Нековалентні взаємодії флавін-мононуклеотиду із біологічно активними ароматичними речовинами та ДНК (автореферат)

СЕВАСТОПОЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ

МУХІНА Юлія Вікторівна

УДК 577.113:541.49

Нековалентні взаємодії флавін-мононуклеотиду із біологічно активними
ароматичними речовинами та ДНК

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Севастополь – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Севастопольському національному технічному
університеті Міністерства освіти та науки України.

Науковий керівник кандидат фізико-математичних наук,

доцент Євстигнєєв Максим Павлович,

Севастопольський національний технічний університет, доцент кафедри
фізики.

Офіційні опоненти:

— доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор
Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур НАН України,
провідний науковий співробітник (м. Харків);

— кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович, Харківський
національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, доцент кафедри
медичної і біологічної фізики (м. Харків).

Провідна установа

Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.

Захист відбудеться “_13_”_жовтня_ 2006р. о 1500 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 50.052.05 Севастопольського національного
технічного університету, 99053, м. Севастополь, Студмістечко, ауд.
А-201.

З дисертацію можна ознайомитись у бібліотеці Севастопольського
національного технічного університету за адресою: 99053, м. Севастополь,
Студмістечко.

Автореферат розіслано “__06__”_вересня_ 2006р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Євстигнєєв М.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рибофлавін (ароматичний вітамін В2, RBF) виконує
найважливішу каталітичну функцію в організмі та входить у склад
чисельних окислювально-відновних ферментів, які називають флавіновими.
Вітаміни сімейства B2 за нашого часу використовуються як елементи
вітамінотерапії, що знижує побічні ефекти від введення в організм
високотоксичного препарату. Зокрема, при введенні рибофлавіну
відбувається зворотність пошкоджень ДНК, викликаних мікотоксином
афлатоксином В1, зниження токсичності антипухлинного антибіотику
антрациклінового ряду доксорубіцину (DOX) і деяких інших ароматичних
цитотоксичних та мутагенних агентів, діючих шляхом їх комплексоутворення
із ДНК. Для пояснення спостережуваних ефектів при спільному використанні
вітаміну і доксорубіцину був запропонований механізм взаємодії DOX із
RBF (гетероасоціація), який включає утворення комплексів ароматичних
молекул із послідовною хімічною деградацією антибіотика, а також
механізм витиснення антибіотика із ДНК при додаванні вітаміну. Раніше
аналогічні механізми дії були запропоновані для пояснення зниження
токсичності різних ароматичних антибіотиків та мутагенів у присутності
інших ароматичних сполук, зокрема, кофеїну та хлорофіліну. На підставі
цих результатів можна зробити припущення щодо механізмів
комплексоутворення та конкуренції за сайти зв’язування із ДНК, які
можуть виявитись загальними для інтерпретації зміни біологічної
активності ароматичних речовин, які зв’язуються із ДНК у присутності
вітаміну В2. У зв’язку з цим з’ясування закономірностей гетероасоціації
вітаміну з ароматичними сполуками та їх спільного зв’язування із ДНК має
важливе значення для пояснення спостережуваних синергетичних ефектів
ароматичних препаратів при їх комбінованому використанні із вітаміном та
для знаходження ефективних засобів зниження побічних ефектів
хіміотерапії. В цій роботі як модель вітаміну В2 використовувався його
аналог – флавін-мононуклеотид (FMN) – він має більш високу розчинність,
ніж рибофлавін. Методом експериментальних досліджень був обраний метод
ядерного магнітного резонансу (ЯМР), який дозволяє отримати структурну
та термодинамічну інформації про комплекси молекул, утворених у розчині.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась в рамках держбюджетної наукової теми “Нуклеотид”
Міністерства освіти і науки України (№ держ.реєстр. 0104U000568):
“Гідротропний і синергетичний ефекти при утворенні гетерокомплексів
ароматичних біологічно активних молекул та їх взаємодії із ДНК у водному
розчині”, 2003-2006 р.р.; договору про науково-технічне співробітництво
на 2003-2008 р.р. між Беркбек коледжем Лондонського університету
(Великобританія) і СевНТУ.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування молекулярних
механізмів взаємодії похідного від вітаміну В2 – флавін-мононуклеотиду
із біологічно активними ароматичними сполуками (БАС) та спільного
зв’язування вітаміну і БАС із ДНК.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися задачі:

Визначення структурних та термодинамічних параметрів гетероасоціації
молекул БАС із флавін-мононуклеотидом, установлення внеску різних
фізичних взаємодій у стабілізацію комплексів молекул.

Визначення параметрів зв’язування FMN із фрагментом ДНК.

Розробка моделі трикомпонентної рівноваги FMN-БАС-ДНК і аналіз
механізмів взаємовпливу вітаміну на зв’язування ароматичних БАС із ДНК у
суміші.

Об’єкт дослідження – ароматичні молекули флавін-мононуклеотиду, кофеїну
(CAF), антипухлинних антибіотиків дауноміцину (DAU), ногаламіцину (NOG),
актиноміцину D (AMD), новатрону (NOV), фенантридинового барвника
бромистого етидію (EB), акридінового барвника профлавіну (PF) й фрагмент
ДНК – дезокситетрануклеотид 5’-d(TpGpCpА).

Предмет дослідження – молекулярні механізми зв’язування ароматичних БАС
з фрагментом ДНК у присутності флавін-мононуклеотиду.

Методи дослідження – одномірна (аналіз концентраційних і температурних
залежностей протонних хімічних зсувів) і двомірна (2М-TOCSY, 2М-ROESY)
гомоядерна 1H ЯМР-спектроскопія (500 МГц) – для одержання структурних і
термодинамічних параметрів гетероасоціації та комплексоутворення молекул
із ДНК, побудови структур комплексів ароматичних молекул, аналізу
динамічної рівноваги молекулярних асоціатів у розчині; комп’ютерні
програми X-PLOR і HyperChem – для розрахунку просторових структур
гетерокомплексів БАС із FMN.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше методами 1М і 2М
ЯМР-спектроскопії проведено дослідження гетероасоціації
флавін-мононуклеотиду з ароматичними антипухлинними антибіотиками та
мутагенами. Визначено просторові структури 1:1 гетерокомплексів молекул
і термодинамічні параметри реакцій асоціації (рівноважну константу,
ентальпію ((H), ентропію ((S) та енергію Гібса ((G)). Показано, що
гетерокомплекси деяких ароматичних антибіотиків та мутагенів із
вітаміном можуть додатково стабілізуватися в розчині міжмолекулярним
водневим зв’язком. Визначено рівноважні константи комплексоутворення FMN
із тетрамером ДНК. Запропонована фізична модель зв’язування ароматичного
ліганду з ядерною ДНК у присутності вітаміну В2. Проаналізовано
трикомпонентну рівновагу Вітамін-Антибіотик-ДНК у водному розчині і
вперше експериментально показана можливість використання параметрів, які
були отримані в результаті дослідження одно- та двокомпонентних
розчинів, для аналізу спільного зв’язування двох ароматичних сполук з
ДНК. Запропоновано критерій для кількісної оцінки ефекту витиснення
антибіотиків/мутагенів із ДНК при додаванні вітаміну, та критерій, який
дозволяє вказати домінуючий молекулярний процес, відповідний за це.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі результати
й висновки можуть бути використані в області біотехнології (розробка
речовин із заданими медико-біологічними властивостями), оцінки
відносного зниження токсичності лікарських препаратів при їх
комбінованому використанні із вітаміном В2, при розробці оптимальних
режимів комбінованої хіміотерапії й для інших застосувань, пов’язаних з
необхідністю обліку спільної дії біологічно активних ароматичних сполук.

Особистий внесок здобувача: у наукових працях, опублікованих зі
співавторами, особистий внесок здобувача полягає у наступному: в роботах
[1-4, 9-14, 17, 18] – участь в обробці експериментальних даних,
проведення розрахунків по запропонованим моделям, обговорення
результатів, побудова структур гетерокомплексів; у роботі [5] — побудова
структур 1:1 гетерокомплексів; у роботі [16] — розробка фізичної моделі
комплексоутворення, інтерпретація результатів; у роботах [6-8, 15, 19] –
розробка методики чисельного аналізу трикомпонентної суміші молекул,
проведення розрахунків, інтерпретація результатів; у роботах [2-7] –
участь у написанні статей.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, що ввійшли в
дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на: 16-й
Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”,
Севастополь, 25.05-01.06.2003р., Україна; 16-й Міжнародній конференції
по ЯМР-спектроскопії, Кембриджський університет, 29.06-03.07.2003р.,
Великобританія; 4-й Міжнародній конференції молодих вчених по прикладній
фізиці, Київ, 21-23.06.2004р., Україна; 5-й Міжнародній
міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки
та освіти”, Алушта, 30.04.-10.05.2004р., Україна; 1-й Всеукраїнській
науковій конференції “Проблеми біологічної та медичної фізики”, Харків,
20-22.09.2004р., Україна; 3-й Міжнародній конференції по новим
технологіям та застосуванням сучасних фізико-хімічних методів для
вивчення навколишнього середовища, Ростов-на-Дону, 21-25.03.2005р.,
Росія; Всеукраїнській науково-технічній конференції студентів,
аспірантів і молодих вчених “Фізика. Біофізика — 2005”, Севастополь,
04-09.04.2005р., Україна; 3-й Міжнародній конференції “Фізика рідких
середовищ: Сучасні проблеми”, Київ, 27-31.05.2005р., Україна;
Всеукраїнській науково-технічній конференції студентів, аспірантів і
молодих вчених “Фізика. Біофізика — 2006”, Севастополь, 17-22.04.2006р.,
Україна; 17-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і
кристалів”, Берегове, 20-26.09.2005р., Україна.

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли в дисертацію,
опубліковано 19 наукових праць, у тому числі 8 статей у наукових
журналах і 11 тез доповідей на міжнародних та національних наукових
конференціях.

Структура дисертації. Робота складається із вступу, чотирьох розділів,
висновків і додатка. Повний обсяг дисертації складає 164 стор., з них
додаток займає 22 стор., список використаних джерел – 175 найменувань –
13 стор. Дисертація містить 47 рис. і 9 табл., у тому числі на 10
окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, визначена мета і задачі
дослідження, показані новизна, а також наукова і практична значимість
отриманих результатів та особистий внесок здобувача.

У першому розділі проведено аналіз літературних даних за темою
дисертації. Відзначена біологічна роль вітаміну В2, рибофлавіну,
необхідного для протікання нормального обміну речовин в організмі, при
цьому вказано, що як модель вітаміну для фізико-хімічних досліджень
доцільно використовувати його більш розчинний аналог –
флавін-мононуклеотид. Відзначено використовування RBF (FMN) в
вітамінотерапії онкозахворювань для зниження побічної дії деяких
антипухлинних препаратів, які зв’язуються із ДНК шляхом інтеркаляції.
Проведений огляд літературних даних про молекулярні механізми зміни
медико-біологічних властивостей ароматичних сполук у присутності
вітаміну В2 показав, що за нашого часу немає загального уявлення про
природу синергетичної взаємодії БАС з вітаміном при їх спільному
застосуванні. Однак, існує думка, що спостерігаємі зміни активності
препаратів можуть бути обумовлені безпосередньою взаємодією ароматичних
молекул між собою і з ДНК клітини, яка має нековалентний характер. Далі
показано, що основні види нековалентних взаємодій малих ароматичних
молекул включають самоасоціацію, гетероасоціацію та комплексоутворення
лігандів із ДНК шляхом інтеркаляційного або зовнішнього зв’язування.
Проаналізовано сучасний стан проблеми вивчення процесів асоціації та
комплексоутворення БАС з ДНК різними експериментальними методами.
Зроблено висновок, що метод ядерного магнітного резонансу достатньо
ефективний експериментальний метод для вивчення механізмів асоціації та
комплексоутворення у водному середовищу.

У другому розділі розглянуто основи спектроскопії ЯМР. Коротко описані
експериментальні параметри ЯМР експерименту: інтенсивність сигналу ЯМР,
хімічний зсув, мультиплетність спектру, час релаксації та їх
застосування для вивчення молекулярних комплексів у розчині. Розглянуто
методики двомірної гомоядерної спектроскопії, які виявляють взаємодії
між ядрами через хімічні зв’язки (2М-COSY/2М-TOCSY) і через простір
(2М-NOESY/2М-ROESY). Описано засоби готування розчинів експериментальних
зразків і умови проведення експериментів.

У третьому розділі проведено дослідження гетероасоціації ароматичних
біологічно активних сполук: антипухлинних антибіотиків (дауноміцин,
ногаламіцин, актиноміцин D, новатрон) та мутагенів (фенантридиновий
барвник бромистий етидій, акридіновий барвник профлавін та кофеїн) із
похідним вітаміну В2 – флавін-мононуклеотидом. Описана методика
проведення обчислювального експерименту, яка заснована на використанні
концентраційних та температурних залежностей протонних хімічних зсувів
молекул для отримання термодинамічних параметрів реакцій асоціації
(рівноважну константу, ентальпію й ентропію); та методика будування
найбільш імовірних просторових структур гетерокомплексів молекул з
використанням молекулярної механіки (програма моделювання X-PLOR),
індукованих хімічних зсувів протонів молекул та результатів аналізу
двомірних ЯМР спектрів.

Як приклад, на рис.1 представлені концентраційні і температурні
залежності хімічних зсувів протонів FMN і PF у змішаному розчині. Для
інтерпретації експериментальних даних була використована модель
гетероасоціації, в якій враховується динамічна рівновага взаємодіючих
молекул А і Р, яка включає утворювання нескінченномірних самоасоціатів,
а також гетероасоціатів різного типу, відповідно наступній схемі
взаємодії:

, (1)

де KА, KP і Kh – рівноважні константи самоасоціації FMN, БАС та їх
гетероасоціації, відповідно.

Рис.1. Концентраційні (а) при T=298К, CFMN = 1.58 ммоль/л і
температурні (б) при CPF = 2.8 ммоль/л, CFMN = 1.58 ммоль/л залежності
хімічних зсувів протонів FMN і PF у змішаному розчині FMN-PF.

Враховуючи характер швидкого перетворювання одних форм асоціатів в інші
у масштабі часу ЯМР (швидкий обмін взаємодіючих молекул), та ефект
ближнього порядку на екранування ядер (тільки найближчі сусідні молекули
дають внесок в екранування ядер в асоціаті), концентраційна залежність
спостерігаємих протонних хімічних зсувів ? для протонів FMN може бути
записана у вигляді:

. (2)

Тут величини (m, (d, (с — протонні хімічні зсуви в мономерній, димерній
формах і в гетероасоціатах відповідно. Вирази для хімічних зсувів
протонів речовини Р можуть бути отримані із (2) шляхом заміни символів А
на Р і навпаки.

Для обчислення термодинамічних параметрів ентальпії ((Hh0), ентропії
((Sh0) і енергії Гібса ((Gh0) реакцій гетероасоціації було використано
співвідношення (2), у котрому вплив температури на значення ((Т)
визначалось температурною залежністю рівноважних констант самоасоціації
і гетероасоціації молекул:

.

Спостерігаємі хімічні зсуви молекул БАС (2) є функціями двох невідомих
(с і Кh — для концентраційної залежності, і (H, (S — для температурної
залежності, які визначалися шляхом мінімізації квадратичної функції
нев’язки:

,

де n – число експериментальних точок; (ei і (i — експериментальні
значення протонного хімічного зсуву для i-ої концентрації або
температури і відповідні розрахункові значення з використанням
теоретичної моделі (2).

Отримані в результаті розрахунку параметри реакцій гетероасоціації
флавін-мононуклеотиду з антибіотиками (DAU, AMD, NOV, NOG) і мутагенами
(PF, EB, CAF) у водному розчині наведено у табл.1.

Таблиця 1

Параметри гетероасоціації ароматичних молекул

у 0.1 моль/л фосфатному буфері, pD 7.1

Система Т, К Kh,

л/моль -(Gh0,

кДж/моль -(Hh0,

кДж/моль -(Sh0,

Дж/(моль(K)

FMN-PF 298 920(80 17(0.2 41(3 80(10

FMN-EB 298 640(75 16(0.3 33(2 57(7

FMN-NOV 303 (34(8)*103 26.7(0.1 55(6 87(11

FMN-DAU 298 453(28 15.1(0.2 36(5 70(9

FMN-NOG 303 790(50 17(0.1 30(1 44(4

FMN-AMD 298 890(330 16.8(0.8 34(6 50(10

FMN-CAF 298 161(26 12.6(0.4 24(3 40(16

Примітка: Розрахункові значення хімічних зсувів ?с протонів взаємодіючих
молекул у гетерокомплексах не наведені.

Проведений аналіз 2М-ROESY спектрів показав, що в змішаних розчинах FMN
із PF, EB і NOV спостерігаються крос-піки, які слід віднести до
міжмолекулярних протон-протонних взаємодій молекул (табл.2). Як приклад,
на рис.2 наведено контурний 2М-ROESY спектр розчину FMN-PF, який
свідчить про наявність двох найбільш імовірних структур FMN-PF з
характерним набором крос-піків, віднесених до кожної структури.

Таблиця 2

Міжмолекулярні ROE контакти між протонами

FMN і PF/EB/NOV

FMN PF EB NOV

Структура 1 Структура 2

Н9 Н1/8 — — —

Н6 — Н9, Н2/7 СН3 —

8СН3 Н2/7, Н1/8 Н4/5 — Н2/3

7СН3 Н4/5 Н2/7, Н1/8 —

Рис.2. Контурний 2М-ROESY спектр (500 МГц, (m=240 мс) розчину PF-FMN при
СPF = 4 ммоль/л, CFMN = 4 ммоль/л (T=300K). Міжмолекулярні крос-пікі між
протонамі PF і FMN показані стрілками ( ) – для Структури 1, і (
) — для Структури 2.

Значення хімічних зсувів (C для протонів БАС і результати аналізу
2М-ROESY спектрів змішаних розчинів (див. табл. 2) були використані для
розрахунку найбільш ймовірних структур 1:1 комплексів з використанням
програми X-PLOR. Як приклад, на рис.3 відображені отриманні просторові
структури FMN-PF, FMN-EB та FMN-NOV асоціатів.

Рис.3. Розрахункові структури 1:1 гетерокомплексів: a) FMN-PF, Структура
1, б) FMN-PF, Структура 2, в) FMN-NOV, г) FMN-EB. Міжмолекулярний
водневий зв’язок показано пунктиром. Міжмолекулярні ROE-контакти
показані безперервними стрілками.

Перевищення констант гетероасоціації над відповідними константами
самоасоціації для деяких із розглянутих систем, а також отримані
негативні значення ентальпії й ентропії реакцій асоціації антибіотиків і
мутагенів з FMN свідчать про утворення енергетично стабільних комплексів
лігандів у водному розчині за рахунок дисперсійних і гідрофобних
взаємодій, при цьому у системах FMN-EB/PF/NOV імовірно утворювання
Н-зв’язку.

Стекінг-взаємодія також грає визначальну роль і при формуванні комплексу
молекул FMN і CAF, яка, очевидно, є важливим фактором гідротропної дії
кофеїну на біологічно активні ароматичні речовини у водному розчині.
Відзначена істотно більша ефективність солюбілізуючої дії кофеїну у
порівнянні з нікотинамідом на малорозчинні БАС в однакових умовах
розчиннику, що корелює із визначеною в цій роботі рівноважною константою
гетероасоціації FMN-CAF (KFMN-CAF = 161(26 л/моль, KFMN-NMD = 59(2
л/моль).

У четвертому розділі проведено аналіз сумісного (конкурентного)
зв’язування ароматичних антипухлинних антибіотиків і мутагенів із ДНК у
присутності вітаміну В2 у водному розчині.

Для проведення подібних досліджень була запропонована фізична модель
ядерної ДНК — тетрамірна послідовність 5′ — d(TpGpCpA) — основу котрої
складає уявлення про зв’язування ліганду з невеликими ділянками ДНК
клітини вільними від білків. Використання такої олігонуклеотидної
послідовності обумовлено наступним. По-перше, у першому наближенні має
сенс розглядати конкуренцію лігандів у локальному сусідстві тільки
одного сайту зв’язування; для всіх розглядаємих лігандів зв’язування з
d(TpGpCpA) з достатньою мірою точності відповідає стехіометричному
співвідношенню 1:2. По-друге, досліджуваний тетрануклеотид містить всі
чотири природні нуклеотиди, що дозволяє зменшити внесок в проведений
аналіз різної специфічності конкуруючих речовин при зв’язуванні з ДНК.

ЯМР аналіз взаємодії ароматичних БАС і вітаміну з ДНК проводився з
відповідністю до загальної схеми, яка включає послідовний аналіз окремих
процесів самоасоціації, гетероасоціації ароматичних лігандів і їх
комплексоутворення із ДНК в однакових умовах розчинника. З метою
отримання рівноважних параметрів, які необхідні для дослідження
спільного зв’язування БАС і вітаміну з ДНК, вивчено комплексоутворення
флавін-мононуклеотиду з 5’-d(TpGpCpA). Результати розрахунків наведені в
табл. 3.

Таблиця 3

Параметри комплексоутворення FMN з d(TGCA)

в 0.1 моль/л фосфатному буфері, pD 7.1, T=298K

Комплекс K, л/моль ?, млн-1

H9 H6 8Me 7Me

1:1 100 ( 40 7.93 7.70 2.53 2.45

1:2 8000 ( 2000 7.71 7.65 2.45 2.34

Примітка: Рівноважні константи утворювання 2:1 і 2:2 комплексів
приймають малі значення і надійно не можуть бути визначені.

Аналіз індукованих хімічних зсувів і константи комплексоутворення
свідчать про переважно інтеркаляційне або частково інтеркаляційне
зв’язування вітаміну з дуплексною формою d(TGCA) у водному розчині,
причому процес комплексоутворення носить антикооперативний характер.

Для аналізу спільного зв’язування двох лігандів з ДНК передбачається
наступна модель (3) трьохкомпонентної рівноваги БАС (D), вітаміну (F) і
вільних від білків тетрамірних ділянок ядерної ДНК (N). У моделі (3)
враховуються всі типи нековалентних взаємодій у розчині: самоасоціація,
гетероасоціація і комплексоутворення.

Кожна реакція у схемі (3) вносить свій вклад в закон збереження мас (4)
і в спостережуваний протонний хімічний зсув (5), вимірюваний в умовах
швидкого обміну для всіх компонентів у змішаному розчині:

,

де D0, F0, N0 і D, F, N — загальні і мономірні концентрації DAU, FMN і
d(TGCA), відповідно; (m, (d, (с, (1, (2 — протонні хімічні зсуви DAU
(D) і FMN (F) в мономірній та дуплексній формах, в 1:1 гетерокомплексі
DAU-FMN і в комплексі з одно- та двонитковій формах тетрамеру ДНК.

Oe

P „ »

$

¤

Ue

O

O

Oe

u

B ? »

???????&?»

$

&

L

&

J

&

F

$

J

AE

J

J

$

J

d?a$

??

$

… …

??

]„”y^„sy

AE

$

AE

O O

„Y†Y?Y Y?Y?YA4444

O O

O O

¦iaaaa

????????????ерерахунку значень хімічних зсувів (5) для кожного протону
DAU і FMN та наступного порівняння розрахункових хімічних зсувів з
експериментальними концентраційними кривими. Різниця між
експериментальними і розрахунковихми кривими в результаті виявилась не
гірше 0.02 млн-1, що свідчить про адекватність запропонованої моделі
трьохкомпонентної суміші (3) експерименту.

Для роз’єднання процесів гетероасоціації вітаміну з ароматичними
молекулами і комплексоутворення вітаміну з ДНК сформульовано критерій
Rd, що дозволяє вказати процес, який дає головний вклад в зменшення
зв’язування БАС з ДНК при додаванні вітаміну:

, (6)

— мольна частка комплексів ліганд-d(TGCA)2 при Kh=0, K2F=0; при Kh(0,
K2F=0; при Kh=0, K2F(0 відповідно. Область Rd>1 свідчить про перевагу
процесу комплексоутворення FMN-ДНК над процесом гетероасоціації
ліганд-FMN (протекторна дія FMN), а о області Rd<1 головний вклад в зменшення частки комплексів ліганд-ДНК вносить процес гетероасоціації (інтерцепторна дія FMN). Для оцінки відсотка витисненого із ДНК ліганду при додаванні FMN запропоновано наступний критерій: , (7) - мольна частка комплексів ліганд-d(TGCA)2 при Kh(0, K2F(0. В подальших розрахунках спільного зв’язування БАС із ДНК у присутності вітаміну FMN використовувались концентрація ліганду D0=0.01ммоль/л, відповідна піковій концентрації антипухлинного антибіотика у плазмі крові людини, різні концентрації ДНК (N0 = 0.01 і 1 ммоль/л) та концентрації FMN, що варіюються у широкому діапазоні від фізіологічних (< 0.1 ммоль/л) до експериментальних (> 0.1 ммоль/л). Як приклад, на
рис.4 представлені розраховані залежності Rd та Ad для досліджуваних
ароматичних молекул при N0=0.01ммоль/л.

Рис.4. Фактори Rd та Ad як функція концентрації FMN при D0=0.01ммоль/л,
N0=0.01ммоль/л.

Вид залежності Rd дозволяє зробити висновок, що у системі FMN-NOV
інтерцепторна дія вітаміну домінує при будь-яких концентраціях FMN, для
інших лігандів у фізіологічному діапазоні концентрацій FMN переважає
протекторна дія вітаміну, що в свою чергу, корелює із значеннями
констант гетероасоціації БАС-FMN (див. табл.1). Фактор Ad має характер
насичення, що свідчить про поступове витиснення молекул БАС із ДНК,
причому відсоток витиснутих молекул при однаковій концентрації FMN тим
більший, чим більша рівноважна константа гетероасоціації БАС-FMN.
Оскільки усі розглянуті у цій роботі ароматичні БАС чинять свою
біологічну дію шляхом комплексоутворення з ядерною ДНК, а критерій Ad –
це відсоток витиснутих молекул БАС із ДНК, то величина Ad є оцінкою
відсотку виживаємості клітини для заданого ліганду у присутності
рибофлавіну.

Подальший аналіз факторів Rd та Ad показав, що у фізіологічному
діапазоні концентрацій FMN залежність Rd / Ad від F0, D0 та N0 мала, що
надало можливість підібрати апроксимуючі вирази (8), які корелюють з
константами гетероасоціації і комплексоутворення:

Rd ~ 1/Kh, Ad ? 100 — K2h/K2D. (8)

Отримані результати і висновки залишаються справедливими при різних
концентраціях ДНК (0.01 і 1 ммоль/л).

Таким чином, вирази (8) фактично встановлюють взаємозв’язок між
фізико-хімічними параметрами – константами рівноваги і біологічним
ефектом, що дає можливість передбачати зміну активності ароматичних
сполук, які містяться в клітинній системі, при додаванні вітаміну В2,
при умові, що основними механізмами дії вітаміну B2 на даний ароматичний
препарат є протекторна (конкуренція за місця посадки на ДНК) та
інтерцепторна (гетероасоціація).

ВИСНОВКИ

Методом 1H ЯМР-спектроскопії вивчена гетероасоціація ароматичних
біологічно активних сполук (БАС): антипухлинних антибіотиків
(дауноміцин, ногаламіцин, актиноміцин D, новатрон), мутагенів
(фенантридиновий барвник бромистий етидій, акридіновий барвник
профлавін та кофеїн) із похідним вітаміну В2 – флавін-мононуклеотидом.
Визначено термодинамічні параметри реакцій асоціації: рівноважну
константу, ентальпію, ентропію та енергію Гібса. Визначено просторові
структури 1:1 гетерокомплексів молекул.

Аналіз даних одно- та двомірної ЯМР-спектроскопії, розрахункових
структур гетерокомплексів і термодинамічних параметрів гетероасоціації
FMN з ароматичними БАС свідчить про утворення стопочних асоціатів
молекул у водному розчині за рахунок вертикальних стекінг-взаємодій
хромофорів.

Показано, що гетерокомплекси FMN із NOV, EB, PF можуть додатково
стабілізуватися у розчині міжмолекулярним водневим зв’язком.

Аналіз параметрів гетероасоціації FMN з CAF та отримана структура
комплексу дозволяють припустити, що комплексоутворення у системі FMN-CAF
є важливим фактором підвищення розчинності вітаміну у присутності
кофеїну. Суттєво більша ефективність солюбілізуючої дії кофеїну у
порівнянні з нікотинамідом на малорозчинні БАС в однакових умовах
розчинника корелює з визначеною у дисертаційній роботі рівноважною
константою гетероасоціації.

Визначені рівноважні константи комплексоутворення FMN із тетрамером ДНК.
Аналіз параметрів комплексоутворення свідчить про переважно
інтеркаляційний тип зв’язування вітаміну із дуплексною формою d(TGCA) у
водному розчині, причому процес комплексоутворення має
антикооперативный характер.

Запропонована фізична модель зв’язування ароматичного ліганду з ядерною
ДНК у присутності вітаміну В2. Основу моделі складає уявлення про
зв’язування ліганду із вільними від білків частками ядерної ДНК.

На прикладі трикомпонентної системи FMN-DAU-ДНК експериментально
показана можливість використання рівноважних параметрів, отриманих на
підставі дослідження одно- та двокомпонентних розчинів, для аналізу
зв’язування ароматичних сполук із ДНК у водному розчині у присутності
ароматичного вітаміну.

Введено поняття інтерцепторного та протекторного механізмів дії вітаміну
В2 на зниження ступеню зв’язування ароматичного ліганду із ДНК.
Сформульовано критерій, який дозволяє розділити процеси гетероасоціації
вітаміну із досліджуваними ароматичними молекулами та комплексоутворення
вітаміну із ДНК.

Показано, що в певних умовах інтерцепторний, або протекторний механізми
домінують у системі, що має однозначну кореляцію із рівноважною
константою гетероасоціації ліганд — вітамін. Знайдені емпіричні
співвідношення, які дозволяють розрахувати відношення
інтерцепторної/протекторної дії вітаміну, а також частку ліганду,
витиснутого із ДНК при додаванні вітаміну, як функцію рівноважних
констант гетероасоціації і комплексоутворення ліганду з ДНК.

Вважаючи, що основними механізмами дії вітаміну B2 на даний ароматичний
препарат є протекторна (конкуренція за місця посадки на ДНК) та
інтерцепторна (гетероасоціація), то результати виконаної роботи
дозволяють завбачувати відносне зниження токсичності ліганду у
присутності вітаміну та вказати домінуючий молекулярний процес,
відповідаючий за цю зміну активності препарату.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Lantushenko A.O., Veselkov K.A., Mukhina Y.V., Davies D.B., Veselkov
A.N. 1H NMR analysis of complexation of hydrotropic agents nicotinamide
and caffeine with aromatic biologically active molecules in aqueous
solution // Proc. of SPIE. — 2004. — Vol.5507. — P. 178-183.

Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Эрнандес Сантьяго А.А., Веселков
К.А., Рогова О.В., Мухина Ю.В., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Анализ
ассоциации кофеина с флавин-мононуклеотидом по данным ПМР-спектров в
водном растворе // Журнал Физ. химии. – 2005. — Т. 79, № 4. — С.
673-679.

Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Дэвис
Д.Б. Структурный и термодинамический анализ гетероассоциации молекул
новатрона и флавин-мононуклеотида в водном растворе методом 1Н
ЯМР–спектроскопии // Биоорганическая химия. — 2005. — Т. 31, №5. — С.
503-510.

Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Рыбакова
К.А., Дэвис Д.Б. Анализ комплексообразования ароматических молекул
антибиотика и витамина в водном растворе методом 1Н ЯМР–спектроскопии:
гетероассоциация актиномицина D и флавин-мононуклеотида // Биофизика. —
2005. — Т. 50, Вып.1. — С. 20-27.

Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Зубченок О.В., Мухина Ю.В., Дэвис
Д.Б., Веселков А.Н. 1Н ЯМР анализ гетероассоциации антиопухолевых
антибиотиков дауномицина и актиномицина D в водном растворе //
Журн.органич.химии. — 2005. — Т. 41, №8. — С. 1180-1186.

Мухина Ю.В., Евстигнеев М.П. Связывание ароматических лигандов с ДНК в
присутствии витамина // Вестник СевГТУ (серия “Физика и математика”). —
2005. — T. 70. — С. 62-73.

Evstigneev M.P., Mukhina Y.V., Davies D.B. Complexation of daunomycin
with a DNA oligomer in the presence of an aromatic vitamin (B2)
determined by NMR spectroscopy // Biophys.Chem. – 2005. — Vol.118. — P.
118-127.

Evstigneev M.P., Mukhina Y.V., Davies D.B. 1H NMR study of the
hetero-association of flavin-mononucleotide with mutagenic dyes:
ethidium bromide and proflavine // Molecular Physics. – 2006. — Vol.104,
№ 4. — P. 647-654.

Lantushenko A.O., Veselkov K.A., Mukhina Y.V., Davies D.B., Veselkov
A.N. 1H NMR analysis of self-association of hydrotropic agent
nicotinamide and its complexation with riboflavine-mononucleotide in
aqueous solution // Proc. International School-Seminar «Spectroscopy of
molecules and crystals». XVI. — Sevastopol (Ukraine). — 2003. — С. 223.

Lantushenko A.O., Mukhina Y.V., Veselkov D.A., Davies D.B., Veselkov
A.N. 1H NMR investigation of the complexation of hydrotropic agents
(e.g. nicotinamidе and caffeine) with aromatic drugs in aqueous solution
// Proc. International Meeting on NMR spectroscopy. XVI. – Cambridge
(England). — 2003. — Р. 2.12.

Мухина Ю.В., Веселков А.Н. Молекулярный механизм солюбилизирующего
действия гидротропных агентов на биологически активные ароматические
соединения в водном растворе // Труды 5-й международной
междисциплинарной научно-практической конференции “Современные проблемы
науки и образования”. – Алушта (Украина). — 2004. — С. 22.

Rozvadovskaya A.O., Evstigneev M.P., Chubarov A.S., Mukhina Y.V.,
Veselkov A.N. Molecular mechanism of the complexation of aromatic
biologically active compounds (antibiotics and vitamins) in aqueous
solution: 1H NMR analysis // Proc. International young scientists’
conference on applied physics. IV. — Kyiv (Ukraine). — 2004. – Р. 179.

Мухина Ю.В., Веселков А.Н. 1Н ЯМР анализ взаимодействия гидротропных
агентов с флавин-мононуклеотидом в водном растворе // Труды 1 Украинской
научной конференции “Проблемы биологической и медицинской физики”. –
Харьков (Украина). — 2004. – С. 84.

Davies D.B., Mukhina Y.V., Evstigneev M.P. 1H NMR study of the
hetero-association of mutagenic dyes, ethidium bromide and proflavine,
with flavin-mononucleotide // Труды III Международной конференции по
новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов
для изучения окружающей среды. — Ростов-на-Дону (Россия). – 2005. – С.
161.

Мухина Ю.В. Анализ взаимодействия антибиотика дауномицина с олигомером
ДНК в присутствии флавин-мононуклеотида в водном растворе // Труды
Всеукраинской научно-технической конференции студентов, аспирантов и
молодых ученых «Физика. Биофизика — 2005». — Севастополь (Украина). —
2005. — С. 72-73.

Барановский С.Ф., Мухина Ю.В., Евстигнеев М.П. Анализ взаимодействия
флавин-мононуклеотида с дезокситетрануклеотидом 5′-d(TpGpCpA) в водном
растворе по данным 1Н ЯМР–спектроскопии // Труды Всеукраинской
научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Физика. Биофизика — 2005». — Севастополь (Украина). — 2005. — С. 74-75.

Mukhina Y.V., Evstigneev M.P. Interactions of flavin-mononucleotide with
aromatic mutagens in aqueous solution // Proc. International Conference
‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’. III. — Kyiv (Ukraine). —
2005. — Р. 36.

Davies D.B., Evstigneev M.P., Mukhina Y.V., Djimant L.N. Non-covalent
interactions of flavine-mononucleotide with aromatic drug molecules
studied by NMR // Proc. International School-Seminar “Spectroscopy of
Molecules and Crystals”. XVII. – Beregove (Ukraine). — 2005. — P.
267-268.

Мухина Ю.В., Евстигнеев М.П. Нековалентные взаимодействия производного
витамина В2 флавин-мононуклеотида с биологически активными
ароматическими веществами и ДНК // Труды Второй всеукраинской
научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Физика. Биофизика — 2006». – Севастополь (Украина). — 2006. — С.76-78.

АНОТАЦІЯ

Мухіна Ю.В. Нековалентні взаємодії флавін-мононуклеотиду із біологічно
активними ароматичними речовинами та ДНК. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних
наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Севастопольський
національний технічний університет, м. Севастополь, 2006.

Вивчено молекулярні механізми взаємодії флавін-мононуклеотиду із
ароматичними БАC — антипухлинними антибіотиками і мутагенами, а також
спільне зв’язування БАC з ДНК у присутності вітаміну у водному розчині.
Для визначення параметрів комплексів використані методи одно- та
двомірної спектроскопії ЯМР (500 МГц). Методом молекулярної механіки з
використанням програми X-PLOR та результатів аналізу двомірних ЯМР
спектрів визначені найбільш імовірні просторові структури
гетерокомплексів.

Показано, що ароматичні молекули вітаміну та антибіотиків/мутагенів
можуть утворювати енергетично міцні гетероасоціати у водному розчині,
які стабілізуються, в основному, за рахунок стекінг-взаємодії хромофорів
сполук, при цьому в деяких системах імовірно утворення Н-зв’язку.
Проведено порівняльний аналіз взаємодії гідротропних агентів (кофеїн і
нікотинамід) з вітаміном. Вивчено комплексоутворення
флавін-мононуклеотиду з 5’-d(TpGpCpA). Запропонована модель аналізу
спільного зв’язування двох лігандів із ДНК; сформульовано критерій, що
дозволяє вказати переважаючий процес, який дає вклад в зменшення
зв’язування БАС з ДНК. Введено поняття інтерцепторного і протекторного
механізмів дії FMN, та показано, що у трикомпонентній суміші
Вітамін-БАС-ДНК існує потенційна можливість зниження токсичності
лікарських препаратів при їх комбінованому використанні із вітаміном В2.

Ключові слова: антипухлинний антибіотик, мутаген, флавін-мононуклеотид,
водневий зв’язок, гетероасоціація, комплексоутворення, конкурентне
зв’язування, ЯМР-спектроскопія.

АННОТАЦИЯ

Мухина Ю.В. Нековалентные взаимодействия флавин-мононуклеотида с
биологически активными ароматическими веществами и ДНК. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических
наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Севастопольский
национальный технический университет, г. Севастополь, 2006.

Изучены молекулярные механизмы взаимодействия флавин-мононуклеотида с
ароматическими БАС — антиопухолевыми антибиотиками и мутагенами, а также
совместного связывания БАС с ДНК в присутствии витамина в водном
растворе. Для определения параметров комплексов использованы методы
одно- и двумерной спектроскопии ЯМР (500 МГц). Методом молекулярной
механики с использованием программы X-PLOR и результатов анализа
двумерных ЯМР спектров определены наиболее вероятные пространственные
структуры гетерокомплексов.

Показано, что ароматические молекулы витамина и БАС могут образовывать
энергетически прочные гетероассоциаты, которые стабилизованы, в
основном, за счет стэкинг-взаимодействий хромофоров соединений, при этом
в некоторых системах возможно образование Н-связи. Проведен
сравнительный анализ взаимодействия гидротропных агентов (кофеина и
никотинамида) с витамином. Исследовано комплексообразование FMN с
5’-d(TpGpCpA). Предложена модель анализа совместного связывания двух
лигандов с ДНК; сформулирован критерий, позволяющий указать
превалирующий процесс, дающий вклад в уменьшение связывания БАС с ДНК.
Введено понятие интерцепторного и протекторного механизмов действия FMN
и показано, что в трехкомпонентной смеси Витамин-БАС-ДНК существует
потенциальная возможность снижения токсичности лекарственных препаратов
при их комбинированном использовании с витамином В2.

Ключевые слова: антиопухолевый антибиотик, мутаген,
флавин-мононуклеотид, водородная связь, гетероассоциация, конкурентное
связывание, комплексообразование, ЯМР-спектроскопия.

SUMMARY

Mukhina Y.V. Non-covalent interactions of flavin-mononucleotide with
biologically active aromatic compounds and DNA. – Manuscript.

Thesis for a Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in
Biophysics — Speciality 03.00.02, Sevastopol National Technical
University, Sevastopol, 2006.

Molecular mechanisms of interactions of Vitamin B2 derivative,
Flavin-mononucleotide, with aromatic biologically active compounds (BAC)
— antitumour antibiotics (daunomycin, nogalamycin, actinomycin D,
novatrone) and mutagenic dyes (ethidium bromide, proflavine, caffeine) —
and the mechanisms of their complexation with DNA in the presence of
FMN in aqueous solution have been investigated. Experimental NMR data
(1D- and 2D-NMR-spectroscopy, 500 MHz), have been used for determination
of the structural and thermodynamical parameters of molecular complexes
in aqueous solution. The most favourable spatial structures of the
hetero-complexes have been calculated using both the molecular mechanics
methods (X-PLOR software), analysis of 2D ROESY spectra and of the
induced proton chemical shifts of the interacting molecules.

The thermodynamical parameters (equilibrium reaction constants,
enthalpy, entropy) and the limiting values of proton chemical shifts of
the BAC-FMN hetero-association have been determined from the
experimental concentration and temperature dependences of proton
chemical shifts of the aromatic molecules, using a general model of
indefinite molecular hetero-association in solution. 2D ROESY spectra of
investigated molecular systems, exhibit intermolecular ROE contacts
between protons of PF/EB/NOV and FMN. These results provide evidence of
the intermolecular stacking of the planes of the chromophores in the 1:1
PF-FMN, EB-FMN and NOV-FMN hetero-complexes, with aromatic rings of the
drugs overlapping the rings of FMN chromophore. The obtained results
enabled to conclude that aromatic molecules of the vitamin
flavin-mononucleotide can form energetically favourable hetero-complexes
with aromatic antitumour antibiotics/mutagens in aqueous solution, which
are mainly stabilized by stacking interactions, including both
dispersive and hydrophobic interactions of aromatic chromophores. It is
likely that there is additional stabilization of FMN-NOV/EB/PF
hetero-complexes by intermolecular hydrogen bonds. A known antimutagenic
action of FMN and an effective intermolecular association between the
vitamin and the ligands studied enabled to propose that a toxicity of
BAC may be altered in the presence of FMN.

Comparative analysis of the thermodynamical parameters of interaction of
hydrotropic agents (caffeine, nicotinamide) with flavin-mononucleotide
has been carried out; the relative content of each of the associated
complexes have been calculated in the mixed solution. The results have
shown that the relative content of the hetero-complexes is being
increased upon addition of hydrotropic agent. It was concluded that the
formation of stacked heterocomplexes of FMN with hydrotropic agents
plays an important role in the effect of solubilization of poor soluble
drugs. Caffeine exhibits greater solubilizing power than nicotinamide in
aqueous solution which correlates with the calculated magnitude of the
hetero-association constant found in this work.

Deoxytetranucleotide d(TGCA) was chosen as a model DNA sequence,
representing free from proteins regions of cellular DNA, in order to
study the simultaneous binding of two drugs with nuclear DNA. The
complexation of vitamin B2 with d(TGCA) has been investigated by means
of 1H NMR spectroscopy in order to get the thermodynamical parameters of
FMN-DNA interactions. Analysis of the obtained equilibrium parameters
clearly demonstrates a predominant role of FMN binding with the duplex
form of d(TGCA) in solution featuring strongly anticooperative character
of the complexation process.

A model for the competitive binding assay (three-component mixture) has
been developed. Physical adequacy of utilizing the reaction scheme for
analysis of the three-component mixture have been verified. A
discrepancy between the experimental and calculated curves was not worse
than 0.02ppm which indicates the adequacy of the reaction scheme. A
criterion for the discrimination between the hetero-association BAC-FMN
and FMN-DNA complexation has been formulated and applied for analysis of
the simultaneous binding of the antibiotic/mutagen and the vitamin with
DNA. It was shown that both Rd and Ad values remains practically
unchanged with respect to any variation of BAC, FMN and DNA in
micromolar range of FMN concentrations and may be described by empirical
equations, including the effectiveness of the hetero-association Kh and
of the DNA complexation K2D. It has been shown that in the
three-component mixture Vitamin-Antibiotic/Mutagen-DNA there is a
potential possibility for a directed regulation of the toxicity of the
aromatic drugs by the vitamin during a combination therapy.

Key words: antitumour antibiotic, mutagen, flavin-mononucleotide,
hydrogen bonding, hetero-association, complexation, competitive binding,
NMR-spectroscopy.

Наукове видання

МУХІНА Юлія Вікторівна

“Нековалентні взаємодії флавін-мононуклеотиду із біологічно активними
ароматичними речовинами та ДНК”

Підписано у друк 30.08.2006 р. Формат 60×90 1/16

Друк офсетний. Умов.друк.арк. 1.0.

Тираж 100 екз. Замовлення № 32

Видавництво “СевНТУ”, Севастополь, 53, Стрілецька бухта, Студмістечко,
НМЦ

PAGE 3

(3)

(4)

(5)

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *