітинах активно функціонують мітохондрії – основні
джерела АФК, – тому в цих умовах активуються механізми антиоксидантного
захисту.

З рис. 10А видно, що в контролі спостерігається порівняно висока
каталазна активність, співставна з такою в клітинах дріжджів, вирощених
на середовищі з етанолом. Ця обставина підтверджує факт про активацію
системи антиоксидантного захисту при нестачі поживних речовин.
Присутність АМТ в середовищі для інкубації у відносно низьких
концентраціях – від 0,1 до 0,5 мМ – не призводить до суттєвого зниження
каталазної активності. Проте клітини, інкубовані в присутності 0,75 мМ
АМТ, мали в середньому на 22% нижчу активність, ніж контрольні клітини.
При інкубації дріжджів з 1 мМ АМТ каталазна активність була вже в 1,9
раза нижча, ніж в контролі. Зі збільшенням концентрації АМТ активність
каталази поступово знижувалася і при 10 мМ становила 39% від такої в
контролі.

$ l   X

|

Ae

o

ue/ue/nueneueeaeY?A?A?ue/ue/ue/ue/ue/ue/ue®©®ue®©®uecue©ue©ue/ue/›•?n…

h—w CJ-

CJ-

th

O

O

Mu?ucauUO?E?E?E?E?E?E?E?E?E?E?UO?E?E?A?????UO?U?UO?UO?UO?O?E?E?Ou?u?u?u?
u

h—w Fродукції АФК, зумовлена вирощуванням клітин на етанолі, може
призводити до зниження активності Г6ФДГ і підвищення вмісту карбонільних
груп у білках клітин, дефектних за каталазами. З рис. 10Б видно, що
активність Г6ФДГ зі збільшенням концентрації АМТ істотно не знижується.
Найменша активність спостерігалася у клітин, які інкубувалися в 0,25 мМ
розчині АМТ. Тут вона становила 84% від такої в контрольному варіанті.

Між активністю каталази і Г6ФДГ при інгібуванні каталази амінотріазолом
in vivo спостерігалася менш тісна кореляція (r2 = 0,476), ніж в
попередній серії експериментів, коли різні штами дріжджів вирощували на
етанолвмісному середовищі. Отже, в даному випадку, зміни активності
Г6ФДГ, можливо, мало пов’язані з окисною модифікацією ферменту,
викликаною пероксидом водню або продуктами його метаболізму.

Багато авторів зазначають, що ймовірність окиснення білків пероксидом
водню підвищується в присутності іонів металів зі змінною валентністю.
Ця обставина може бути причиною зниження кореляції між активністю Г6ФДГ
і каталази. Так, амінотріазол може виступати хелатором іонів деяких
металів, зокрема заліза (Eaton J.W., Qian M., 2002).

Таким чином, з отриманих результатів видно, що АМТ здатний інгібувати
каталазну активність S. cerevisiae in vivo. Ступінь інгібування залежить
від концентрації АМТ. Проте інгібування каталаз S. cerevisiae
амінотріазолом за відсутності поживних речовин в середовищі не
рівноцінне відсутності якогось одного або обидвох ізоферментів каталази
при вирощуванні клітин на етанолвмісному середовищі.

Окисна інактивація глюкозо-6-фосфатдегідрогенази in vitro. Система
окиснення Fe2+/Н2О2 часто використовується в експериментах з окисної
інактивації ферментів. Високоочищені ферменти інактивуються при нижчих
концентраціях пероксиду водню та іонів двовалентного заліза, ніж
неочищені або очищені частково (Hermes-Lima M., Storey K.B., 1993;
Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992). В даній роботі проводили часткове
очищення Г6ФДГ, і тому концентрація загального білка в інкубаційній
суміші під час інактивації була відносно високою – 1,5 мг/мл. Можливо,
саме це було причиною того, що інактивація досліджуваного нами ферменту
досягалася при відносно високих концентраціях як пероксиду водню, так і
сульфату заліза (II). Фермент приблизно наполовину інактивувався при
інкубації з 2 мМ Н2О2 та 3 мМ FeSO4 протягом 5 хвилин, причому основна
частина активності втрачалася вже на перших хвилинах інкубації. Подальше
збільшення часу інкубації ферменту в суміші, де проводилась інактивація,
мало впливало на його активність.

Надалі ми порівняли кінетичні характеристики нативного та частково
інактивованого ферменту. Фермент може втрачати активність різними
шляхами. Одним з них є безпосереднє пошкодження центрів зв’язування
субстрату та коферменту, що могло б відобразитись на кінетичних
характеристиках ферменту. Так, у дослідах з Г6ФДГ Leuconostoc
mesenteroides константи Міхаеліса нативного та частково інактивованого
ферментів були однаковими (Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992).

З рис. 11А видно, що в нашому випадку для нативного ферменту
концентрація НАДФ+, необхідна для забезпечення половини максимальної
швидкості реакції, була в 1,6 раза більша за таку в частково
інактивованого. Ця ж величина для глюкозо-6-фосфату для нативного
ферменту була в 2,1 рази нижчою. Максимальна активність (рис. 11Б)
частково інактивованого ферменту була в 3-5 разів нижча за таку для
нативного, але коефіцієнт Хіла у нативної та частково інактивованої
Г6ФДГ фактично не відрізнявся.

Зменшення максимальної активності Г6ФДГ при інактивації свідчить про
відповідне зменшення кількості активних молекул ферменту. Молекули
ферменту, які забезпечують залишкову активність, відрізняються за
кінетичними параметрами від молекул нативної Г6ФДГ. Таким чином,
інактивація ферменту може відбуватися двома шляхами: перший – частина
молекул ферменту повністю втрачає активність, і другий – частина молекул
зберігає активність, але модифікується зі зміною спорідненості до
субстрату чи коферменту.

Природу інактивації ферменту в тій чи іншій системі окиснення можна
з’ясувати, вивчаючи вплив на цей процес різноманітних хімічних агентів,
а саме: антиоксидантів, інгібіторів вільнорадикальних реакцій,
хелаторів, субстратів ферменту тощо. З рис. 12 видно, що речовини,
структурно подібні до НАДФ+ – НАД+, АМФ, АДФ та АТФ, а також структурно
подібна до глюкозо-6-фосфату глюкоза – не захищають фермент від
інактивації. Окрім того, АТФ і АДФ, а також ЕДТА в концентрації 0,5 мМ
призводять до більшої інактивації Г6ФДГ в системі Fe2+/Н2О2. Відомо, що
ЕДТА, АТФ і АДФ можуть утворювати комплекси з іонами двовалентного
заліза (Eaton J.W., Qian M., 2002). У таких комплексах іони заліза менш
здатні до спонтанного окиснення, але активніше реагують з іншими
сполуками. Давно було помічено, що ЕДТА у високих концентраціях
перешкоджає утворенню тетрамерної форми Г6ФДГ, так званого
“НАДФ-ферменту” (Yue R.H., Noltmann E.A., Kuby S.A., 1969).

Глюкозо-6-фосфат та НАДФ+ відповідно в концентраціях 1,0 та 0,5 мМ
проявляли захисний ефект. Ці дані добре узгоджуються з результатами,
отриманими в експериментах з інактивації Г6ФДГ з L. mesenteroides
(Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992). При зв’язуванні ферменту із
субстратами можуть маскуватися чутливі до окиснення амінокислотні
залишки. Проте відомо також, що в присутності високих концентрацій НАДФ+
фермент тетрамеризується (Yue R.H., Noltmann E.A., Kuby S.A., 1969), що
теж може сприяти його захисту від окиснення.

Етанол, манітол, диметилсульфоксид та сечовина вважаються ефективними
знешкоджувачами гідроксильних радикалів (Eaton J.W., Qian M., 2002;
Davies K.J. et al., 1987). У наших експериментах, Г6ФДГ, яка
інактивувалась в системі Fe2+/Н2О2 у присутності манітолу та
диметилсульфоксиду, мала на 12% вищу залишкову активність, ніж та, яка
інактивувалась у контрольних зразках (рис. 12). З усіх досліджуваних
речовин найкращий захисний ефект проявила сечовина. Так, активність
ферменту, інактивація якого відбувалась у присутності сечовини, була в
1,5 раза вищою за активність в контрольних зразках.

Таким чином, результати наших експериментів дозволяють припустити, що в
системі Fe2+/Н2О2 інактивація Г6ФДГ відбувається внаслідок окиснення
ферменту гідроксильними радикалами. Про це свідчить наявність захисного
ефекту при інактивації в присутності диметилсульфоксиду, манітолу та
сечовини, які вважаються знешкоджувачами цього типу радикалів. Субстрати
також захищають Г6ФДГ від інактивації, як це було показано раніше.
Однією з причин втрати активності ферменту є зміни у характері його
зв’язування з субстратом і коферментом. Оскільки субстрати захищають
Г6ФДГ від інактивації, то можна припустити, що окиснюються амінокислотні
залишки ферменту, які знаходяться або в активному центрі, або поблизу
нього.

