.

Морфогенез серця при ураженні нервового гребеня етанолом та ретиноє-вою кислотою (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
122 5321
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНий МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

Машталір Марина Анатоліївна

УДК 611.12:611.012-02:547.262]-092.9

Морфогенез серця при ураженні нервового гребеня етанолом та ретиноєвою
кислотою

14.03.01 – нормальна анатомія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровський державній медичній академії МОЗ
України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Козлов Володимир
Олексійович, Заслужений діяч науки і техніки України, Дніпропетровська
державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри анатомії
людини.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Масловський Сергій Юрійович, Харківський
державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри
гістології, цитології та ембріології;

доктор медичних наук, професор Гунас Ігор Валерійович, Вінницький
національний медичний університет ім. М.І.Пирогова МОЗ України, директор
науково-дослідного центру;

доктор медичних наук, професор Антипов Микола Васильович, Донецький
державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри анатомії
людини.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця
МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист відбудеться “28” вересня 2006 р. об 11.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному
медичному університеті (61022, м. Харків-22, пр. Правди, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного
медичного університету (61022, м. Харьків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий “22” серпня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, професор
Терещенко А.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За даними наукової медичної інформації, вади розвитку
серця і судин складають одну з найбільших груп уроджених дефектів у
людей: їх виявляють у 1% усіх живих немовлят, а частота серед
мертвонароджених у 10 разів вище (Козлов В.О., Дзяк В.Г., 2006).
Фундаментальні дослідження нормального та аномального розвитку серця
лежать в основі сучасної теоретичної кардіології (Антипов А.Н., Антипов
Н.В., Синев А.Ф., 2002; Кирьякулов Г.С. и др., 2003; Yelbuz et al.,
2004; Gittenberger-de Groot A.C.et al., 2005) та її прикладних аспектів
(Чередник С.А. и др., 2001; Гунас И.В., Козлов С.В., 2005; Антипов В.Н.
и др., 2006; Козлов В.О., Дзяк В.Г., 2006). Розуміння механізмів
нормального кардіогенезу та виникнення вад серця є важливим для розробки
методів їх корекції (Антипов В.Н. и др., 2006; Anderson R.H., 2004).
Більшість уроджених вад є наслідком складної взаємодії генетичних
факторів і зовнішніх шкідливих агентів (Шевчук Ю.Г, 2000; Новикова И.В.,
2004). Важливе місце серед тератогенів належить алкоголю та похідним
вітаміну А, зокрема ретиноєвій кислоті (РК) (Yan M. et al., 2000; Ogawa
T., 2005). Серцеві аномалії поєднуються також з багатьма генетичними
синдромами, які пов’язані з ураженням клітин нервового гребеня (НГ)
(Hutson M.R., Kirby M.L., 2003). Схожість спектру вад розвитку серця, що
виникають при видаленні НГ у курячих зародків та після впливу хімічних
тератогенів, призвела до формування концепції про первинне ураження НГ
після дії хімічних чинників (Hutson M.R., Kirby M.L., 2003). В
експериментальних моделях був встановлений тісний зв’язок між строками
впливу тератогенів та спектром і тяжкістю вад розвитку серця, що
пов’язано саме з етапами формування та міграції НГ ( HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=8749810&query_hl=1&itool=pubmed_DocSum”
Cartwright M.M., Smith S.M. , 1995; Kirby M.L. et al., 2003).

Механізми формування уроджених вад серця є областю досліджень, де існує
розрив між знаннями про молекулярно-біологічні реакції та статистичними
даними про розподіл і спектр аномалій у різних експериментальних
моделях. Власне ж морфогенетичні шляхи і конкретні механізми формування
вад на органному і тканинному рівнях залишаються до цього часу мало
вивченими. Зокрема, широко відома тератогенна дія етанолу та РК на
розвиток серцево-судинної системи у зародків різних тварин вивчена лише
у відношенні різноманітності викликуваних порушень (Bouman H.G. et al.,
1998; Ogawa T., 2005), але практично відсутні дані про те, як саме
формуються вади розвитку серця при дії цих речовин і наскільки подібні
механізми порушень спостерігаються в інших моделях.

У теперішній час посилюється значення морфологічних досліджень для
пренатальної діагностики вад серця у людини (Самохвалова А.В., Школьник
О.С., Коренюк Ю.А., 1999). Безпосереднє спостереження за розвитком вад у
людини неможливо, проте за допомогою індукованих експериментальних
моделей стає можливим аналіз морфогенетичних змін у серці при формуванні
вад розвитку серця, пов’язаних з ураженням НГ: дефекту міжшлуночкової
перегородки (ДМШП), декстрапозиції аорти (ДА), подвійного випускника
правого шлуночка (ПВПШ) та інших серцевих вад.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Тема дисертації і основні напрямки її виконання обговорені та
затверджені Проблемною комісією МОЗ і АМН України “Морфологія людини”
(протокол 01/1733 від 22 травня 2002) і Вченою радою Дніпропетровської
державної медичної академії (протокол № 5 від 26 грудня 2002 року).
Дисертація виконана у відповідності з планом наукових досліджень
Дніпропетровської державної медичної академії і є складовою частиною
ініціативної планової науково-дослідної роботи кафедри нормальної
анатомії людини: “Розвиток і становлення серця, його судин,
папілярно-трабекулярного і клапанного апарата в онто- і філогенезі” (№
державної реєстрації 0101U000777). Здобувач є виконавцем складової
частини вказаної науково-дослідної роботи стосовно аномального
кардіогенезу.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є з’ясування механізмів
морфогенезу вад розвитку серця, обумовлених дією етанолу та РК.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:

Вивчити морфогенетичні зміни, що відбуваються в серці зародків курки та
миші на ранніх стадіях кардіогенезу у нормі, після дії етанолу та РК.

Встановити основні морфогенетичні зміни, що відбуваються в серці курячих
та мишачих зародків протягом періоду формування перегородок у нормі та
після впливу тератогенів.

Встановити спектр вад серця у курячих та мишачих зародків після впливу
тератогенів на стадіях розвитку, що відповідають закінченню септації
серця.

Визначити механізми нормального та аномального розвитку серця, що
перебігають за участю НГ.

Провести зіставлення механізмів нормального морфогенезу серця
експериментальних тварин з механізмами нормального кардіогенезу у
людини.

Об’єкт дослідження – серце людини, миші та курки у нормі, серце миші та
курки після дії етанолу та РК на етапах кардіогенезу.

Предмет дослідження – морфо- та гістогенетичні механізми нормального та
аномального розвитку серця.

Методи дослідження: анатомічні – для макроскопічного дослідження серця
та дослідження зовнішньої будови серця зародків з використанням
світлової мікроскопії; гістологічні – для аналізу стану камер та
перегородок серця, вад розвитку; гістохімічні – для оцінки стану
позаклітинного матриксу, лектингістохімічні – для оцінки стану
рецепторів лектинів у складі клітинних мембран; електронно-мікроскопічні
– для вивчення ультраструктури клітин; морфометричні – для кількісної
оцінки окремих структур серця, стереологічні – для визначення питомого
об’єму субклітинних структур, біометричні – для визначення об’єму
вибірки, статистичні – для аналізу і інтерпретації отриманих
результатів, тривимірна реконструкція та комп’ютерне тривимірне
моделювання – для створення просторових моделей структур серця.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначені морфологічні
феномени, що свідчать про участь НГ у моделях аномального тератогенеза з
використанням етанолу та РК. За допомогою світлооптичних, гістохімічних
та лектингістохімічних досліджень вивчені та структурно описані
морфогенетичні процеси, що призводять до формування вад серця в
експериментальних моделях з використанням етанолу та РК, що грунтуються
на ураженні НГ. Отримані нові дані про основні структурні зміни в різних
відділах серця – передсердях та шлуночках, міжшлуночковій і
міжпередсердній перегородках, атріо-вентрикулярному (АВ) каналі,
конусно-стовбуровому відділі (КСВ) та клапанах серця – при формуванні
вад розвитку серця в моделях, що відтворюють ураження НГ. Уперше
зіставлені за системою споріднених параметрів механізми аномального
морфогенезу в різних моделях. Проведена тривимірна реконструкція
нормально та аномально розвинутих ділянок серця зародків курки та миші;
отримані просторові уявлення про етапи формування різних вад серця, що
викликані ушкодженням НГ. Проведені зіставлення нормального кардіогенезу
серця експериментальних тварин і людини. Уточнено дані щодо нормального
й аномального морфогенезу критичних областей серця, відповідальних за
формування вад, – КСВ, його перегородок, АВ подушок, міжпередсердної
(МПП) і міжшлуночкової (МШП) перегородок, а також отримані нові дані
щодо їхнього внеску до аномального морфогенезу серця. Вперше визначені
механізми аномального розвитку серця після дії етанолу та РК, які
пов’язані з похідними НГ.

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що отримані
результати сприяють розширенню уявлень про основні принципи та конкретні
механізми формування вад розвитку серця після впливу хімічних
тератогенів. Результати дослідження дозволяють прогнозувати появу і тип
уроджених вад розвитку серця у людини при дії таких факторів, як етанол
і похідні вітаміну А, а також взагалі речовин, що обумовлюють ураження
НГ. З’ясування деталей морфогенетичних перебудов серця при формуванні
уроджених вад у експериментальних тварин певною мірою можуть
використовуватися у формуванні уявлень про аномальний морфогенез серця
людини. Отримані дані про морфологічні зміни в критичних ділянках серця
при уроджених аномаліях дозволять скласти уявлення про
морфофункціональні характеристики серцевої стінки відділів серця при
певних вадах у людини. Дані про механізми формування вад є також
важливою умовою для розробки основ профілактичних і коригуючих заходів у
гінекологічній практиці у тому випадку, якщо в пренатальному періоді
відбувався вплив певного тератогенного фактора.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджені у наукову роботу та
навчальний процес науково-дослідного центру та кафедри нормальної
анатомії Вінницького національного медичного університету ім.
М.І.Пирогова, кафедри нормальної анатомії і кафедри гістології,
цитології та ембріології Луганського державного медичного університету,
Харківського державного медичного університету, Івано-Франківського
державного медичного університету, Тернопільського державного медичного
університету ім. І.Я.Горбачевського, Кримського державного медичного
університету ім. С.І.Георгієвського, кафедри гістології, цитології та
ембріології Львівського національного медичного університету ім. Данила
Галицького, Української медичної стоматологічної академії, кафедри
анатомії та гістології Ужгородського національного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно виконаний
патентно-інформаційний пошук, визначені мета та задачі дослідження.
Аналіз наукової літератури, забір матеріалу, всі морфологічні та
гістохімічні дослідження, морфометричний та статистичний аналіз,
тривимірне моделювання, розділи дисертаційної роботи, їх обговорення та
узагальнення, формулювання висновків та оформлення дисертації виконані
автором самостійно. Основною є участь автора в підготуванні статей до
опублікування, а також наукових розробок для оформлення деклараційних
патентів України (у співавторстві). В актах впровадження наводяться
дані, що особисто отримані автором у процесі виконання роботи. Автором
не були використані результати виконаної нею кандидатської дисертації та
ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дослідження. Результати дослідження доповідались
на III Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та
топографоанатомів України (Київ, 2002), міжнародній конференції “Саміт
нормальних анатомів України та Росії” (Тернопіль, 2003),
науково-практичній конференції морфологів “Роль імунної, ендокринної та
нервової систем у процесах морфогенезу та регенерації” (Запоріжжя,
2003), III Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та
клінічної біохімії (Львів, 2004), на засіданнях Дніпропетровського
обласного відділення Товариства АГЕТ України (2004, 2005, 2006), на I,
II та III Всеукраїнських наукових морфологічних конференціях “Карповські
читання” (Дніпропетровськ, 2004, 2005, 2006), науково-практичній
конференції „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при
моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 39 наукових праць,
серед яких 22 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК
України (18 статей опубліковано без співавторів), 1 праця представлена
як розділ монографії (у співавторстві), 1 оглядова стаття у фаховому
журналі, 1 стаття у науковому збірнику та 10 робіт опубліковано у
матеріалах наукових конгресів і конференцій. За результатами
дисертаційної роботи отримано 4 деклараційних патенти України на винахід
(№59108, №59109, №60079, №68595).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 361
сторінці машинописного тексту, з котрих власне тексту 282 сторінки.
Робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та
методи досліджень, результати досліджень (3 розділи), аналіз та
узагальнення результатів досліджень, висновки, рекомендації щодо
практичного використання, список використаної літератури. Дисертаційна
робота проілюстрована 137 рисунками (обсяг 22 сторінки) та 90 таблицями
(обсяг 30 сторінок). Список використаних першоджерел літератури
складається з 270 найменувань (96 робіт – кирилицею, 174 – латиницею).

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом для даного дослідження були
серця трьох об’єктів: курей породи білий леггорн, білих безпородних
мишей та людини. Досліджено 557 ембріонів курки від 29 годин інкубації
до 8 доби інкубаційного розвитку (з них 85 – у нормі, 192 – після дії
етанолу, 280 – після дії РК); 698 ембріонів миші від 9 до 14 доби
ембріогенезу (з них 193 – у нормі, 243 – після дії етанолу, 262 – після
дії РК); 45 ембріонів і плодів людини від 4 до 10 тижня пренатального
розвитку. Усього було досліджено 1300 об’єктів. Комісією з біоетики
Дніпропетровської державної медичної академії (протокол № 7 від
27.04.06) встановлено, що проведені наукові дослідження зародків
експериментальних тварин та фрагментів зародків та плодів людини
відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України № 231 від
01.11.2000 року.

У роботі використано 5 основних моделей. Для з’ясування порушень у
формуванні серця курячих зародків використовували модель, яка поєднує
вплив на клітини НГ до початку їх міграції у серце та викликає спектр
вад серця, близький до того, що спостерігається після видалення НГ (
HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=8749810&query_hl=1&itool=pubmed_DocSum”
Cartwright M.M., Smith S.M. , 1995). Для цього 0,2-0,25 мл 50% етанолу
на 72 годині інкубації (Fang T.T. et al., 1987) вводили у повітряну
камеру курячих яєць. При використанні цієї моделі концентрація етанолу
залишається високою в альбуміні курячого яйця протягом однієї доби після
введення та наближається до рівня, що спостерігається після алкогольної
інтоксикації у людини (Bruyere H.J., 1994). Для вивчення порушень у
формуванні серця курячих зародків після дії РК використовували 2 моделі
з різним терміном введення. Перша модель була обрана для з’ясування
порушень у кардіогенезі при дії РК до початку міграції НГ від місця
первинного формування біля нервової трубки. Для цього 0,5 мкг повного
трансізомеру РК (Sigma Co, США) у 0,01 мл 2 % розчину диметилсульфоксиду
наносили безпосередньо на зародкову ділянку (Osmond M.K. et al., 1991).
У другій моделі було враховано три моменти: 1) введення РК здійснювали
до початку міграції клітин НГ серце; 2) спектр очікуваних вад наближався
до тих, що найчастіше спостерігаються у новонароджених дітей та 3) в
експерименті на курячих зародках з видаленням НГ (Sinning A., 1998). У
цій моделі 1 мкг РК у 0,01 мл 2% диметилсульфоксиду наносили на зародок
на стадії 15 за НН (Bouman H.G. et al., 1998). Вивчення впливу етанолу
на мишачих зародків проводили на 8,5 добі вагітності, тобто до початку
міграції клітин у серце (Amini S.A. et al., 1996). У даній моделі 25%
розчин етанолу вводився вагітній самиці одноразово інтраперітонеально у
дозі 0,03 мл/г ваги (Daft P.A. et al., 1986). Обробка мишачих зародків
РК проводилась таким чином: вагітним самицям одноразово
інтраперітонеально вводили РК у дозі 70 мг/г ваги у 0,1 мл 2%
диметилсульфоксиду на 8,5 добі вагітності (Yasui H. et al., 1999).

Для морфологічної оцінки впливу тератогенів був використаний комплекс
методів анатомічного, гістологічного, гістохімічного,
лектингістохімічного, ультраструктурного, морфометричного і
стереологічного аналізу, а також просторова реконструкція та комп’ютерне
тривимірне моделювання компонентів серця вивчених об’єктів.

Яйця курей породи білий леггорн інкубували при 38(С та за відносної
вологості 80%. Стандартизація термінів розвитку ембріонів здійснювалася
за допомогою стандартних таблиць нормального розвитку за Hamburger і
Hamilton (НН). Макроскопічне дослідження проводилося для встановлення
стадії розвитку, дослідження зовнішньої форми зародків для встановлення
вад розвитку кінцівок, головної та тулубової частин зародків.
Дослідження зовнішньої форми серця щойно вилучених зародків, після
фіксації рідиною Буену та після тотального забарвлення на сульфатовані
глікозаміноглікани (ГАГ) (Pei-Rong W. et al., 1998), проводили при
світлі, що падає, та при світлі, що проникає.

Для більш детальної оцінки формування вад серця у курячих зародків на 4
та 5 добу розвитку у нормі та після дії тератогенів при макроскопічному
дослідженні визначали: 1) відстань між фіксованими кінцями (передсердям
та КСВ); 2) розташування шлуночкової області відносно передсердь; 3)
орієнтацію правої частини шлуночкової петлі з урахуванням
конусно-шлуночкового кута, який кількісно відображає ступінь аномальних
процесів (Manner J. et al., 1993).

Тотальне фарбування зародків гематоксиліном та виготовлення тотальних
препаратів проводили після вилучення курячих зародків на 29, 30, 36, 42
години у нормі та на 36, 42 годинах після впливу РК і фіксації у рідині
Буена. Тотальне фарбування курячих зародків на сульфатовані ГАГ
здійснювали після вилучення зародків на 4 та 5 добу інкубації і фіксації
їх 4% параформальдегідом. Протягом 2 діб ембріони забарвлювали розчином
альцианового блакитного 8GX при кімнатній температурі.

Виготовлення серійних гістологічних зрізів, світлова мікроскопія
(фарбування гематоксиліном-еозином, залізним гематоксиліном за
Гейденгайном), виготовлення гістотопографічних зрізів використовувалась
для курячих зародків до 8 доби інкубації, для мишачих – до 14 доби
розвитку. Визначення типу вад серця проводилось на 8 добу інкубації
курячих зародків та на 14 добу вагітності мишей на поперечних та
сагітальних гістологічних зрізах. Ці терміни відповідають завершенню
септації серця із закриттям міжшлуночкового отвору (МШО). Ізольований
ДМШО визначали при наявності сполучання правого та лівого шлуночків (ПШ,
ЛШ) при нормальному розташуванні аорти та легеневого стовбуру (ЛС). Зсув
аорти – ДА – констатували в тому випадку, коли вона знаходилася частково
над лівим, а частково – над правим шлуночком. ПВПШ визначався як
відходження двох випускних судин (аорти та ЛС) із правого шлуночка.
Повна транспозиція магістральних судин (ПТМС) визначалася при
відходженні аорти від ПШ, а ЛС від ЛШ. Вилучені ембріони фіксували
рідиною Буена, Карнуа або 10% нейтральним формаліном та заливали у
парафін чи парапласт за загальноприйнятими методиками. Гістологічні та
гістотопографічні зрізи виготовлялися завтовшки від 5 мкм до 7 мкм.
Гістотопографічні зрізи демонстрували не тільки будову серцевих
компонентів, а й також топографію відділів серця та великих судин, що
виходять з серця, а також топографію щільної мезенхіми, що має
походження з НГ, у зябрових дугах та навколо зябрових судин.

Визначення вуглеводних компонентів протеогліканів проводили з
використанням альцианового блакитного 8GX за Стідменом. Нейтральні
компоненти протеогліканів визначали як ШИК-позитивні субстрати реакцією
за Мак-Манусом у викладенні Luppa Н. (1980).

Для вивчення вуглеводної специфічності клітинних мембран в серці
зародків вивчали розподілення рецепторів до лектинів зав’язей пшениці
(WGA), насіння сочевиці (LCA), кори бобівника (LAL), гороху (PSA),
картоплі (STA), ікри окуня (PFA), сої (SBA), арахісу (PNA), рицини
звичайної (RCAI), кори бузини чорної (SNA). Підготовку зрізів та етапи
реакції проводили за рекомендаціями Луцика О.Д. з співавт. (1987, 1989).

Для вивчення тонких структур (кардіоміоцитів (КМ), мезенхімних клітин,
ендотеліального вистелення, процесу епітеліо-мезенхімної трансформації
(ЕМТ), кардіогелю) та проведення кількісного морфологічного аналізу
використовували ультратонкі зрізи. Виготовлення зрізів проводили на
ультрамікротомі УМТП-5 з блоків, залитих в епон-аралдіт або ловікрил.
Дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМВ-100Б при
прискорюючій напрузі 75 кВ і первинних збільшеннях від 2000 до 25000. У
цілому, електронно-мікроскопічне дослідження проводили за схемою,
запропонованої Карупу В.Я. (1984). Оцінку ультраструктурних змін у серці
вивчених об’єктів проводили за оригінальними методиками (Деклараційні
патенти України № 59108, № 59109, № 60079).

Проведення тривимірного моделювання ділянок серця проводили за
оригінальною методикою (Деклараційний патент України № 68592) після
фотографування з подальшою комп’ютерною обробкою зображень з
використанням комп’ютерного пакету програм „Align”, „Trace” та “3ds max
5”. Виготовлення пластикових моделей для просторової реконструкції
виконували після зарисовки 25-30 серійних зрізів.

При проведенні кількісного морфологічного дослідження керувалися
загальними принципами морфометричного та стереометричного аналізу,
викладеними Автанділовим Г.Г. (1990), Кір’якуловим Г.С. з співавт.
(1990). При дослідженні розвитку серця проводилася морфометрія на
поперечних зрізах за допомогою окуляр-мікрометра МОВ 1-16. До 6 доби у
зародків курки та до 12 доби у ембріонів миші лінійні розміри
передсердного відділу визначалися без розділення на праву і ліву
частини. У МПП максимальну товщину вимірювали у мезенхімній частині МПП.
При вимірюванні товщини щільного та пухкого міокарду АВ каналу оцінювали
максимальне значення цих параметрів напроти передньої та задньої АВ
подушок. Товщина міокарду шлуночків вимірювалася у ділянках між
трабекулами біля верхівки ПШ та ЛШ, у середній частині шлуночків та у
краніальній частині шлуночків. Товщину МШП визначали у ділянці верхівки
серця, у середній та верхній частинах. Довжину КСВ, довжину подушок АВ
каналу та гребенів конусу та стовбуру встановлювали за кількістю зрізів,
що пройшли через КСВ, помноженою на товщину зрізів. Зовнішній діаметр
конусу та стовбуру вимірювався у їхніх найбільш широких ділянках.

Біометричну обробку кількісних даних за кожним вивченим параметром
проводили з попереднім визначенням необхідного об’єму вибірки і
графічним аналізом статистичного розподілення величин. Відповідність
отриманих (емпіричних) розподілень якому-небудь з стандартних
розподілень оцінювали за допомогою критерію J Ястремського.
Морфометричні дані зазнавали статистичної обробки, для обчислення яких
використовували стандартні формули (Лакин Г.Ф., 1990). Визначення
достовірності відмінностей між вибірками проводили з урахуванням
критерію t Стьюдента або за допомогою непараметричних критеріїв:
Х-критерію Ван-дер-Вардена і U-критерію Уілкоксона (Манна-Уітні) за
технікою, викладеною у власній монографії (Твердохлеб И.В., Шпонька
И.С., Машталир М.А., 1996). У ході проведення біометричного аналізу
отриманих результатів розрахунки виконували за допомогою IBM PC
“Pentium” при використанні відповідних прикладних програм (№ продукта
00045-139-426-974).

Результати дослідження та їх обговорення.

Наприкінці 9 стадії за НН та протягом 10 стадії формувалася певна
гетероморфність у відділах серця, що втілювалось у формуванні різної
товщини кардіогелю у серцевих ділянках. На наш погляд, саме це, а не
початок петлеутворення, є однією з перших морфогенетичних подій в
ембріональному серці. У венозному синусі та передсердному відділі
прошарок кардіогелю швидко зникав (протягом 29-36 годин інкубації). В АВ
каналі він зберігався на стадіях 10-15 за НН та повільно потовщувався до
стадії 17 за НН, коли починалась ЕМТ. У шлуночковому відділі спочатку
добре розвинений прошарок кардіогелю в істотному ступені редукувався до
14 стадії за НН, що пов’язано з початком формування трабекул. Отже, для
ранніх стадій розвитку серця характерні індивідуальні риси в розподілі
кардіального гелю у різних відділах. АВ канал відрізнявся значною
товщиною прошарку кардіального гелю на всіх етапах. Збереження високого
рівня синтезу КМ речовини кардіального гелю на більш пізніх етапах
визначало формування АВ подушок у цьому сегменті серця. Трабекуляція
шлуночкового сегмента серця визначала активну редукцію кардіогелю.

РК, що була введена на початкових етапах розвитку серця, які передують
міграції клітин НГ, викликала високий рівень загибелі зародків внаслідок
аномального розвитку серцево-судинної системи. Протягом 24 годин
виживаність зародків знижувалась удвічі від 36 годин інкубації 53 годин
(від 75% до 37,5%). На останній контрольний термін не залишалося
зародків з лівобічною петлею серця, що вказувало на загибель саме цих
зародків. Ранні порушення кардіогенезу після дії РК полягали також у
затримці розвитку серця, що не відповідала загальному розвитку зародка.
Це втілювалось у збереженні значної кількості речовини кардіального гелю
в порівнянні з нормою, формуванні неповної для відповідної стадії петлі
серця, уповільненні формування трабекул, що можна віднести до
неспецифічного прямого впливу тератогену. Специфічний вплив РК
відбивався у формуванні аномального (лівобічного) положення серцевої
петлі та у неправильному розподілі речовини кардіального гелю у всіх
досліджених зародків після введення РК (рис. 1). На нашу думку, це
відображає порушення синтезу кардіогелю КМ в АВ каналі, шлуночковому і
КСВ серця. Той факт, що порушення в розподілі гелю як в серці з
нормальним правобічним поворотом, так і з аномальним лівобічним,
співпадають, свідчить про незалежність морфогенетичних програм, які
визначають асиметрію серця і метаболізм кардіогелю. Виявлені зміни в
розподілі кардіального гелю схожі з тими, що виникають після видалення
НГ (Waldo K. et al. 1999). В нашій роботі дія тератогену починалася в
період, коли клітини НГ ще не почали мігрувати: отже, РК викликала
первинне ураження клітин НГ, що призвело до ранніх порушень
кардіогенезу. Оскільки у період від 10 до 14 стадії за НН клітини НГ ще
не мігрують в серце, то в даній моделі відбувається порушення дистантних
взаємодій між клітинами НГ і клітинами серця, аналогічне тому, що
виникає при мікроманіпуляційному видаленні НГ.

Рис.1. Серце курячого зародка: а – на стадії 10 за НН у нормі (36 годин
інкубації), б – після впливу РК (36 годин інкубації). Тотальні препарати
зародків, забарвлення гематоксиліном. Довжина масштабної смужки – 50
мкм: 1 – венозний синус; 2 – шлуночок; 3 – КСВ.

Протягом 17-21 стадії за НН основними процесами, що характеризували
нормальний розвиток серця, були початкове розшарування шлуночкового
міокарду, пов’язане з формуванням спочатку губчастого міокарду, а потім
трабекул, а також ЕМТ, яка починалася в АВ подушках. Рання трабекуляція
шлуночкового відділу серця курячого зародка пов’язана з розщеплюванням
стінки шлуночків і формуванням двох шарів міокарду, розмежованих
подовжньо розташованими гребенями. Напрям потоку крові в подовжньо
орієнтованих лакунах співпадає з напрямом основного потоку в серцевій
трубці. Внаслідок ЕМТ подушки АВ каналу заповнювались клітинами, що
визначало гетерогенність у внутрішній будові подушок. На стадіях 20-21
за НН поблизу центральних відділів подушок кількість клітин, що вийшли з
ЕМТ, була значно більшою, що свідчило про нерівномірний перебіг ЕМТ в АВ
подушках. Цей процес був основним у формуванні клітинної популяції АВ
подушок.

На стадіях 21-22 за НН виявляється певна закономірність для обох подушок
– чим більше виступає у просвіт АВ каналу частина подушки, тим більше в
ній клітин. Отже, зростання розмірів подушок відбувається на цих
стадіях, на нашу думку, завдяки, в основному, проліферації клітин, а не
секреції матриксу.

У передній АВ подушці поблизу міокарду АВ каналу визначалися окремі
мезенхімні клітини, які за багатьма ознаками не були пов’язані з
процесом ЕМТ з тієї обставини, що вони мали іншу форму. Можливо, вони не
так активно пересувалися, як клітини після ЕМТ. Це дозволяє зробити
припущення, що дані клітини мають позасерцеве походження та мігрують
через дорсальний мезокард. Найбільш вірогідний шлях їх міграції до
передньої АВ подушки – пересування по міокарду АВК. Можливо також, що
виявлені нами клітинні скупчення верхньої частини задньої АВ подушки
значною мірою складаються з клітин, що мігрували через дорсальний
мезокард, бо в інших відділах задньої АВ подушки кількість мезенхімних
клітин була набагато меншою та вони мали іншу локалізацію –
субендокардіальну. Саме звідси можуть починати свій шлях мезенхімою АВ
каналу клітини, які ніби повзуть по міокарду всередині подушки. Той
факт, що після дії РК ми не зайшли подібних клітин, підтверджує нашу
думку про їх позасерцеве походження. Механізм впливу тератогенів у цьому
випадку співпадає з тим, що відбувається після видалення НГ.

Отже, у мезенхімі АВ каналу курячого зародка на 3 добу інкубації можливо
виділити декілька груп клітин, що відрізняються за формою, походженням
та локалізацією. Основна маса клітин – ті, що вийшли з процесу ЕМТ і
розташовані субендокардіально. Вони прямують до міокарду АВ каналу.
Друга група клітин розташована у верхньому відділі задньої АВ подушки.
Ці клітини мають різноманітну форму і, скоріше за все, позасерцеве
походження. Третя група – клітини, що мігрують по міокарду АВ каналу
всередині подушок; вірогідно, вони також походять із позасерцевих
джерел.

Протягом 18-22 стадій за НН мезенхімні клітини, що вийшли з ЕМТ, були
розташовані таким чином, що залишалася велика безклітинна зона.
Формування цієї зони може бути спричинене утворенням шляхів міграції
клітин із позасерцевих джерел через венозний полюс серця. Ми встановили,
що міграція клітин у серце з позасерцевих джерел здійснюється з 19
стадії за НН. За нашими даними, ЕМТ більш активно здійснюється в
центральних частинах обох АВ подушок як у курячих, так і у мишачих
зародків, що свідчить про неоднорідність міокарду по колу АВ каналу у
відношенні стимулів, якими він контролює трансформацію ендотеліальних
клітин.

На ранніх стадіях розвитку кислі ГАГ, що виявляються за методом
Стідмена, розподіляються рівномірно в кардіогелі та займають простір між
міокардом і ендокардом серця. Цей період характеризується однорідним
розподілом ГАГ по всій довжині трубчастого серця, виключаючи венозний
синус і передсердний відділ, де відсутність їх пов’язана з відсутністю
прошарку кардіогеля. Після 53-55 годин інкубації курячого зародка та зі
стадії 17 сомітів у миші ми спостерігали накопичення цих речовин в
подушках АВ каналу і КСВ серця, що, на нашу думку, пов’язано в
подальшими перебудовами означених відділів серця. У шлуночковій частині
серця вони спостерігаються у вигляді тонкого прошарку між міокардом і
ендокардом трабекул та простежуються аж до 5,5 діб інкубації у курей і
11 доби ембріогенезу у мишей. Ці речовини зберігаються в мезенхімних
структурах серця і клапанах, що формуються, до кінця ембріогенезу, що
вказує на істотну роль цього класу речовин протягом тривалого часу.
Процес розділення КСВ у курячих зародків був пов’язаний з наявністю
нейтральних мукополісахаридів. Вони також у підвищеній концентрації
виявлялися у мезенхімних структурах серця мишачих зародків порівняно до
курячих або зародків людини, що свідчить про видоспецифічність даного
явища.

Розподіл кислих ГАГ свідчив про істотне накопичення означених речовин
саме у мезенхімних структурах серця. Рівномірний розподіл цих речовин в
АВ подушках та гребенях КСВ вказував на відсутність формування
гетерогенності на ранніх етапах розвитку мезенхімних структур серця. При
забарвленні на глікоген істотне накопичення в області щільного прошарку
АВ каналу та КСВ, можливо, було обумовлено щільним розташуванням клітин.

Розподіл рецепторів до лектинів свідчив про істотну незрілість клітин
серця у період від початку формування МШП до розділу АВ каналу. Зокрема,
концентрація рецепторів до лектину зав’язей пшениці була обмеженою
порівняно до наступних стадій. Більш інтенсивним було зв’язування
лектинів кліщовини та тих, що виявляли залишки фукози (PFA, LAL), у
популяціях мезенхімних та ендотеліальних клітин. Це свідчило про
можливість міграції цих типів клітин. Лише в ендотеліальних клітинах
концентрація рецепторів до лектину насіння сочевиці (LCA) була
максимальною, що, можливо, обумовлено відносно більшою зрілістю
ендотеліальних клітин.

Після впливу РК на 15 стадії за НН виявлялася затримка у загальному
розвитку зародків, але більшість характеристик розвитку серця
затримувалися у більшому ступені, ніж загальна затримка. Основною
тенденцією з боку серця було розширення його камер та надмірна
видовженість відділів АВ каналу і КСВ (рис. 2). Прямий вплив тератогену
на КМ виявлявся у затримці розвитку МПП та стоншенні стінок камер
внаслідок пригнічення клітинної проліферації. Менша товщина прошарку
матриксу в АВ каналі та КСВ свідчила про обмеження секреторної
активності КМ з боку РК. Швидкість перебігу ЕМТ була значно меншою за
нормальну, що призводило до формування менш чисельної популяції
мезенхімних клітин у подушках АВ каналу та КСВ на кожній з досліджених
стадій. Отже, РК впливає на початкові стадії ЕМТ, що поряд з
пригніченням синтезу речовини матриксу призводить до істотного
пригнічення формування подушок АВ каналу та КСВ. У подушках зародків, що
зазнавали впливу РК, не виявлялося клітин, які мігрували по міокарду, що
свідчить про затримку міграції у серце клітин позасерцевого походження.
Цілісність ендотелію АВ подушок та гребенів АВ каналу часто була
порушеною, що викликало пенетрації клітин крові у тканину подушок та
навіть мілкоосередкові крововиливи. Можливо, що контакти ендотеліоцитів
ставали менш щільними після дії РК.

Рис. 2. Зовнішня будова серця курячого зародка на 5 добу інкубації у
нормі (а), після впливу РК (б). Вид з лівого боку. Тотальне забарвлення
зародка на сульфатовані ГАГ. Довжина масштабної смужки – 700 мкм: 1 –
ліве передсердя; 2 – шлуночковий відділ; 3 – КСВ.

Пізніше ми не спостерігали клітин крові або остаточних геморагічних
проявів у мезенхімних частинах серця, що свідчило про загибель саме тих
зародків, які мали крововиливи у подушки.

Картини міграції мезенхімних клітин у матриксі гребенів КСВ відрізнялися
від нормальних. Порушення міграційних процесів у АВ подушках, можливо,
було викликано аномальною структурою матриксу, яка не дозволяла клітинам
пересуватися від ендокарду. Часто накопичення кислих ГАГ у мезенхімних
частинах серця було затриманим, що могло обмежувати інтенсивність ЕМТ та
міграцію мезенхімних клітин.

Кількість глікогену не змінювалась після дії тератогену, що свідчить по
певну незалежність енергетичного метаболізму ембріонального серця від
процесів, що призводять до формування вад. Проте, властивості мембран
клітин серця, які виявлялися за допомогою лектинів, суттєво змінювались.
Зокрема, про затримку формування осілості клітин свідчила затримка
накопичення рецепторів до лектину зав’язей пшениці, гороху та сочевиці.
Популяція мезенхімних клітин, яка на ранніх стадіях містить велику
кількість рецепторів до ікри окуня та бобівника, демонструвала
пригнічення синтезу до цих типів лектинів. Це, можливо, впливає на
міграційні можливості мезенхімних клітин, зокрема тих, що вийшли з ЕМТ
та клітин, що мають походження з позасерцевих джерел. За нашими даними,
зміни у міграційних процесах у серці також можуть бути викликаними
зменшенням рецепторів до лектину кліщовини.

Ранні етапи розвитку серця мишачих зародків відносно загального
розвитку, що визначався за сомітним віком, здійснювалися раніше відносно
сомітного віку курячого зародка. Формування серця миші на ранніх стадіях
ембріогенезу мало такі ж риси, як і розвиток серця курячого зародка.
Редукція кардіального гелю проходила аналогічні етапи. Відмінність
полягала у тому, що навколо ранніх трабекул у серці мишачих зародків
залишалося більше кардіального гелю, ніж у серці курячих зародків.

Як у курячих, так і у мишачих зародків найбільшу товщину мала дорсальна
стінка передсердного відділу (до 25 мкм), можливо, тому, що значна
частина передсердної стінки в цій ділянці з’єднана з мезенхімою тулуба.
Відмінності у товщині ділянок стінки передсердя у курей та мишей
обумовлені видоспецифічними особливостями розвитку. Задня АВ подушка
була більшою на усіх ранніх стадіях в обох видів, що можна пояснити
зв’язком мезенхіми задньої АВ подушки з мезенхімою тулубу. Початкові
стадії трабекуляції у серці мишачого та курячого зародків були схожими,
але у мишей канали були більшими за розмірами та менш чисельними.
Мезенхіма в АВ каналі та КСВ в обох видів мала розташування по колу.
Характер розподілу кислих ГАГ свідчив про схожу концентрацію цих речовин
у всіх відділах серця, що містили мезенхіму. У мишачих зародків істотну
кількість кислих ГАГ мали прошарки гелю навколо ранніх трабекул, що
вказувало на відсутність гетероморфності у складі кардіогелю на ранніх
стадіях розвитку поряд з істотною різницею в резорбційних процесах у
різних відділах серця. Лектингістохімічна картина ембріонального серця
мишачого зародка відрізнялася дещо більшою концентрацією рецепторів до
лектину зав’язей пшениці та сої. Таким чином, на відповідних стадіях
клітини серця мишачих зародків демонстрували відносно більшу зрілість у
порівнянні з серцем курячих зародків.

Після впливу обох тератогенів відбувалася затримка у розвитку мишачих
зародків взагалі та затримка у розвитку серця. Але у випадку з етанолом
більшість зародків мала відхилення у розвитку серця, що належали до
пригнічення формування камер та стінок серця без їхнього розширення, а
після впливу РК спостерігалося розширення камер. Потоншення стінок у
цьому випадку було пов’язано як з пригніченням проліферації, так із
загальним розширенням серця. Розширення серця було пов’язано з
гемодинамічними порушеннями, схожими з тими, що мають місце після
видалення НГ. Як і в серці курячих зародків, після впливу тератогенів
основні процеси, що характеризують формування ембріонального серця,
затримувалися або мали аномальний перебіг.

Зміни у гістохімічній та лектингістохімічній картині в серці мишачого
зародка були близькими до тих, що спостерігалися у курячих зародків
після впливу РК, що вказує на спільність тих механізмів, які обумовлюють
розвиток вад у курячих та мишачих зародків після впливу тератогенів.
Вплив РК на синтез рецепторів до лектинів був помітнішим, що викликано
більш виразною специфічністю дії цього тератогену. Можливо, менша
адгезивність ендотеліальних клітин викликана змінами у складі їх
мембран; КМ виявилися найбільш незалежними від дії тератогенів на ранніх
стадіях розвитку серця.

Кардіогенез у зародків людини протягом 4 тижня пренатального розвитку
призводив до формування чіткого відокремлення камер. Зовнішня форма
серця людини з ТКД 6 мм відповідала такій для серця мишачого зародка на
9 добу розвитку за положенням камер та виразністю міжшлуночкової
борозни. Форма АВ подушок та гребенів КСВ у серці зародків людини була
схожою з тією, що спостерігалася у курячих та мишачих зародків на
відповідних стадіях. Як і в серцях експериментальних тварин, формувалась
різниця у товщині різних ділянок передсердь шлуночків. Гетерогенність
правого та лівого шлуночків ще не була помітною в жодного з досліджених
видів у період, що передує появі міжшлуночкової перегородки. Апоптотичні
процеси у серці не мали такого розвитку, як вони набували у наступний
період. Лектингістохімічна картина в серці людини дещо відрізнялася від
тієї, що ми спостерігали у серці тварин. Так, більша концентрація
рецепторів до лектину зародків пшениці та гороху у складі мезенхімних та
ендотеліальних клітин свідчила про відносно більший ступінь
диференціювання цих клітин в серці людини.

У період від початку формування міжшлуночкової перегородки до повного
розділення АВ каналу у всіх досліджених видів у нормі спостерігалися
наступні закономірності. Відбувалося подальше диференціювання камер
серця та потовщення їхніх стінок. Щодо КСВ, то наприкінці цього періоду
відбувалося зменшення його довжини за рахунок апоптотичних процесів.
Перед закінченням септації його довжина зменшувалась у нормальних
курячих зародків від 776±71 мкм на 6 добу до 230±22 мкм на 8 добу, у
мишачих – від 786±72 мкм на 12 добу до 310±29 мкм на 14 добу. Після
впливу етанолу на 8 добу розвитку курячих зародків довжина КСВ складала
682±73 мкм, після дії РК – 892±86 мкм. У мишачих зародків на 14 добу
розвитку після впливу етанолу довжина КСВ становила 762±69 мкм, після
дії РК – 1219±115 мкм.

У курячих зародків у нормі формування МПП починалось до розвитку МШП, а
у мишачих ембріонів починалось одночасно, що, можливо, залежить від
кількості крові, що тече через серце, або від раннього зміщення устя
венозного синусу у курячих зародків. Початок розвитку МШП відбувався
відносно пізніше, ніж у мишачих зародків, якщо орієнтуватися на
загальний розвиток серця. Утворення трабекул у передсердному відділі
починалося одночасно з розвитком МШП, а в мишачих зародків – відносно
пізніше.

Різна послідовність подій у формуванні серця у цих видів, на нашу думку,
залежить від ступеня зрілості при народженні. Передсердний відділ у цей
період характеризувався інтенсивним розвитком у всіх досліджених видів.
Формування вушок серця та їх трабекуляція була однією з важливих рис
розвитку передсердного відділу. Внаслідок активного перебігу ЕМТ та,
меншою мірою, проліферації мезенхімних клітин подушки АВ каналу та
гребені КСВ ставали максимально виразними у курки на 27 стадії за НН, у
мишачого зародка – на стадії 48 сомітів, та у зародка людини з ТКД 11
мм. Процес розвитку МПП у всіх видів у цей період пов’язаний з подальшим
збільшенням об’єму м’язової тканини. У курячих ембріонів розповсюдження
мезенхіми у складі МПП було максимальним, порівняно із зародками миші та
людини, тобто ранні стадії формування МПП у курей більшою мірою залежали
від розвитку мезенхімної тканини. Цим можна пояснити той факт, що після
впливу тератогенів порушення у розвитку МПП серця курячих зародків були
більш суттєвими, ніж у мишачих зародків. Виходячи з наших даних, ми
робимо припущення, що чим більшим є внесок позасерцевих клітинних
популяцій у розвиток окремих структур серця, тим більшим буде
тератогенний ефект саме на цих ділянках.

Початок ЕМТ в АВ каналі серця курячих зародків відбувався раніше
відносно формування МШП, ніж у мишачих зародків. Це визначає більш
інтенсивне диференціювання мезенхімних структур серця саме у курячих
зародків. При цьому в обох видів початок ЕМТ у КСВ спостерігався після
початку ЕМТ в АВ каналі. Нами виявлені специфічні ефекти, які має процес
ЕМТ після впливу етанолу та РК. Зокрема, втягування поверхні подушок при
міграції клітин під час початкових стадії ЕМТ було значно більшим після
дії тератогенів. Враховуючі дані про участь позаклітинного матриксу у
цих процесах, ми дійшли висновку, що склад кардіогелю, або
позаклітинного матриксу подушок, змінюється на найбільш ранніх етапах їх
розвитку, що згодом має значення для аномального перебігу ЕМТ. У
формуванні АВ подушок виділялася стадія, коли максимальна кількість
клітин накопичувалася під ендокардом. Можливо, що це стадія
характеризувалася меншою міграційною активністю клітин або особливостями
складу матриксу в цій зоні. Лабільність форми АВ подушок у всіх
нормальних зародків протягом другого періоду, на нашу думку, відіграє
важливу роль в ефективному закритті просвіту АВ каналу протягом систоли
шлуночків. Зміни у формі інтактних подушок у просторі коливались від
паралелепипідної до призматичної. Але в жодного з зародків при
нормальному кардіогенезі не було виростів та заворотів тканини подушок,
які це часто спостерігалося після дії тератогенів (рис.3). Менш щільна
структура матриксу подушок разом із зменшенням кількості клітин,
можливо, викликала їхні істотні аномалії.

На стадії, що передує злиттю АВ подушок (5 доба у курей, 11 доба – у
мишей), їхній абсолютний об’єм у нормі у курячих зародків сягав 0,021
мм3 та 0,023 мм3 для передньої та задньої подушок відповідно, у мишачих
– 0,011 мм3 та 0,012 мм3. Після впливу етанолу на 5 добу розвитку
курячих зародків абсолютний об’єм АВ подушок складав 0,015 та 0,016 мм3
, після РК – 0,013 та 0,014 мм3 відповідно. У мишачих зародків на 11
добу розвитку після дії етанолу абсолютний об’єм АВ подушок не
перевищував 0,007 мм3 та 0,008 мм3, після впливу РК – 0,006 мм3 та 0,008
мм3 відповідно.

Рис. 3. Тривимірна реконструкція АВ подушок серця курячого зародка на 5
добу інкубації у нормі (а), після впливу РК (б).

Кількість апоптотичних клітин після злиття АВ подушок за умов
нормального кардіогенезу була суттєво більшою, ніж це необхідно для
редукції ендокарду, який потрапив усередину АВ перегородки. Апоптотичні
клітини були добре помітні при забарвлюванні гематоксиліном-еозином та
при реакції з лектинами зав’язей пшениці, ікри окуня, картоплі (рис. 4).
Заслуговує на увагу концепція, що всі апоптотичні процеси у серці
контролюються клітинами НГ (Poelmann R.E., Gittenberger-de Groot A.C.,
1999). Отже, зниження кількості апоптотичних клітин в АВ перегородці
після впливу тератогенів, можливо, обумовлено первинним впливом на
клітини НГ.

1/4

3/4

O

ue

?

¬

?

4

6

?

O

?

?

?

„”

^„”

`„lo

„”

^„”

??????$??

????????????$???????$

??????????$???????$

?????

?????

?????

Рис. 7. Схематичне відтворення впливу етанолу і ретиноєвої кислоти на ланки кардіогенезу, що пов’язані з участю НГ. ВИСНОВКИ У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, яка полягає у визначенні морфогенетичних механізмів розвитку серця у нормі та при формуванні вад серця, що викликані дією етанолу та ретиноєвої кислоти, встановлена роль НГ у цих процесах, визначена хронологія основних подій в органогенезі серця курки, миші і людини. Отримані дані є основою для наступних експериментальних і кардіоембріологічних досліджень у галузі морфології та ембріології. 1. Основними рисами розвитку курячого та мишачого зародків від початку формування трубчастого серця до стадії сигмоподібного серця є диференціація відділів серця за рахунок варіювання товщини кардіального гелю, формування серцевої петлі, початок ЕМТ та розвиток шлуночкової трабекуляції. Після дії РК на курячий зародок на стадії 9 за НН спостерігається смертність 63% через 24 години; 100% зародків мають порушення у формуванні серця. Відбувається пригнічення проліферації усіх типів клітин, процесу петлеутворення і формування трабекул, утворення лівобічної петлі серця, а також порушення розподілу кардіального гелю в АВ каналі, шлуночках і КСВ серця. Одним з механізмів тератогенної дії РК є ушкодження міжклітинних контактів ендотелію, що призводить до крововиливів у мезенхімні структури серця та в субепікардіальний простір. У зародків обох видів після впливу РК відбувається дилатація камер серця. 2. У період формування перегородок серця після дії етанолу на 72 годині інкубації курячих зародків та РК на стадії 15 за НН, а також після введення мишачим зародкам етанолу та РК у середині 9 доби гестації, основними порушеннями розвитку серця є затримка конвергенції кінців серця, порушення у характері трабекуляції шлуночків, пригнічення проліферації КМ та мезенхімних клітин, затримка ЕМТ. Найбільших ушкоджень зазнають мезенхімна частина МПП, подушки АВ каналу, гребені КСВ. Центральним механізмом формування аномалій цих структур є пригнічення синтезу позаклітинного матриксу, зміни його складу за рахунок зниження секреції ГАГ та їх аномального розподілу. Другим механізмом є зміни у складі глікопротеїдів клітинних мембран – затримка накопичення рецепторів до лектину зав’язей пшениці, гороху та сочевиці, що обумовлює пригнічення диференціювання клітин, а також зменшення кількості рецепторів до лектинів ікри окуня, кліщовини та бобівника, що знижує міграційні властивості клітин. 3. На строк моніторингу вад розвитку серця, що відповідає закінченню септації серця (у курки – 8 доба інкубації, у миші – 14 доба гестації), у курячих зародків після дії етанолу ПВПШ виникає у 5,1% випадків, ДА – у 7,7%, ізольований ДМШП – у 64,1%; після дії РК ПВПШ формується у 15,1% зародків, ДА – у 28,3%, ПТМС – у 1,88%, ізольований ДМШП – у 18,9%. У мишачих зародків після дії етанолу ПВПШ формується у 7,5% випадків, ДА – у 10,0%, ізольований ДМШП – у 52,5%; після дії РК ПВПШ утворюється у 10,2% зародків, ДА – у 6,12%, ПТМС – у 68,4%, ізольований ДМШП – у 6,1%. Спільними механізмами формування вад є затримка скорочення КСВ через пригнічення апоптотичних процесів, порушення у формуванні перегородок серця. У патоморфогенезі ПТМС у мишачих зародків має місце відсутність ротації порожнини КСВ. Після впливу тератогенів виживаність зародків постійно знижується протягом ембріогенезу та зростає частка зародків, що мають зовнішні вади розвитку та серцеві вади. 4. Про участь НГ у формуванні вад розвитку серця після дії етанолу та РК свідчить обмеження міграції щільної мезенхіми, що має походження з НГ, від зябрових дуг до КСВ, затримка внаслідок цього утворення перегородки стовбуру, зниження інтенсивності апоптотичних процесів у КСВ серця, міокарді та мезенхімі АВ каналу, місцях формування провідної системи серця, дилатація серцевих камер, а також значна частка ДМШП, ДА, ПВПШ у спектрі вад. 5. Серце людини за послідовністю подій протягом періоду септації серця, а саме початком трабекуляції і формування МШП, перегородки стовбуру та АВ перегородки, а також за морфологічними особливостями міграції щільної мезенхіми, що походить з НГ, та апоптотичних процесів, має схожість із серцем миші. У нормальному розвитку серця курки та миші існує період, коли лектингістохімічні властивості клітин серця змінюються у бік інтенсивного підвищення зрілості. У курячих зародків це відбувається на 8 добу інкубації, у мишачих – на 12 добу ембріогенезу. У розвитку серця людини лектингістохімічні властивості клітин змінюються у бік підвищення зрілості на 10 тиждень пренатального онтогенезу, що є більш пізньою подією порівняно до кардіогенезу експериментальних тварин. У цей термін формуються відмінності у складі глікопротеїдів початкових відділів аорти та ЛС. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ: Виконане дослідження доповнює існуючі уявлення про нормальний та аномальний морфогенез серця досліджуваних об’єктів, з нових позицій висвітлює механізми кардіогенезу після впливу хімічних тератогенних чинників. Отримані результати можуть бути використані у навчальному процесі на кафедрах нормальної анатомії, гістології та ембріології, а також при подальших анатомічних, ембріологічних і гістологічних дослідженнях. Результати дослідження є підгрунтям для подальшого аналізу клітинних, тканинних та анатомічних перебудов у складі відділів серця, а також при вивченні аномальних процесів розвитку серця. Крім того, отримані дані доповнюють інформаційний блок-еталон нормального розвитку камер, перегородок та клапанів серця, що може бути використаний для вивчення патології формування їх анатомічної структури та гістоархітектури. Одержані дані дають змогу удосконалити ембріологічні методичні підходи до вивчення кардіогенезу. Результати дослідження дозволяють прогнозувати появу і тип уроджених вад розвитку серця у людини при дії таких факторів, як етанол і похідні вітаміну А, а також інших речовин, що обумовлюють ушкодження НГ. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Машталир М.А. Роль витамина А и его производных в формировании врожденных пороков сердца (обзор) // Вісник морфології.- 2000.- Т. 6, № 2.- С. 350-354. Машталір М.А., Твердохліб І.В., Сілкіна Ю.В. Ранні зміни у формуванні серця курячого зародка під впливом етанолу // Медичні перспективи. - 2002.- Т. 7, №  2.- С. 30-33. Автор самостійно набрала матеріал, провела аналіз та сформулювала загальні висновки. Машталір М.А., Твердохліб І.В., Шаторна В.Ф. Формування епікарда курячого зародка в нормі і при порушенні кардіогенезу дією етанолу // Медичні перспективи.- Дніпропетровськ, 2003.- Том VIII, № 1.- С.43-46. Автор самостійно набрала матеріал, провела аналіз отриманих результатів та сформулювала загальні висновки. Машталір М.А. Формування атріовентрикулярного канала курячого зародка під впливом ретиноєвої кислоти // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: науково-практ.конфер. морфологів “Роль імунної, ендокринної та нервової систем в процесах морфогенезу та регенерації”.- Запоріжжя, 2003.- Вип. IX.- С.276-283. Машталир М.А. Состояние кардиогеля в сердце куриного зародыша в норме и после экспериментального нарушения кардиогенеза // Український морфологічний альманах.- 2003.- Т.1, № 1.- С.38-40. Козлов В.О., Шаторна В.Ф., Машталір М.А. Формування папилярно-трабекулярного апарату серця в ембріогенезі курей // Український морфологічний альманах.- 2003.- Т.1, № 2.- С.39-41. Автор самостійно набрала матеріал, провела аналіз отриманих результатів та сформулювала загальні висновки. Машталір М.А.Формування конусно-стовбурового відділу серця під впливом етанолу // Медичні перспективи.-2004.-Т. IX, № 2.- С.11-14. Лутай Н.В., Машталир М.А., Бразалук А.З., Твердохлеб И.В. Гистотопография рецепторов лектинов в тканях 10-недельного эмбриона человека // Вісник проблем біології і медицини.- 2004.- № 3.- С.104-107. Автор самостійно набрала матеріал, провела аналіз отриманих результатів. Машталір М.А. Розвиток шлуночків серця курей в нормі і при порушення розвитку під впливом етанолу // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2004.- Т.3, № 2.- С. 23-25. Машталір М.А. Онтогенетичні перетворення кардіального гелю в серці курячого зародка // Вісник морфології.- 2004.- Т.10, № 2.- С. 310-312. Машталір М.А. Формоутворення атріовентрикулярних подушок у курей у нормі і при дії ретиноєвої кислоти // Медичні перспективи.- 2004.- Т. IX, № 4.- С.17-21. Машталир М.А. Развитие предсердно-желудочкового соединения у мышей после воздействия этанола // Вісник морфології.- 2004.- Т. 10, № 1.- С.90-92. Машталир М.А. Клеточные популяции в эмбриональном сердце: взаимодействия при нормальном и аномальном развитии // Таврический медико-биологический вестник.- 2004.- Т.7, № 4.- С. 84-85. Машталір М.А.Перебудова атріовентрикулярного каналу у курячого зародка у нормі та при порушення розвитку серця під впливом етанолу // Медичні перспективи.- 2004.- Т.IX, № 3.- C.20-23 Машталір М.А. Розвиток передсердного відділу серця при дії ретиноєвої кислоти // Медичні перспективи.- 2005.- T. X, № 1.- C. 28-32. Машталір М.А. Формування міжшлуночкової та міжпередсердної перегородки у зародка миши у нормі та під впливом етанолу // Медичні перспективи.- 2005. –Т. X, № 2.- С. 17-19. Машталір М.А. Розвиток конусно-стовбурового відділу серця у зародка миші у нормі та під впливом етанолу // Медичні перспективи.- 2005. –Т. X, № 3.- С. 6-10. Машталир М.А. Апоптозы в эмбриональном серце // Вісник проблем біології і медицини.- 2005.- № 3.- С. 131-135 Машталір М.А. Лектин-гістохімічні властивості клітин серця курячих зародків після дії етанолу та ретиноєвої кислоти // Український морфологічний альманах.- 2005.- Т.3, № 3.- С. 63-65. Машталір М.А. Вплив етанолу та ретиноєвої кислоти на лектин-гістохімічні властивості клітинної поверхні в серці мишачих зародків // Вісник проблем біології і медицини.- 2005.- № 4.- С.147-150. Машталір М.А. Формування міжпередсердної перегородки в нормі і після впливу етанолу у курей // Вісник морфології.- 2005.- Т. 11, № 2.- С.241-244. Машталір М.А. Формування конусно-стовбурового відділу серця у мишачих та курячих зародків під впливом ретиноєвої кислоти // Медичні перспективи. 2006.- Т. №1.- С.8-12. Машталір М.А. Формування передсердно-шлуночкового каналу у мишачих зародків під впливом ретиноєвої кислоти // Медичні перспективи.- 2006, №2 – С.23-26. Патогенетичні аспекти виникнення аномально розташованих сухожилкових струн / В.О.Козлов., В.Ф.Шаторна, М.А.Машталір, С.В.Козлов // Сухожилкові струни серця: Навчально-методичний посібник.- Дніпропетровськ: Лира, 2006.- С.44-59. Автор самостійно набрала матеріал, провела морфологічне дослідження та сформулювала загальні висновки. Лутай Н.В., Машталир М.А., Бразалук А.З. Распределение рецепторов лектинов в эмбриональных тканях курицы в период с 3 по 8 день пренатального развития // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. – 2004.- Т. 1, вип. 12.- С. 84-89. Автор самостійно набрала матеріал, провела морфологічне дослідження. Твердохліб І.В., Машталір М.А., Сілкіна Ю.В., Хріпков І.С., Романенко Л.А., Терещенко Н.М., Крамар С.Б., Шаторна В.Ф., Максименко С.В. Спосіб визначення перфузійної здатності капілярів міокарда. Деклараційний патент на винахід (11) 59108А (51) 7 А61В5/02 від 15.08.2003. Машталір М.А., Твердохліб І.В., Сілкіна Ю.В., Хріпков І.С., Терещенко Н.М., Горєлова Н.І., Науменко Л.Ю., Макарчук О.І., Горєлов О.М., Малков І.І., Новіков С.П. Спосіб визначення стереометричних характеристик ультраструктур клітин. Деклараційний патент на винахід (11) 59109 А (51) 7 А61В5/02 від 15.08.2003. Машталір М.А., Твердохліб І.В., Козлов В.О., Сілкіна Ю.В., Хріпков І.С., Романенко Л.А., Терещенко Н.М., Горєлова Н.І., Морозова С.Б., Маєр Г.О., Печерій В.Г. Спосіб ультраструктурної оцінки ефективності транскапілярного обміну в міокарді. Деклараційний патент на винахід (11) 60079 А (51) 7 А61В5/02 від 15.09.2003 Сілкина Ю.В., Твердохліб І.В., Машталір М.А., Терещенко Н.М., Горєлова Н.І., Науменко Л.Ю., Горєлов О.М., Макарчик О.І., Малков І.І., Маєр Г.В. Спосіб підготовки біологічного матеріалу до тривимірної реконструкції. Деклараційний патент на винахід. 68595 А. А61В5/00.- Бюл. №8.- 16.08.2004. Козлов В.О., Машталір М.А., Довгаль Г.В., Шаторна В.Ф., Абдул-Огли Л.В., Зозуля О.С., Козловська Г.О. Розвиток серця // Сбірник статей міжнар. конф. “Саміт нормальних анатомів анатомів України та Росії”, присвяченої року Росії в Україні.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2003.- С. 58-61. Автор самостійно провела огляд даних літератури по вказаній проблемі, набрала матеріал, провела морфологічне дослідження. Козлов В.О., Шаторна В.Ф., Машталір М.А. Формування лівого передсердно-шлуночкового клапана серця в ембріогенезі курей // Актуальні питання морфології: Наукові праці III нац. конгресу анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.- С.146. Автор самостійно набрала матеріал, провела морфологічне дослідження та аналіз отриманих результатів Машталір М.А. Розвиток передсердно-шлуночкового з’єднання при порушенні розвитку серця курячого зародку дією етанолу // Актуальні питання морфології: Наукові праці III нац. конгресу анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.- С. 204-205. Автор самостійно провела огляд даних літератури набрала матеріал, провела морфологічне дослідження та аналіз отриманих результатів Машталір М.А., Твердохліб И.В., Козлов В.О., Маковецький В.Д., Шаторна В.Ф., Сілкіна Ю.В., Терещенко Н.М., Довгаль Г.В. Трабекуляція шлуночків та її зв’язок з формуванням міжшлуночкової перегородки і передсердно-шлуночкових клапанів у курячого ембріона при експериментальному порушення розвитку сердця // Актуальні питання морфології: Наукові праці III нац. конгресу анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.- С. 205. Автор самостійно провела огляд даних літератури, набрала матеріал, провела морфологічне дослідження та аналіз отриманих результатів Машталір М.А. Формування структур основи серця курячого зародка в нормі та після впливу терагогенного чинника // Мат-ли І наук. конф. “Карповські читання”.- Дніпропетровськ, 2004.- С. 35-37. Lectin histochemistry of the chick embryo during embryonic days 3-8 / M.Mashtalir, N.Lutay, A.Brazaluck, I.Tverdokchleb // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska.- Lublin, Polonia, 2004.- Vol. XVII, № 2, section DDD.- P. 269-271. Автор самостійно провела огляд даних літератури по вказаній проблемі, набрала матеріал, провела морфологічне дослідження та аналіз отриманих результатів. Ранняя трабекуляция желудочкового отдела эмбрионального сердца / Машталир М.А., Н.А.Мороз, О.Ю. Потоцкая, Е.А. Шаповал. // Мат-ли ІI наук. конф. “Карповські читання”.- Дніпропетровськ, 2005.- С. 43-45. Машталір М.А. Розвиток серця мишачих та курячих зародків на кінцевих етапах септації після впливу етанолу // Мат-ли ІII наук. конф. “Карповські читання”.- Дніпропетровськ, 2006.- С. 40. Машталір М.А. Лектин-гістохімічні властивості клітин ембріонального серця людини протягом 4-10 тижня // Мат-ли наук.-прак. конф. “Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів”.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2006.- С. 83-85. Машталир М.А. Гистохимические особенности эмбрионального сердца после воздействия тератогенов // Хист.- 2006.- Вип.8.- С.129. Анотація Машталір М.А. Морфогенез серця при ураженні нервового гребеня етанолом та ретиноєвою кислотою.– Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.01 – нормальна анатомія.- Харківський державний медичний університет МОЗ України, Харків, 2006. Дисертація присвячена з’ясуванню механізмів морфогенезу вад розвитку серця, обумовлених дією етанолу та ретиноєвої кислоти. Вивчені морфологічні перебудови, що призводять до формування вад серця в експериментальних моделях з використанням етанолу та ретиноєвої кислоти. Кількісно оцінені структурні зміни в різних відділах серця – передсердях та шлуночках, міжшлуночковій і міжпередсердній перегородках, атріо-вентрикулярному каналі, конусно-стовбуровому відділі та клапанах серця – при формуванні вад розвитку серця в моделях, що відтворюють ураження нервового гребеня. Зіставлені механізми аномального морфогенезу в різних моделях. Проведена тривимірна реконструкція нормально та аномально розвинутих ділянок серця зародків курки та миші; отримані просторові уявлення про етапи формування різних вад серця, що викликані ушкодженням нервового гребеня. Проведені зіставлення нормального кардіогенезу серця експериментальних тварин і людини. Визначені механізми аномального розвитку серця після дії етанолу та ретиноєвої кислоти, які пов’язані з похідними нервового гребеня. Ключові слова: серце, кардіогенез, нервовий гребінь, ретиноєва кислота, етанол, серцеві вади. Аннотация Машталир М.А. Морфогенез сердца при поражении нервного гребня этанолом и ретиноевой кислотой.– Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.01 – нормальная анатомия.- Харьковский государственный медицинский университет МЗ Украины, Харьков, 2006. Диссертация посвящена выяснению механизмов морфогенеза пороков развития сердца, обусловленных воздействием этанола и ретиноевой кислоты. Изучены морфологические преобразования, приводящие к формированию пороков сердца в экспериментальных моделях с использованием этанола и ретиноевой кислоты. Количественно оценены структурные сдвиги в различных отделах сердца – предсердиях и желудочках, межжелудочковой и межпредсердной перегородках, атрио-вентрикулярном канале, конусно-стволовом отделе и клапанах сердца – при формировании пороков развития сердца в моделях, которые воссоздают поражение нервного гребня. Сопоставлены механизмы аномального морфогенеза в разных моделях. Проведена трехмерная компьютерная реконструкция нормально и аномально развивающихся участков сердца зародышей курицы и мыши; получены пространственные представления об этапах формирования разных пороков сердца, вызванных повреждением нервного гребня. Проведено уточнение данных относительно нормального и аномального морфогенеза критических областей сердца, ответственных за формирование пороков, а также получены новые сведения об их вкладе в аномальный кардиогенез. Показано, что основными нарушениями развития сердца являются задержка конвергенции концов сердца, нарушения в характере трабекуляции желудочков, угнетение пролиферации кардиомиоцитов и мезенхимных клеток, задержка эпителио-мезенхимной трансформации. Наибольшие повреждения испытывают мезенхимная часть межпредсердной перегородки, подушки атриовентрикулярного канала, гребни конусно-стволового отдела. Центральным механизмом формирования аномалий указанных структур является угнетение синтеза внеклеточного матрикса, сопровождающееся изменением его состава за счет снижения секреции гликозаминогликанов и их аномального распределения. Участие нервного гребня в формировании пороков развития сердца после действия этанола и ретиноевой кислоты обусловлено ограничением миграции плотной мезенхимы, развивающейся из нервного гребня, от жаберных дуг к конусно-стволовому отделу, задержкой вследствие этого образования перегородки ствола, снижением интенсивности апоптотических процессов в конусно-стволовом отделе сердца, миокарде и мезенхиме атрио-вентрикулярного канала, местах формирования проводящей системы сердца, дилатацией сердечных камер, а также значительной долей дефекта межжелудочковой перегородки, декстрапозиции аорты, двойного выпускного тракта правого желудочка в спектре пороков. Установлено, что сердце человека по последовательности событий на протяжении периода септации сердца, а именно по началу трабекуляции и формирования межжелудочковой перегородки, перегородки ствола и атрио-вентрикулярной перегородки, а также по морфологическим особенностям миграции плотной мезенхимы, происходящей из нервного гребня, и апоптотическим процессам, имеет существенное сходство с сердцем мыши. В нормальном развитии сердца курицы и мыши существует период, когда лектингистохимические свойства клеток сердца изменяются в сторону интенсивного повышения зрелости. У куриных зародышей это происходит на 8 сутки инкубации, у мышиных – на 12 сутки эмбриогенеза. В развитии сердца человека лектингистохимические свойства клеток изменяются в сторону повышения зрелости на 10 неделю пренатального онтогенеза, что является более поздним событием по отношению к кардиогенезу изученных экспериментальных животных. В этот период формируются отличия в составе гликопротеидов начальных отделов аорты и легочного ствола. В работе проведено сопоставление нормального кардиогенеза сердца экспериментальных животных и человека. Определены механизмы аномального развития сердца после действия этанола и ретиноевой кислоты, связанные с производными нервного гребня. Ключевые слова: сердце, кардиогенез, нервный гребень, ретиноевая кислота, этанол, сердечные пороки. Annotation Mashtalir M.A. The heart morphogenesis after altering of the neural crest by ethanol and retinoic acid.– Manuscript. Dissertation for a scientific degree of Doctor of Medical Sciences on the speciality 14.03.01 – normal anatomy.- Kharkov State Medical University MPH of Ukraine, Kharkov, 2006. The dissertation is dedicated to the elucidation of mechanisms of heart defects after ethanol and retinoic acid treatment. The morphological transformations resulting in forming of abnormal heart in experimental models with the use of ethanol and retinoic acid are studied. It has been made the quantitative estimation of structural changes in different departments of the heart – auricles and ventricles, interventricular and interatrial septum, atrio-ventricular canal, cono-truncal part and heart valves during the abnormal heart development in the models which recreate the altering of neural crest. The mechanisms of anomalous morphogenesis in different models are compared. The three-dimensional reconstruction of normal and abnormal areas of heart of chick and mice embryos was made; the spatial pictures of stages of heart defects forming caused by the damage of neural crest are received. Thе сomparison of normal cardiogenesis of experimental animals and man was made. The mechanisms of anomalous development of heart after ethanol and retinoic acid treatment, related to derivatives of neural crest were determined. Keywords: heart, cardiogenesis, neural crest, retinoic acid, ethanol, heart defects. Підписано до друку 15.08.06. Формат 60Ч84 1/16. Папір офсетний. 1,25 ум. др. а. Тираж 100 прим. Замовлення № 28. Віддруковано в видавничому центрі ДДМА. 49044 пл. Жовтнева, 14. PAGE 1 Стадії розвитку серця Стадії розвитку похідних НГ До формування сигмоподібного серця Міграція клітин НГ у зяброві дуги Дистанційний вплив Дистанційний вплив на розвиток міокарду на розвиток ендокарду До розділу АВ каналу До завершення септації Міграція похідних НГ у серце в АВ канал (апоптотичні процеси у мезенхімі і міокарді) у мезенхіму у міокард (формування (скорочення перегородки КСВ за рахунок стовбуру) апоптозу) Диференціювання похідних НГ у серці формування формування закриття клапанів провідної МШО системи РК ЕТАНОЛ ЕТАНОЛ ЕТАНОЛ РК РК ЕТАНОЛ РК РК ЕТАНОЛ РК РК ЕТАНОЛ РК

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020