На основі проведених нами експериментів можна запропонувати метод для
виявлення білків, чутливих до окисної модифікації. Суть цього методу
можна представити у вигляді узагальнюючої схеми (рис. 13).

Дана схема демонструє взаємозв’язок між активністю певних
антиоксидантних ферментів (в нашому випадку – це каталаза), активністю
ферментів, які можуть бути чутливими до окисної модифікації, та вмістом
модифікованих окисненням білків. Доки підтримується баланс між
утворенням і знешкодженням АФК, клітина не зазнає оксидативного стресу.
Цей баланс у нашому випадку визначався трьома факторами, а саме:
функціонуванням системи антиоксидантного захисту, інтенсивністю
метаболічної генерації АФК і наявністю чинників, які підвищують
імовірність окисної модифікації біологічно важливих молекул. Дефект
якогось з антиоксидантних ферментів призводить до зниження потужності
антиоксидантного захисту. Якщо одночасно з цим зниженням підсилюється
інтенсивність продукування АФК, то зростає імовірність окиснення
чутливих до нього ферментів. Окиснення ферментів можна зафіксувати за
зниженням їх активності і одночасним підвищенням вмісту карбонільних
груп білків. В свою чергу, чутливість певних ферментів до окиснення
можна визначати in vitro, генеруючи АФК у штучних системах окиснення.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих
аспектів проблеми захисту організму при оксидативному стресі. Виявлено,
що каталаза відіграє суттєву роль у зменшенні імовірності
вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у дріжджів Saccharomyces
cerevisiae. Отримані результати поглибили відомості про функціонування
антиоксидантної системи у дріжджів за умов дії іонів заліза та при
утилізації ними незброджуваних джерел вуглецю.

Різні ізоферменти каталази, зокрема цитозольна каталаза, забезпечують
стійкість дріжджів Saccharomyces cerevisiae до дії іонів двовалентного
заліза. Так, дефектні за цитозольною та пероксисомною каталазами штами
після обробки FeSO4 в концентрації 10 ммоль/л мали, відповідно, на 81 і
62% меншу кількість життєздатних клітин, ніж батьківський штам.

При вирощуванні в середовищі з 0,5 ммоль/л FeSO4 вміст
тіобарбітурат-активних продуктів у дефектного за цитозольною каталазою
штаму Saccharomyces cerevisiae був вищим, ніж у батьківського штаму.
Отже, цитозольна каталаза перешкоджає перетворенням, які призводять до
ініціації пероксидного окиснення ліпідів при надлишку іонів заліза в
живильному середовищі.

За використання етанолу як джерела вуглецю та енергії у Saccharomyces
cerevisiae каталаза сприяє зменшенню ймовірності вільнорадикального
окиснення білків, зокрема глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Так, при
культивуванні в аерованому середовищі з етанолом як джерелом вуглецю
дефектні за різними ізоферментами каталази штами дріжджів мали в 2–7
разів вищий вміст карбонільних груп білків, ніж батьківський штам. При
вирощуванні у середовищі з етанолом глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна
активність батьківського штаму була в 1,9 раза вища, ніж при вирощуванні
на середовищі з глюкозою, тоді як у штаму, дефектного за обома
ізоферментами каталази – в 1,6 раза нижча.

Каталазна активність Saccharomyces cerevisiae пригнічується in vivo

3-аміно-1,2,4-тріазолом в концентраціях 1–10 мМ. Проте таке пригнічення
не рівноцінне генетично зумовленій відсутності одного або обидвох
ізоферментів каталази, про що свідчить відсутність адекватних змін в
активності антиоксидантних та пов’язаних з ними ферментів, у вмісті
продуктів вільнорадикального окиснення білків, тощо.

Диметилсульфоксид, манітол та сечовина частково запобігають інактивації
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в системі окиснення “Fe2+/Н2О2”.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Господарьов Д.В., Лущак В.І. Обмін іонів заліза у дріжджів // Укр.
біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 3. – С. 5–19.

Господарьов Д.В., Мандрик С. Я., Лущак В. І. Роль каталаз у захисті
білків від окислення у дріжджів Saccharomyces cerevisiae за використання
ними етанолу як джерела вуглецю // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, №
2. – С. 162-165.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував
безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники і підготував
рукопис статті

Господарьов Д.В., Байляк М.М., Лущак В.І. Вільнорадикальна інактивація
in vitro глюкозо-6-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae // Укр.
біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 1. – С. 58–64.

Планування, всі етапи очищення і визначення активності ферменту, а також
статистична обробка даних і написання статті здійснені дисертантом

Lushchak V.I., Gospodaryov D.V. Catalases protect cellular proteins from
oxidative modification in Saccharomyces cerevisiae // Cell Biol. Intl. –
2005. – Vol. 29, №3. – P. 187-192.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував
безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники, статистично
обробив дані і підготував рукопис статті

Господарьов Д.В., Лущак В.І. Вплив іонів заліза на активність
антиоксидантних ферментів дріжджів Saccharomyces cerevisiae // Укр.
біохім. журн. – 2004. – Т. 76, № 6. – С. 100–105.

Дисертант знімав криві росту мікроорганізмів, здійснював посів культур
дріжджів, готував безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі
показники, статистично обробив дані і підготував рукопис статті

Господарьов Д., Мандрик С., Русин У., Паньків Л. Вплив іонів заліза на
показники оксидативного стресу і активність антиоксидантних ферментів у
дріжджів Saccharomyces cerevisiae // Вісник Прикарпатського
університету. – 2003. – Вип. 3. Біологія. – С. 137–144.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував
безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники, статистично
обробив дані і підготував рукопис статті

Господарьов Д.В. Роль каталази та супероксиддисмутази у захисті клітин
дріжджів Saccharomyces cerevisiae від оксидативних пошкоджень // VII
Міжнародна науково-практична конференція “Наука і освіта ‘2004”. –
Дніпропетровськ, 2004. – С. 14–16.

Господарьов Д.В. Регуляторна та захисна роль цитозольної каталази у
дріжджів Saccharomyces cerevisiae // X З’їзд Товариства мікробіологів
України. – Одеса, 2004. – С. 42.

Gospodaryov D., Pankiv L., Rusyn U., Mandryk S. The effect of iron on
catalase and superoxide dismutase activities in yeast Saccharomyces
cerevisiae // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. –
Lviv, 2004. – P. 68.

Gospodaryov D., Mandryk S., Bailyak M., Lushchak V. Catalases protect
proteins of Saccharomyces cerevisiae against oxidation under growth on
ethanol // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. –
Lviv, 2004. – P. 75.

АНОТАЦІЯ

Господарьов Д. В. Окиснення білків і ліпідів у дріжджів Saccharomyces
cerevisiae та можлива роль каталаз у його запобіганні. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Чернівецький національний
університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 2005.

Дисертація присвячена проблемі окиснення білків і ліпідів у системах in
vitro та in vivo. Знайдено, що у концентраціях більших за 1 мМ сульфат
заліза знижує виживання дріжджів. Дефектні за каталазою штами виявились
чутливішими до дії іонів заліза, ніж батьківський штам. Доданий в
живильне середовище в концентраціях 0,02 та 0,5 мМ сульфат заліза не
впливав на швидкість та характер росту культур дріжджів. Проте клітини
дефектного за цитозольною каталазою штаму на середовищі з 0,5 мМ
сульфату заліза мали в 1,8 раза вищий вміст тіобарбітурат-активних
продуктів та в три рази вищу активність супероксиддисмутази, ніж
батьківський штам.

Дефектні за каталазами дріжджі повільніше росли на середовищі з етанолом
як джерелом вуглецю. У дріжджів, вирощених на середовищі з етанолом,
вміст карбонільних груп білків негативно корелював з активністю
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та каталази. Позитивну кореляцію знайдено
між активністю каталази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Зроблено
висновок про те, що каталази можуть in vivo запобігати модифікації
білків, чутливих до окиснення.

Досліджено інактивацію глюкозо-6-фосфатдегідрогенази in vitro у системі
окиснення Fe2+/Н2О2. Сечовина, манітол, диметилсульфоксид, а також НАДФ+
і глюкозо-6-фосфат деякою мірою запобігали інактивації, тоді як АТФ, АДФ
та ЕДТА посилювали її. Виявилось, що частково інактивований фермент
відрізняється від нативного за кінетичними параметрами – максимальною
швидкістю реакції та константою Міхаеліса.

Ключові слова: дріжджі Saccharomyces cerevisiae, каталаза, ТБК-активні
продукти, карбонільні групи білків, антиоксидантна система, іони заліза.

АННОТАЦИЯ

Господарёв Д. В. Окисление белков и липидов у дрожжей Saccharomyces
cerevisiae и возможная роль каталаз в его предотвращении. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. – Черновицкий национальный
университет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 2005.

Диссертация посвящена проблеме окисления белков и липидов в системах in
vitro и in vivo. В качестве модельной системы выбраны клетки дрожжей S.
cerevisiae, дефектные по каталазам. Найдено, что двухчасовая обработка
клеточных суспензий сульфатом железа в концентрации 10 мМ снижает на 81
и 62% количество жизнеспособных клеток у дрожжей, дефектных по
цитозольной и пероксисомной каталазе, соответственно. Добавленный в
питательную среду в концентрациях 0,02 и 0,5 мМ сульфат железа не влиял
на скорость и характер роста культуры дрожжей. Тем не менее, клетки
исследуемых штаммов, выращенные в среде с 0,5 мМ сульфата железа,
различались по содержанию тиобарбитурат-активных продуктов и активности
супероксиддисмутазы. У штамма, дефектного по цитозольной каталазе,
наблюдалась в три раза более высокая активность супероксиддисмутазы и в
1,8 раза более высокое содержание тиобарбитурат-активных продуктов, чем
у родительского штамма.

Дефектные по каталазам дрожжи медленней росли на среде с этанолом в
качестве источника углерода. Активности таких ферментов, как каталаза,
супероксиддисмутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и глутатионредуктаза,
были значительно выше у дрожжей, выращенных на среде с этанолом. У них
же содержание карбонильных групп белков негативно коррелировало с
активностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и каталазы. Положительная
корреляция найдена между активностью каталазы и активностью
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Сделан вывод о том, что при выращивании
дрожжей на несбраживаемых источниках углерода каталазы могут
предотвращать модификацию белков, чувствительных к окислению. Тем не
менее, генетически обусловленная недостаточность того или иного
изофермента каталазы не равноценна отсутствию каталазной активности при
ингибировании. Действие ингибитора каталазы, 3-амино-1,2,4-триазола, на
S. cerevisiae в концентрациях 1–10 мМ приводило к снижению каталазной
активности в 1,9–2,6 раза. Однако существенного снижения активности
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при этом не отмечалось.

Инактивацию глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы исследовано in vitro в системе
окисления Fe2+/Н2О2. Мочевина, маннитол, диметилсульфоксид, а также
НАДФ+ и глюкозо-6-фосфат в некоторой мере предотвращали инактивацию,
тогда как АТФ, АДФ и ЭДТА усугубляли её. Оказалось, что частично
инактивированный фермент отличается от нативного по кинетическим
параметрам – максимальной скорости реакции и константе Михаэлиса.

Ключевые слова: дрожжи Saccharomyces cerevisiae, каталаза, ТБК-активные
продукты, карбонильные группы белков, антиоксидантная система, ионы
железа.

SUMMARY

Gospodaryov D. V. Protein and lipid oxidation in the yeast Saccharomyces
cerevisiae and possible role of catalases for its prevention. –
Manuscript.

The thesis for the candidate’s degree in speciality 03.00.04 –
Biochemistry. – Chernivtsi National University named after Yu.
Fed’kovich, Chernivtsi, 2005.

The thesis is devoted to the problem of protein and lipid oxidation in
in vitro and in vivo systems. It has been found that in concentrations
more than 1 mM ferrous sulphate lowered the survival of yeast cells.
Catalase deficient strains were more sensitive to iron, than parental
strain. Ferrous sulphate added in the medium at concentrations of 0.02
and 0.5 mM did not affect the pattern and the rate of growth.
Nevertheless, cells of cytosolic catalase deficient strain grown with
0.5 mM ferrous sulphate had 1.8-fold higher content of
thiobarbituric-acid-reactive substances and 3-fold higher superoxide
dismutase activity.

Catalase deficient yeast grew slowly in the medium with ethanol as a
sole carbon source. In the ethanol-grown yeast, content of protein
carbonyls negatively correlated with glucose-6-phosphate dehydrogenase
and catalase activities. Therefore, it can be supposed that in vivo
catalases prevent the modification of proteins, sensitive to oxidation.

It has been investigated the inactivation in vitro of
glucose-6-phosphate dehydrogenase in the Fe2+/Н2О2 oxidation system.
Urea, mannitol, ethanol, dimethylsulphoxide and also NADP+ and
glucose-6-phosphate to some extent prevented inactivation, while ATP,
ADP and EDTA exacerbated it. It was found that kinetic parameters, the
maximal velocity and the Michaelis constant, were different in native
and partially inactivated enzyme.

Key words: yeast Saccharomyces cerevisiae, catalase, TBA-reactive
substances, protein carbonyls, antioxidant system, iron ions.

PAGE \* Arabic 6

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *