Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин та механізми медикаментозної резистентності у хворих на гостру лейкемію, які постраждали внаслід

Академія Медичних Наук УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА трансфузіології

КЛИМЕНКО Сергій Вікторович

УДК: 616.155.392-07-08:616-001.28

Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин та механізми
медикаментозної резистентності у хворих на гостру лейкемію, які
постраждали внаслідок аварії на чорнобильській АЕС

14.01.31 – гематологія та трансфузіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ — 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України

Наукові консультанти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України

БЕБЕШКО Володимир Григорович, Науковий центр радіаційної медицини АМН
України, завідувач відділу гематології та трансплантології

доктор медичних наук, професор

Базика Дмитро Анатолійович, Науковий центр радіаційної медицини АМН
України, завідувач відділу клінічної імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Романова Алла Федорівна, Інститут гематології та трансфузіології АМН
України, головний науковий співробітник відділення захворювань системи
крові

доктор медичних наук, професор

Гайдукова Світлана Миколаївна, Київська медична академія післядипломної
освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології та
трансфузіології

доктор медичних наук

МАСЛЯК Звенислава Володимирівна, Інститут патології крові та
трансфузійної медицини АМН України, завідувач відділення гематології

Провідна установа:

Інститут онкології, науково-дослідне відділення системних пухлинних
захворювань, АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 21 ” _______03_______ 2006 р.
о 13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в
Інституті гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060,
м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та
трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий “ 20_ ” ______02________ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Г.П. Гащук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чисельні епідеміологічні дослідження підтвердили
існування причинного зв’язку розвитку лейкемій з дією іонізуючої
радіації (ІР) (Preston et al., 1994; Doll et al., 1995; Ron, 2003).
Доказами слугували результати спостереження за особами, опроміненими під
час вибухів ядерної зброї, професійної діяльності на об’єктах атомного
виробництва, внаслідок техногенних катастроф і з метою лікування. Після
аварії на Чорнобильській АЕС (ЧАЕС) населення значної частини
європейських держав зазнало дії ІР. Відповідно до безпорогової концепції
реалізації стохастичних ефектів опромінення, розвиток додаткових
випадків гострої лейкемії (ГЛ) у цій ситуації став неминучим
(UNSCEAR, 2000). Результати епідеміологічних досліджень, проведених в
Росії, демонструють збільшення захворюваності на лейкемію серед
учасників ліквідації наслідків аварії (ЛНА) на ЧАЕС
(Ivanov et al., 1997). Очікується, що спільне дослідження українських і
американських учених ГЛ і споріднених захворювань надасть переконливі
докази існування у ліквідаторів надлишку лейкемічних процесів,
пов’язаного з радіаційним фактором Чорнобильської катастрофи
(Romanenko et al., 2003).

Деякими дослідниками наведено дані про особливості клітинного субстрату
за радіаційно-асоційованої ГЛ (В.И. Клименко и соавт., 1991;
В.Г. Бебешко и соавт., 1991; Gluzman et al., 2005). Розвитку
захворювання у опромінених осіб часто передує фаза мієлодиспластичних
змін (В.Г. Бебешко, 1999). Багато авторів відзначили резистентність
лейкемічного процесу в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно
забруднених територій до стандартної цитостатичної терапії
(А.Ф. Романова и соавт., 1996; Л.А. Сивак та співавт., 2000). Однак
дотепер недостатньо даних, щоб чітко визначити патогенетичні,
молекулярно-біологічні та клініко-гематологічні особливості ГЛ,
зумовлених дією ІР. Систематизоване і поглиблене дослідження хворих на
гостру мієлоїдну лейкемію (ГМЛ), гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) та
мієлодиспластичний синдром (МДС), які були опромінені внаслідок
Чорнобильської катастрофи, може надати ґрунтовну інформацію про
патогенетичні шляхи розвитку лейкемічного процесу і стати підставою для
уточнення існуючої класифікації лейкемій, виділення
радіаційно-індукованих і радіаційно-асоційованих випадків захворювання в
окрему класифікаційну категорію. У практичному аспекті систематизація
цитоморфологічних, імунофенотипових, цитогенетичних та
молекулярно-біологічних характеристик лейкемічних клітин у осіб,
опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, дозволяє розробити критерії
прогнозування перебігу захворювання, диференціювати терапевтичні підходи
та здійснювати контроль за ефективністю лікування.

Не вирішеною залишається проблема резистентності до цитостатичної
терапії ГЛ у осіб, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС.
Удосконалення потребує моніторинг результатів лікування, поглибленого
вивчення – фактори, що призводять до розвитку медикаментозної
резистентності у хворих на радіаційно-асоційовані ГМЛ і ГЛЛ. Розроблення
стратегії терапії ГЛ, основаної на розумінні молекулярно-біологічних
особливостей радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу і спрямованої
на подолання феномену множинної медикаментозної резистентності (ММР),
має стати вирішальною в підвищенні результативності лікування
постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках науково-дослідних розробок Наукового центру радіаційної
медицини (НЦРМ) АМН України, виконавцем яких був автор, а саме:
1) “Вивчення закономірностей виникнення, механізмів розвитку та
особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у
постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи
лікувально-реабілітаційних заходів, первинної та вторинної профілактики
патологічних станів”. Підтема “Вивчити особливості перебігу та лікування
різних форм мієлодиспластичного синдрому та лейкемії серед осіб, які
постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, у віддалений
період”. Шифр теми: 17/11 Н-99.03, номер держреєстрації 0199U003595
(1999–2001 рр.). 2) “Провести верифікацію випадків лейкемій в учасників
ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС в Державному та спеціалізованих
реєстрах”. Шифр теми: 348, номер держреєстрації 0102U005687
(2002–2004 рр.). 3) “Розробка нових програм терапії гострих лейкемій та
мієлодиспластичного синдрому у хворих, які постраждали внаслідок аварії
на Чорнобильській АЕС, з урахуванням їх молекулярно-генетичних даних та
множинної медикаментозної резистентності”. Шифр теми: 378, номер
держреєстрації 0104U003631 (2004–2006 рр.).

Мета роботи. Визначити молекулярно-біологічні особливості субстратних
клітин у хворих на ГЛ, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, і
розробити стратегію диференційованого лікування, спрямовану на подолання
медикаментозної резистентності.

Завдання дослідження:

Вивчити клінічні прояви та клініко-гематологічні особливості ГМЛ і ГЛЛ в
учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій.

Дати формалізовану оцінку результатам лікування ГМЛ і ГЛЛ, які
розвинулись в опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС осіб.

Провести молекулярно-біологічні дослідження субстратних клітин хворих на
ГМЛ, які зазнали дії ІР, і визначити особливості патогенезу
радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу.

Установити особливості експресії транспортних протеїнів на лейкемічних
клітинах у хворих на ГМЛ і ГЛЛ, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, та
оцінити їх імовірне значення щодо формування стійкості пухлини до
цитостатичного лікування.

Дослідити експресію ключових про- і антиапоптозних молекул та визначити
ймовірний характер порушень шляхів реалізації запрограмованої клітинної
загибелі у відповідь на дію хіміотерапевтичних засобів за
радіаційно-асоційованих ГМЛ і ГЛЛ.

Визначити наявність у лейкемічних клітинах учасників ЛНА на ЧАЕС та
жителів радіоактивно забруднених територій, які захворіли на ГМЛ і ГЛЛ,
перспективних мішеней щодо дії цитостатичних засобів і проаналізувати
можливості цілеспрямованого лікування.

Інтегрувати дані молекулярно-біологічних, цитогенетичних та
імунофенотипових досліджень лейкемічних клітин хворих на
радіаційно-асоційовані ГЛ і оцінити їх значення для прогнозування
результатів цитостатичної терапії і стратифікації лікування.

Розробити стратегію лікування ГМЛ і ГЛЛ в учасників ЛНА на ЧАЕС і
жителів радіоактивно забруднених територій та аргументувати доцільність
її впровадження.

Об’єкт дослідження: гостра мієлоїдна лейкемія, гостра лімфобластна
лейкемія, мієлодиспластичний синдром в учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів
радіоактивно забруднених територій.

Предмет дослідження: цитоморфологічні, імунофенотипові,
молекулярно-біологічні та цитогенетичні характеристики лейкемічних
клітин, клініко-лабораторні показники, програми терапії
радіаційно-асоційованих ГЛ.

Методи дослідження: клініко-гематологічні, біохімічні, імунофенотипові,
молекулярно-біологічні, цитогенетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено особливості
радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу в осіб, опромінених
унаслідок аварії на ЧАЕС. Визначено, що радіаційно-асоційована ГЛ має
ознаки, які відмежовують її від спонтанної лейкемії. За результатами
комплексного дослідження продемонстровано, що ГЛ, які розвинулись в
учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій,
характеризуються своєрідністю клініко-гематологічної картини, а
результати їх лікування значно гірші, ніж такі за спонтанних ГМЛ і ГЛЛ.
Доведено, що попередній вплив ІР – значущий прогностичний фактор
перебігу і відповіді на лікування ГЛ. Уперше виявлено особливості
експресії факторів медикаментозної резистентності за
радіаційно-асоційованих лейкемій.

Уперше визначено, що стан організму в цілому і здатність хворого
перенести специфічну терапію більше впливають на перебіг захворювання та
відповідь на лікування спонтанних лейкемій ніж радіаційно-асоційованих,
за яких особливого значення набувають біологічні особливості власне
пухлинного процесу.

Одержано пріоритетні дані про патогенез радіаційно-асоційованого
лейкемічного процесу у разі ГМЛ. Визначено, що хромосомні транслокації,
які вважаються ознакою захворювань de novo і терапієзумовлених ГМЛ після
лікування інгібіторами ДНК топоізомерази II, не поширені серед пацієнтів
на ГМЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС. Наведено докази, що
спектр молекулярно-генетичних перебудов у разі радіаційних ГМЛ зміщений
у бік незбалансованих хромосомних аномалій, таких як втрати та набуття
генетичного матеріалу, з невипадково високою частотою делецій 5q і/або
7q та 7р. Отримано нові дані на користь існування асоціації між
специфічною аномалією хромосомного матеріалу – точковою мутацією гена
AML1 та радіаційною асоційованістю лейкемічного процесу. Установлено,
що, крім відмінних від спонтанних лейкемічних процесів патогенетичних
механізмів, фенотипових характеристик субстратних клітин,
радіаційно-асоційовані лейкемії характеризуються більш виразною
генетичною нестабільністю.

Обґрунтовано необхідність досліджень з удосконалення існуючої
класифікації ГЛ щодо виділення радіаційно-індукованих і
радіаційно-асоційованих випадків захворювання в окрему класифікаційну
категорію.

Визначено, що лейкемічний процес в учасників ЛНА і жителів радіоактивно
забруднених територій характеризується багатофакторністю медикаментозної
резистентності, яка включає своєрідність патогенезу, утягування в її
формування транспортних протеїнів, порушення реалізації процесів
апоптозу, генетичну нестабільність лейкемічного клону та нестачу
внутрішньоклітинних мішеней для спрямованого протипухлинного лікування.
У хворих на радіаційно-асоційовану ГЛ виявляються ознаки множинних
процесів та чинників, які зумовлюють нечутливість субстратних клітин до
цитостатичної терапії.

Аргументовано, що першочергові заходи щодо поліпшення результатів
лікування ГМЛ і ГЛЛ в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, мають
бути спрямовані на забезпечення адекватної цитостатичної терапії
індукції ремісії захворювання і терапії супроводу в достатньому обсязі.
Доведено необхідність внесення змін до стратегії лікування ГМЛ і ГЛЛ,
які розвинулись в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно
забруднених територій, і теоретично обґрунтовані напрямки її
удосконалення.

Практичне значення одержаних результатів. Відповідно до потреб
практичної охорони здоров’я запропоновано комплекс тестів, які мають
оптимізувати діагностику та прогнозування ГМЛ і ГЛЛ, на які хворіють
учасники ЛНА на ЧАЕС і жителі радіоактивно забруднених територій.
Визначено комплекс маркерів медикаментозної резистентності, які доцільно
досліджувати на етапах діагностики ГЛ у постраждалих.

Розроблено патогенетично-обгрунтовану стратегію лікування ГМЛ і ГЛЛ, які
розвинулись в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно забруднених
територій. Обґрунтовано доцільність використання алогенної
трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин (СГК) як необхідного
компонента терапії ГЛ в осіб, опромінених унаслідок Чорнобильської
катастрофи.

На підставі проведеного оцінювання особливостей МДС в опромінених осіб
показана можливість ранньої діагностики радіаційно-асоційованого
лейкемічного процесу (Пат. 32234 А Україна. Спосіб діагностики
некласифікованого варіанта мієлодиспластичного синдрому як передстадії
лейкемії у осіб, що зазнали дії іонізуючого опромінення / В.Г. Бебешко,
В.І. Клименко, І.С. Дягіль, Т.Ф. Любарець, Т.В. Каднікова,
С.В. Клименко; НЦРМ АМН України. – № 99010349; Заявл. 22.01.99; Опубл.
15.12.2000, Бюл. № 7-ІІ. – 3 c.).

Отримані дані використовуються в повсякденній клінічній діяльності
відділення гематології Клініки НЦРМ АМН України, відділення гематології
Головного військового клінічного госпіталю Міністерства оборони України,
відділення гематології ІІ Обласної клінічної лікарні м. Києва,
відділення гематології Житомирської обласної клінічної лікарні
ім. О.Ф. Гербачевського, а також у педагогічному процесі кафедри
радіології та кафедри гематології і трансфузіології Київської медичної
академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика Міністерства охорони
здоров’я України.

Особистий внесок здобувача. Дисертацію виконано у відділі гематології та
трансплантології (керівник – чл.-кор. АМН України, д.мед.н., проф.
В.Г. Бебешко), відділі клінічної імунології (керівник – д.мед.н., проф.
Д.А. Базика) Інституту клінічної радіології (ІКР) НЦРМ АМН України,
Інституті патології, Нойхерберг, Германія (керівник – доктор
М. Аткінсон). Здобувачеві належить ідея дисертаційної роботи. Автором
здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтовано
актуальність і необхідність дослідження, його мету і завдання,
сформовано групи спостереження, опрацьовано методики дослідження,
виконано молекулярно-біологічні обстеження хворих, включаючи
флуоресцентну in situ гібридизацію (FISH), полімеразну ланцюгову реакцію
(ПЛР), сіквенування ДНК, аналіз збалансованості геному за допомогою
генних чипів. Самостійно здійснено аналіз і зіставлення даних клінічних,
цитологічних, біохімічних, цитохімічних, гістологічних, імунологічних,
цитогенетичних, молекулярно-біологічних досліджень, оцінено результати
лікування, сформовано комп’ютерну базу даних, написано всі розділи
дисертації і сформульовано висновки. Імунофенотипові дослідження
проводили на базі відділу клінічної імунології ІКР НЦРМ АМН України
спільно з д.мед.н., проф. Д.А. Базикою, науковими співробітниками
О.Л. Мазниченко, Н.А. Голярник, зворотно транскриптазну ПЛР (ЗТ-ПЛР) –
спільно з провідним науковим співробітником відділу клінічної імунології
д.мед.н. І.В. Абраменко та молодшим науковим співробітником лабораторії
імуногенетики І.В. Дмитренко (керівник – д.б.н. Ж.М. Мінченко). Допомога
у проведенні диференційного G-фарбування препаратів хромосом та їх
аналізу надана науковим співробітником відділу гематології та
трансплантології Ж.А. Мішаріною, у визначенні поліморфізму конформації
однониткового ланцюжка ДНК гена р53 – доктором Н. Імамура із Інституту
радіаційної біології і медицини Університету Хіросіми (Японія), у
виготовленні та фотографуванні гістологічних препаратів – аспірантом
І.Н. Кабаченко.

Наукове співробітництво здійснювалось з доктором М. Роземанном, доктором
Я. Шміда та доктором К. Бінк із Інституту патології (Нойхерберг,
Германія), доктором Х. Цитцельсбергом із Інституту молекулярної біології
(Нойхерберг, Германія), проф. К.Р. Троттом із Інституту раку Грея
(Лондон, Велика Британія). Автор щиро вдячний керівникам та
співробітникам вищевказаних закладів за увагу до його досліджень і
допомогу.

Апробація результатів дисертації. Результати наукового пошуку
неодноразово обговорювались на практичних конференціях відділу
гематології та трансплантології ІКР НЦРМ АМН України (2004–2005 рр.), а
також викладені та обговорені на наукових форумах: 4-му Конгресі
Європейської асоціації гематологів (Барселона, Іспанія, 1999 р.); XVIII
з’їзді Польського товариства гематологів і трансфузіологів (Варшава,
Польща, 1999 р.); ІV з’їзді гематологів та трансфузіологів України
(Київ, 2001 р.); 6-му Міжнародному симпозіумі з мієлодиспластичного
синдрому (Стокгольм, Швеція, 2001 р.); науково-практичній конференції з
нагоди 15-річчя створення відділу клінічної імунології НЦРМ АМН України
(Київ, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції фахівців з
променевої терапії та радіаційної онкології (Чернігів, 2002 р.);
семінарі НАТО “Оцінка ризику наслідків аварії на Чорнобильській АЕС”
(Київ, 2002 р.); 8-му щорічному конгресі Європейської асоціації
гематологів (Ліон, Франція, 2003 р.); 7-му Міжнародному симпозіумі з
мієлодиспластичного синдрому (Париж, Франція, 2003 р.); 9-му щорічному
конгресі Європейської асоціації гематологів (Женева, Швейцарія,
2004 р.); конференції “Исследование рисков Чернобыльской катастрофы”
(Киев, 2004 р.); науково-практичній конференції “Сучасний стан
гематологічної служби в Україні” (Яремча, 2004 р.); конференції молодих
учених “Актуальні проблеми радіаційної медицини та радіобіології” (Київ,
2005 р.); Міжнародній науковій конференції з біохімії та молекулярної
біології, присвяченій пам’яті Я. Парнаса (Київ, 2005 р.); 10-му
щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Стокгольм, Швеція
2005 р.); ІІІ Міжнародному симпозіумі “Хроническое радиационное
воздействие: медико-биологические эффекты” (Челябінськ, Росія, 2005 р.);
Науково-практичній конференції “Гематология и трансфузиология:
фундаментальные и прикладные вопросы” (Київ, 2005 р.);
науково-практичній конференції “Актуальні проблеми гематології та
трансфузійної медицини” (Львів, 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 45 наукових праць:
статей у журналах – 23, статей у збірниках наукових праць – 2, розділів
у колективних монографіях – 2, тез доповідей на з’їздах та наукових
конференціях – 17. Одержано патент України на винахід. Із цієї кількості
у виданнях, що відповідають вимогам ВАК України, опубліковано 28
наукових праць.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 357 сторінках
друкованого тексту (282 сторінки основного тексту), ілюстровано 44
таблицями і 63 рисунками. Дисертація складається зі вступу, 9 розділів,
висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, який
містить 489 назв, і додатку.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Проведено аналіз клінічних проявів,
результатів лікування, клініко-гематологічних, імунофенотипових,
цитогенетичних, молекулярно-біологічних особливостей у 268 хворих на
ГМЛ, ГЛЛ та МДС, які маніфестували в період 1987–2005 рр. Захворювання
класифікували відповідно до Міжнародної статистичної класифікації
захворювань 10-го перегляду. У 187 хворих діагностовано ГМЛ (в тому
числі у 24 – ГМЛ із МДС), у 79 – ГЛЛ, у 2 – МДС. Дані про належність
хворих до категорій учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно
забруднених територій отримано з посвідчень потерпілих. Двоє хворих
перенесли у 1986 р. гостру променеву хворобу (ГПХ) І і ІІ ступеня
(поглинена доза 1,7 і 2,5 Зв відповідно). Пухлинний процес класифікували
як радіаційно-асоційований на підставі опублікованих даних про
ретроспективну дозиметрію учасників ЛНА та жителів радіоактивно
забруднених територій (В.В. Чумак, С.В. Шолом, 1999; Likhtarev et al.,
1994; 2002). “Радіаційна асоційованість” як характеристика вказує на те,
що лейкемія розвинулась у особи, яка зазнала дії ІР в дозах вищих за
фонові. Згідно безпорогової концепції реалізації стохастичних ефектів
дії радіації на організм людини (UNSCEAR, 2000), серед пацієнтів з
радіаційно-асоційованими лейкеміями існує частка хворих, у яких розвиток
захворювання ініційований опроміненням внаслідок Чорнобильської
катастрофи. У разі екстраполяції розрахунків Mettler та співавт. (1990)
ризику надлишкових випадків лейкемії після дії ІР на людину, можна
припустити, що 40% лейкемій в учасників ЛНА 1986-1987 рр. індуковані
дією радіаційного випромінювання, спричиненого Чорнобильською
катастрофою. Саме патогенетичні та фенотипові особливості, притаманні
радіаційно-індукованій ГЛ, могли визначити відмінності всієї групи
хворих з радіаційно-асоційованими захворюваннями від групи пацієнтів зі
спонтанними лейкемічними процесами. Спонтанними, або de novo, вважали
лейкемії, щодо яких не існувало відомостей про асоціацію розвитку
патологічного процесу з попередньою дією будь-якого канцерогенного
фактору.

Основну групу склали 133 хворі на радіаційно-асоційовані лейкемічні
процеси, а саме: 70 учасників ЛНА та 63 мешканці радіоактивно
забруднених територій. До контрольної групи ввійшли 132 пацієнти зі
спонтанною ГЛ. Окремо розглядали двох хворих на терапієзумовлену, після
лікування інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ, ГМЛ, і одного хворого на
ГЛЛ, яка розвинулась після лікування астроцитоми із застосуванням
рентгенівських променів. Вік на момент верифікації діагнозу в пацієнтів
основної і контрольної груп коливався від 16 до 80 років у кожній.
Середній вік хворих на радіаційно-асоційовані лейкемічні процеси
становив 46,1 року (95% довірчий інтервал, ДІ 43,1–49,0), пацієнтів із
спонтанними захворюваннями – 40,8 року (95% ДІ 37,6–44,1). Хворі
основної групи були старішими (р<0,005), але кількість осіб віком понад 60 років у групах не відрізнялась (р=0,58). Серед хворих контрольної групи порівняно з основною було більше осіб жіночої статі (р<0,005). Не виявлено різниці у розподілі за статтю між контрольною групою та підгрупою мешканців забруднених радіонуклідами територій, яку формували 32 особи жіночої статі та 31 – чоловічої (р=0,73), але вона була очевидною в порівнянні з підгрупою учасників ЛНА, яка містила 8 осіб жіночої статі та 63 – чоловічої (р<0,0001). Хоча стать не вважається істотним прогностичним фактором перебігу лейкемічного процесу, визначена особливість розподілу є важливою ознакою, яка відображає демографічну своєрідність всієї когорти учасників ЛНА. Для вирішення завдань роботи виконували ряд досліджень, зокрема: – аналіз клінічних даних: анамнезу, об’єктивного обстеження з констатацією клінічних проявів хвороби, показників результатів лікування; – аналіз клініко-гематологічних даних, зокрема цитоморфологічного дослідження крові і кісткового мозку з підрахунком лейкограми і мієлограми у паноптично забарвлених за Романовським–Гімзе препаратах, гістологічного дослідження трепанобіоптатів кісткового мозку, біохімічного дослідження крові (лактатдегідрогеназа, ЛДГ); – імунологічне фенотипування клітин кісткового мозку або периферичної крові з визначенням експресії Р-глікопротеїну, MRP, LRP, CD95, BCL-2, BAX, BCL-XL, p53 та топоізомерази ІІ? за допомогою проточної цитофлуориметрії; – цитогенетичні дослідження: каріотипування клітин кісткового мозку за методикою диференційного G-фарбування; дослідження інтерфазних ядер і метафазних пластинок методом FISH з пробами AML1/ETO, MLL, BCR/ABL, Cyclin D1/CEP11 та CEP8; – молекулярно-біологічні дослідження: ПЛР ампліфікацію ДНК генів AML1, Flt3; визначення поліморфізму конформації однониткового ланцюжка ДНК гена р53; визначення транскриптів AML1/ETO, MLL/AF4 і MLL/AF9 методом ЗТ-ПЛР; дослідження поліморфізму рестрикції продукту ПЛР кодону D835 гена Flt3; клонування продукту ПЛР екзону 8 гена AML1; флуоресцентне сіквенування екзонів 3–8 гена AML1, JD домену і кодону D835 гена Flt3; аналіз збалансованості геному за допомогою генних чипів; – статистичний аналіз: t-тест, (2-тест, тест Фішера, кореляційний і регресійний аналізи, методи Каплана-Мейера, Сімона і Лі, процедуру Мантеля. В табл. 1 наведено основні методи дослідження і кількісні характеристики об’єму виконаних робіт. Таблиця 1 Використані в роботі методи дослідження і виконаний об’єм робіт Метод дослідження Об’єм дослідження Аналіз клінічних та клініко-гематологічних даних 268 хворих Імунологічне фенотипування з визначенням детермінант ММР 662 дослідження Цитогенетичні дослідження каріотипування 2 дослідження експерименти з FISH 124 дослідження Молекулярно-біологічні дослідження ампліфікація ДНК і візуалізація продуктів ПЛР 439 реакцій визначення поліморфізму конформації ДНК 18 досліджень ЗТ-ПЛР 75 досліджень дослідження поліморфізму рестрикції продукту ПЛР 158 досліджень клонування продукту ПЛР 3 експерименти сіквенування ДНК 48 досліджень аналіз геному за допомогою генних чипів 19 досліджень РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ, їх Аналіз і узагальнення Клініко-гематологічні особливості та результати лікування радіаційно-асоційованої ГМЛ. Для визначення клінічних і клініко-гематологічних особливостей радіаційно-асоційованих лейкемічних процесів аналізували медичну документацію 82 хворих на ГМЛ основної та 70 – контрольної групи. ГМЛ в учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій частіше, ніж ГМЛ у контрольній групі, була представлена промієлоцитарним морфологічним варіантом (у 11 із 82 проти 3 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,05) і рідше мала морфологію М4ео (у жодного із 82 проти 8 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,005). Кількість осіб із ГМЛ, віднесених до інших категорій Франко-американо-британської (ФАБ) класифікації, у групах хворих із спонтанними та радіаційно-асоційованими лейкеміями не розрізнялась. Розвитку ГМЛ серед осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, частіше передував МДС – у 18 із 82 випадків проти 6 із 70 випадків за спонтанної ГМЛ (р<0,05). Високою частотою мієлодиспластичної передфази радіаційно-асоційована ГМЛ нагадує вторинні лейкемії, які індуковані алкілуючими агентами. Лімфаденопатія, спленомегалія, гепатомегалія, екстрамедулярні ураження та важкий геморагічний синдром як ініціальні ознаки лейкемічного процесу зареєстровано в групах осіб із спонтанною та радіаційно-асоційованою ГМЛ однаковою мірою. Однак клінічна картина захворювання у пацієнтів, які зазнали дії ІР, частіше характеризувалась наявністю інфекційного процесу під час маніфестації (у 13 із 82 проти 1 із 70 випадків в групі контролю, p<0,05). Загальний стан хворих основної групи в цілому був більш тяжким. В істотно більшої частини осіб із радіаційно-асоційованою ГМЛ, порівняно з пацієнтами контрольної групи, загальний статус за шкалою ВООЗ оцінено більше, ніж у 2 бали (у 11 із 82 проти 3 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,05). Кожний п’ятий хворий на ГМЛ серед осіб, опромінених унаслідок Чорнобильської катастрофи, мав протипоказання до проведення інтенсивної хіміотерапії індукції ремісії (16 із 82 випадків проти 2 із 70 в групі контролю, p<0,05). Істотні розбіжності між групами хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ в кількості осіб, яким може бути призначена адекватна специфічна хіміотерапія, заздалегідь зменшує шанси постраждалих на довготривале загальне і безрецидивне виживання. Серед хворих на ГМЛ, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, рівень ЛДГ частіше перевищував значення у 500 од/л, яке вважається верхньою межею нормативних показників (у 19 із 24 випадків проти 15 із 29 в групі контролю, p<0,05). В осіб із радіаційно-асоційованою ГМЛ нижчими, ніж в контрольній групі, були ініціальні показники периферичної крові щодо кількості еритроцитів (2,49 * 1012/л проти 2,71 * 1012/л відповідно, р<0,05) і вмісту гемоглобіну (75,6 г/л проти 83,9 г/л відповідно, р<0,05), істотно більша частина хворих потребувала трансфузій еритроцитарної маси у зв’язку зі зниженням рівня гемоглобіну менше 80 г/л (51 із 82 проти 29 із 70 осіб відповідно, р<0,05). Інші показники периферичної крові в групах не розрізнялись. Кількість хворих, у яких визначили хоча б один із найбільш значущих факторів несприятливого прогнозу, зокрема вік понад 60 років, розвиток ГМЛ із МДС і кількість лейкоцитів у периферичній крові більше 30 * 109/л під час маніфестації захворювання, становила 49 (60%) і 27 (39%) осіб з радіаційно-асоційованою та спонтанною ГМЛ відповідно (р<0,05). Варте уваги те, що не визначено очікуваного для спонтанних лейкемій позитивного кореляційного зв’язку між віком понад 60 років та розвитком ГМЛ із МДС і/або ініціальним лейкоцитозом у хворих, які зазнали дії ІР (r=0,08; р=0,48). Результати лікування і відповідь на цитостатичну терапію проаналізовано у 150 пацієнтів – 81 та 69 хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ відповідно. Результати лікування оцінювали згідно із загальноприйнятими критеріями (Cheson et al., 1990). Медіана виживання для хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ склала 99 днів, пацієнтів зі спонтанною ГМЛ – 407 днів. Розбіжність у загальному виживанні між групами у логранковому тесті була статистично значущою (р<0,0001). Імовірність дворічного виживання в групі хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ становила 13% (95% ДІ 8–18%), у хворих контрольної групи – 30% (95% ДІ 23–37%). Група пацієнтів із радіаційно-асоційованою ГМЛ була неоднорідною щодо радіаційного анамнезу. Розрахований за процедурою Мантеля тренд у загальному виживанні для хворих контрольної групи та, окремо, учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів забруднених радіонуклідами територій (зокрема й евакуйованих із зони відчуження) був статистично значущим (р<0,0005, критерій (2, рис. 1). Визначено статистичну значущість розбіжності в загальному виживанні між учасниками ЛНА та жителями забруднених радіонуклідами територій (р<0,05). Рис. 1. Загальне виживання хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ: 1 – група хворих на спонтанну ГМЛ; 2 – група хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ; 3 – жителі забруднених радіонуклідами територій з ГМЛ; 4 – учасники ЛНА на ЧАЕС з ГМЛ. Оцінюючи виживання без урахування радіаційного фактора осіб різної статі, віку і пролікованих з різною інтенсивністю з’ясовано, що жоден інший фактор не набував такої значущості, як радіаційний. Виявлено достовірне збільшення загального виживання хворих, які отримували адекватне лікування, порівняно з пацієнтами, яких лікували недостатньо інтенсивно (р<0,05). За відсутності різниці в інтенсивності індукції ремісії, результати лікування пацієнтів, у яких не було протипоказань до проведення стандартної терапії (128 осіб) в основній і контрольній групах істотно відрізнялись. Повної ремісії досягли лише 4 із 64 хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ (проти 31 із 64 осіб контролю, p<0,0001). Крім того, в осіб, які зазнали дії ІР, ГМЛ частіше, порівняно з пацієнтами на спонтанну лейкемію, представлена резистентними до стандартного цитостатичного лікування формами (43 із 64 проти 23 із 64 випадків відповідно, p<0,001). Проведений у 128 пацієнтів кореляційний аналіз дозволив визначити, що факт резистентності асоціювався з неадекватністю індукційної терапії (r=0,29, р<0,005). Частота ранніх смертей в обох групах була однаково високою (17 із 64 проти 10 із 64 випадків відповідно, р=0,19). У 128 хворих на ГМЛ вона була істотно вищою від очікуваної за даними літературних джерел (Giles et al., 2002) (21% проти 10% відповідно, р<0,05). Забезпечення пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГМЛ адекватною дезінтоксикаційною, антибактеріальною, антимікотичною, замісною терапією слід вважати необхідним заходом для проведення хіміотерапії в повному обсязі та зменшення пов’язаної з нею летальності. Окремо проведено аналіз загального виживання та результатів лікування хворих на гостру промієлоцитарну лейкемію (ГПЛ). Підтверджуючи визначені раніше тенденції, загальне виживання в логранковому тесті у пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГПЛ виявилось істотно коротшим, ніж у хворих з ГПЛ в контрольній групі (р<0,05). Порівнюючи результати лікування в групі пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГПЛ, установлено, що загальне виживання пролікованих повністю трансретіноєвою кислотою (АТRA) було більш тривалим, ніж пацієнтів, які отримували тільки цитостатики (р<0,05). Можна стверджувати, що попередній вплив ІР є значним прогностичним фактором перебігу лейкемічного процесу і припустити, що відзначені клініко-гематологічні особливості та незадовільні результати лікування відображають патогенетичну своєрідність радіаційно-асоційованих випадків ГМЛ. Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин хворих на ГМЛ, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. До початку дослідження не було однозначних доказів існування асоціації між специфічними аномаліями хромосомного матеріалу при ГМЛ, МДС і попередньою дією ІР. Найбільш перспективними для детального вивчення визначено перебудови хромосоми 21q22 з утягуванням гена AML1 і хромосоми 11q23 з утягуванням гена MLL (Hromas et al., 2000; 2001; Bloomfield et al., 2002; Harada et al., 2003; 2004). Зразки субстратних клітин 53 хворих на ГМЛ аналізували щодо наявності аномалій гена AML1 за допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР. На відміну від Hromas та співавт. (2000; 2001), у хворих на ГМЛ, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, не визначено незвичайних перебудов локусу AML1 з утягуванням інших, крім гена ETO, транслокаційних партнерів. Цитогенетичні перебудови з утягуванням AML1 методом FISH зареєстровано статистично частіше серед пацієнтів контролю (у 5 із 16 осіб), ніж серед хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ (у жодної з 21 особи, р<0,05). Прогностично сприятливу транслокацію AML1/ETO за допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР виявлено в одного із 24 хворих на ГМЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, але цю аномалію за спонтанної ГМЛ ідентифіковано значно частіше (p<0,05) – в 9 із 29 випадків. В 17% зразків транслокацію AML1/ETO визначали паралельно двома методами – FISH і ЗТ-ПЛР. Розбіжностей між результатами, отриманими різними методиками, не було в жодному з випадків. Зазначимо, що частота транслокації AML1/ETO, зареєстрована в контрольній групі, збігається з відзначеною при ГМЛ серед мешканців західних регіонів Росії (Frenkel et al., 1997; А.Г. Сергеев и соавт., 2000) і є дещо вищою, ніж серед захворілих на ГМЛ у країнах Західної Європи та Північної Америки (Haferlach et al., 2004). Високий рівень транслокації AML1/ETO за спонтанної ГМЛ в українській і російській когортах може відображати особливості східноєвропейської популяції в цілому. Пацієнти, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, рідко належать до сприятливої категорії ГМЛ, що характеризується транслокацією AML1/ETO. Найкращий результат лікування ГМЛ у разі наявності транслокації AML1/ETO досягається за використання високих доз цитозару на етапі консолідації ремісії захворювання (Astrom et al., 2000). Зменшення частки пацієнтів, очікувано чутливих до цитозару у високих дозах, значно знижує шанси опромінених хворих на виліковування методом стандартної хіміотерапії і спонукає до застосування інтенсивних схем терапії, які ґрунтуються на процедурах трансплантації СГК, протоколів клінічних випробувань перспективних лікувальних заходів. Результати пошуку мутацій гена AML1 при МДС та ГМЛ, які розвинулись із МДС, в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, у цьому дослідженні виявились дещо відмінними від отриманих Harada та співавт. (2003; 2004). Однак вони підтверджують гіпотезу про те, що найбільш імовірною окремою молекулярно-біологічною подією, яка призводить до розвитку радіаційно-індукованих лейкемічних процесів, є точкова мутація гена AML1. В жодному із 6зразків субстратних клітин , проаналізованих шляхом сіквенування послідовності ДНК, не виявлено змін AML1 із заміною окремого нуклеотиду, але виявлено всередині гена раніше не описану в літературних джерелах точкову мутацію – дуплікацію гексануклеотидної послідовності у пацієнта з МДС, який переніс ГПХ унаслідок аварії на ЧАЕС. Всі мутації у тих, хто пережив атомне бомбардування, знайдено в runt домені. Японські автори вважали, що наявність мутації гена AML1 в регіоні карбоксильного (C)-кінця тісно корелює зі спорадичною природою МДС (Harada et al., 2004). В цьому дослідженні точкову мутацію AML1 виявлено в домені активації транскрипції карбоксильного (C)-кінця безпосередньо за амінокислотним залишком 368 у реконвалесцента ГПХ з іще більшою, порівняно з хворими японської когорти, імовірністю радіаційної індукованості захворювання. Поглинута доза пацієнта становила 1,7 Гр і, згідно з епідеміологічними даними щодо розвитку лейкемій у ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС (Ivanov et al., 1997), імовірність радіаційної природи МДС у нього перебільшувала 90%. За допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР нами проведено дослідження субстратних клітин 61 хворого щодо перебудов гену MLL. Його результати свідчать, що транслокації MLL, які характерні для спонтанних і зумовлених терапією інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ ГМЛ (Mrozek et al., 2004), не є поширеними за радіаційно-асоційованих лейкемій. Статистичним аналізом не виявлено жодних відмінностей між хворими на радіаційно-асоційовану ГМЛ і хворими на спонтанну лейкемію щодо транслокацій (жодного із 23 проти 1 із 18 випадків відповідно, р=0,44) і будь-яких перебудов (1 із 23 проти 1 із 18 випадків відповідно, р=1,0) гена MLL, виявлених за допомогою FISH експериментів. Подальший аналіз було обмежено вивченням частоти найбільш поширених за ГМЛ транслокацій MLL. Додатково проведено скринінг наявності химерних генів MLL/AF4 і MLL/AF9 за допомогою ЗТ-ПЛР. Сумуючи результати FISH та ЗТ-ПЛР, частоту транслокацій MLL/AF4 і MLL/AF9 оцінено у 61 особи, зокрема 27 хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ, 32 – на спонтанну та 2 – на терапієзумовлену, після лікування інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ. Частота транслокацій в усіх хворих на ГМЛ становила 3,3% (у 2 із 61 хворого) і відповідала літературним даним про поширеність подібних аномалій в неселекціонованих групах пацієнтів (Schoch et al., 2003). Не знайдено жодної транслокації MLL/AF4 і MLL/AF9 MLL у хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ, по одній виявлено у пацієнтів на спонтанну та терапієзумовлену лейкемію відповідно. Таким чином, не отримано доказів, що транслокації MLL мають істотне значення в лейкемогенезі в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧЕАС. Більше того, слід вважати, що радіаційно-асоційована лейкемія цитогенетично відрізняється від такої, що розвинулась внаслідок терапевтичного застосування інгібіторів ДНК топоізомерази ІІ і характеризується невипадковими транслокаційними перебудовами локусу MLL. Проте отримані дані підтримують гіпотезу (Appelbaum  et al., 1996; Smith et al., 2003), які вважають, що ІР діє на клітини подібно багатьом пошкоджуючим ДНК речовинам, і за наслідками генотоксичного впливу схожа на алкілуючі агенти. Імовірно тому єдиною перебудовою гена MLL за радіаційно-асоційованої ГМЛ у цьому дослідженні була дуплікація MLL у хворої, евакуйованої після Чорнобильської катастрофи із м. Прип’ять. Дуплікація гена MLL, визначена за допомогою FISH, супроводжувалась й одночасною ампліфікацією гена cyclin D1. Ампліфікацію гена cyclin D1 часто спостерігають за негоджкінських лімфом, але щодо ГМЛ таку аномалію раніше не описували. Аберантна активація двох патологічних шляхів – одного, який утягує регулятор активації генів гемопоезу MLL, і другого, який через cyclin D1 опосередковує прогресію клітинного циклу, – може характеризувати процес радіаційного лейкемогенезу в описаної хворої. У радіаційному лейкемогенезі в осіб, постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС, важливу роль можуть відігравати втрати і набуття хромосомного матеріалу. Цілком слушно, що в цьому випадку радіаційний слід у розвитку радіаційно-індукованої лейкемії неможливо описати однією аномалією, а лише класом схожих подій, як то дуплікація нуклеотидної послідовності гена AML1, дуплікація гена MLL, ампліфікація гена cyclin D1 тощо. Це твердження підтримують дані про зменшення серед опромінених хворих частини осіб з аномаліями каріотипу інших цитогенетичних категорій, наприклад транслокаціями. Засобом, який використано для перевірки цієї гіпотези, став аналіз збалансованості геному за допомогою генних чипів. Аналіз кількості копій хромосом за допомогою генних чипів проведено у 19 пацієнтів з ГМЛ. Обстежено 13 учасників ЛНА на ЧАЕС і 6 жителів забруднених радіонуклідами територій. Результати, отримані під час аналізу гібридизації зразків ДНК субстратних клітин на генні чипи, містили в кожному випадку ідентифікатори 10 043 нуклеотидів поліморфізму. Аналізували втрати та набуття хромосомного матеріалу, які за розмірами могли бути ідентифікованими методом каріотипування диференційно G-фарбованих хромосом. Такий підхід застосовано з огляду на те, що досліджували лише хворих основної групи – з радіаційно-асоційованою ГМЛ. Порівняння проводили з даними літератури про частоту хромосомних аномалій за спонтанної ГМЛ, визначених методом каріотипування диференційно G-фарбованих хромосом. Втрати та набуття хромосомного матеріалу ідентифіковано в 11 із 19 випадків. У 6 випадках спостерігалась наявність 3 і більше хромосомних аномалій – ознака комплексного аберантного каріотипу. Надзвичайно високою виявилась частота делецій довгого плеча хромосоми 5 та довгого і короткого плечей хромосоми 7. Принаймні одну з таких аномалій зафіксовано у 8 із 19 проаналізованих випадків. Частота делецій 5q та/або 7p і 7q у хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ виявилась суттєво вищою (р<0,05) порівняно з очікуваною за даними літературних джерел щодо спонтанної ГМЛ (Slovak et al., 2002; Schoch et al., 2004). Можна стверджувати, що за наслідком генотоксичного впливу іонізуюче випромінювання подібне до алкілуючих агентів. Ці препарати ініціюють ГМЛ з невипадково високою частотою делецій хромосом 5 і 7 (Thirman, Larson, 1996). Крім того, делеції довгого плеча хромосоми 5 і одного з плеч хромосоми 7 у разі ГМЛ за даними групи Schoch (2004) є ознакою надзвичайно несприятливого, рефрактерного до цитостатичних засобів лейкемічного процесу. Вважається, що єдиний шлях курації таких хворих – щонайшвидше проведення неспорідненої алогенної трансплантації СГК без сподівань на досягнення ремісії за стандартного цитостатичного лікування (De Witte et al., 2002; Pulsoni, Pagano, 2005). Ініціальну хіміотерапію в такому разі варто розглядати як циторедуктивну. Фактори медикаментозної резистентності за радіаційно-асоційованої ГМЛ. Медикаментозна резистентність може формуватися внаслідок змін різних етапів дії цитостатичного препарату і стосуватися проникнення лікарського засобу в клітину, його метаболізму, внутріклітинних мішеней препарату, механізмів клітинної репарації та здібності клітини розпізнавати цитотоксичний вплив і входити в апоптоз. За допомогою проточного цитофлуориметра проведено аналіз експресії транспортних протеїнів, зокрема Р-глікопротеїну (Р-gp), MRP (білок множинної медикаментозної резистентності) та LRP (білок легеневої резистентності) на субстратних клітинах у 52 хворих на ГМЛ; молекул апоптозу, зокрема CD95, BAX, BCL-XL, BCL-2 та р53 – у 56 хворих (табл. 2). Субстратні клітини пацієнтів із радіаційно-асоційованою ГМЛ частіше були позитивними на Р-глікопротеїн, ніж хворих зі спонтанним захворюванням. Визначено асоціацію гіперекспресії Р-глікопротеїну з резистентністю лейкемічного клону до цитостатичної терапії (r=0,47, р<0,05) у пацієнтів, які зазнали дії ІР внаслідок аварії на ЧАЕС. Однак аналіз загального виживання показав, що різниці в його тривалості між хворими з Р-глікопротеїн позитивними і негативними лейкеміями не існувало ні в усіх 52 пацієнтів, ні окремо в групах дослідження. Цілком імовірно, що більша акумуляція хіміотерапевтичного засобу в лейкемічних клітинах за Р-глікопротеїн негативності супроводжується більш інтенсивним розпадом субстратних клітин пухлини, ніж за антиген позитивності, і призводить до більш загрозливих для життя хворого електролітних порушень та інтоксикації. Як наслідок, перевага щодо можливості досягти повної ремісії у пацієнтів з Р-глікопротеїн негативною лейкемією у разі неадекватності супровідної терапії урівноважується підвищеною ранньою летальністю, що, в свою чергу, зумовлює відсутність переваги у загальному виживанні перед пацієнтами з Р-глікопротеїн позитивною лейкемією. Факт ранньої смерті позитивно корелював із Р-глікопротеїн негативністю субстратних клітин пацієнта за радіаційно-асоційованої ГМЛ (r=0,56, р<0,01). Отже, визначення експресії Р-глікопротеїну можна вважати важливим щодо стратифікації не тільки цитостатичної терапії, але й терапії супроводу. Не виявлено відмінностей між групами хворих на ГМЛ щодо експресії LRP і MRP. Таблиця 2 Показники експресії транспортних протеїнів і молекул апоптозу за радіаційно-асоційованої та спонтанної ГМЛ Показник Радіаційно-асоційована ГМЛ Спонтанна ГМЛ р Р-gp позитивні/негативні випадки, n 12/8 9/23 <0,05 Середня кількість Р-gp+ клітин, % 30,6±11,0 15,0±6,3 <0,01 LRP позитивні/негативні випадки, n 2/18 3/29 1,0 Середня кількість LRP+ клітин, % 8,5±10,2 9,1±8,0 0,93 МRP позитивні/негативні випадки, n 1/19 1/31 1,0 Середня кількість МRP+ клітин, % 8,0±10,1 2,4±1,8 0,17 CD95 позитивні/негативні випадки, n 12/9 30/5 <0,05 Середня кількість CD95+ клітин, % 56,2±21,0 82,5±12,0 <0,05 BAX позитивні/негативні випадки, n 1/20 0/35 0,38 Середня кількість BAX+ клітин, % лейкемічних клітин 4,58±3,73 1,45±1,09 <0,05 BCL-XL позитивні/негативні випадки, n 3/18 4/31 1,0 Середня кількість BCL-XL+ клітин, % 8,69±6,57 8,02±5,04 0,87 BCL-2 позитивні/негативні випадки, n 12/9 6/29 <0,005 Середня кількість BCL-2+ клітин, % 45,2±18,9 18,8±11,3 <0,05 р53 позитивні/негативні випадки, n 1/20 1/34 1,0 Середня кількість р53+ клітин, % 3,28±3,89 3,28±2,75 0,84 Лейкемічні клітини пацієнтів з ГМЛ, які зазнали дії іонізуючого випромінювання, статистично частіше експресували антиапоптозний онкопротеїн BCL-2 (12 із 21 проти 6 із 35 випадків відповідно, p<0,005) і рідше – потрібний для ініціації запрограмованої клітинної загибелі проапоптозний рецептор CD95 (12 із 21 проти 30 із 35 випадків відповідно, p<0,05). Твердження про те, що субстратні клітини за радіаційно-асоційованої ГМЛ частіше, ніж за спонтанної є негативними щодо експресії CD95 або позитивними – щодо експресії BCL-2 за результатами багатомірного аналізу мало ще більшу статистичну значущість (p<0,001). Більше того, в разі радіаційно-асоційованої ГМЛ частіше спостерігався асинхронізм експресії BCL-2 та CD95. Позитивність на BCL-2 у поєднанні з негативністю на CD95 виявлено у 4 із 21 учасників ЛНА і постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС і в жодного – серед 35 осіб контрольної групи (p<0,05). Мала вибірка пацієнтів у цій роботі не дає змоги відповісти на питання чи призвели, власне, наведені особливості експресії апоптоз-асоційованих молекул до погіршення результатів лікування ГМЛ. Проведений аналіз визначив лише тренди до скорочення загального виживання осіб з BCL-2 позитивними порівняно з BCL-2 негативними, CD95 негативними порівняно з CD95 позитивними ГМЛ, які не досягли статистичної значущості. Крім того, субстратні клітини хворих, у яких розвитку радіаційно-асоційованої ГМЛ передував МДС, частіше були позитивними на BCL-2 (r=0,3, р<0,05) ніж ті, у яких захворювання виникло без мієлодиспластичної передфази. Набуття клітинами експресії BCL-2 може визначати еволюцію пухлинного клону. Із гістограм (рис. 2) видно, як перехід захворювання в учасника ЛНА на ЧАЕС із МДС у ГМЛ супроводжувався зміною BCL-2 негативності субстратних клітин на BCL-2 позитивність. Рис. 2. Гістограми експресії CD95 (FAS) та BCL-2 на клітинах бластного регіону учасника ЛНА на ЧАЕС на різних етапах еволюції пухлинного клону – під час верифікації діагнозу МДС рефрактерна анемія з надлишком бластів (зліва) і під час верифікації діагнозу ГМЛ, М2 (справа). Показники експресії іншого антиапоптозного регулятора – BCL-XL у пацієнтів, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, і хворих без радіаційного анамнезу суттєво не відрізнялись. Щодо проапоптозного протеїну BAX констатовано більшу середню частку експресуючих клітин у групі хворих з радіаційно-асоційованою ГМЛ порівняно з пацієнтами зі спонтанним захворюванням (див. табл. 2). Але зареєстровано лише один випадок з гіперекспресією BAX і частота гіперекспресії протеїну в групах була порівнюваною. Частота визначення гіперекспресії білка р53 в основній та контрольній групах за ГМЛ не відрізнялась (див. табл. 2). Методом проточної цитофлуориметрії виявляється переважно патологічний білок, який значно стабільніший на відміну від нормального р53. Основною причиною, яка призводить до змін білка і відповідно – його гіперекспресії, є мутація гена р53. Тому для збільшення статистичної потужності дослідження зроблено комбінований аналіз результатів визначення патологічного білка р53 і мутацій однойменного гена. Скринінг мутацій в екзонах 5–9 гена р53 здійснено із залученням зразків субстратних клітин 18 пацієнтів із радіаційно-асоційованим захворюванням – 6 учасників ЛНА на ЧАЕС та 12 жителів радіоактивно забруднених територій. Загалом частота виявлення мутацій р53 та патологічного протеїну р53 склала 4 із 39 випадків у групі осіб із радіаційно-асоційованою ГМЛ і 1 із 35 випадків – у контрольній групі. Різниця при порівнянні груп не набула статистичної значущості (р=0,35). Частота виявлення мутацій р53 та патологічного протеїну р53 за радіаційно-асоційованої та спонтанної ГМЛ в цьому дослідженні суттєво не відрізнялась і від очікуваних, згідно даних літературних джерел (Preudhomme, Fenaux, 1997) показників для ГМЛ de novo. Суттєвим фактором формування медикаментозної резистентності субстратних клітин у хворих на лейкемії може бути антиапоптозний регулятор bcr/abl – білок, який синтезується внаслідок транслокації bcr/abl. Наявність аномалій генів BCR та ABL досліджували методом інтерфазної FISH у зразках субстратних клітин 33 пацієнтів з ГМЛ. Обстежено 13 осіб основної групи – 6 учасників ЛНА на ЧАЕС і 7 жителів радіоактивно забруднених територій з радіаційно-асоційованою ГМЛ та 20 хворих групи контролю зі спонтанним захворюванням. Транслокацію bcr/abl у хворих на ГМЛ в цьому дослідженні виявлено з високою частотою і визначено в 5 із 33 пацієнтів. Наприклад, у дослідженні Paietta та співавт. (1998) частота аномалії в групі із 776 хворих на ГМЛ становила лише 0,9%. Однак не виключено, що спонтанний рівень аномалії за ГМЛ у східноєвропейській популяції хворих значно вищий. Порівнянням частоти аномалії в основній групі з такою у групі хворих на спонтанну ГМЛ визначено різницю на межі статистичної значущості (у 4 із 13 проти 1 із 20 випадків відповідно, р=0,07). Однак у хворих на ГМЛ – учасників ЛНА на ЧАЕС, які зазнали більш значної дії ІР порівняно з рештою хворих в дослідженні, транслокацію bcr/abl визначено у 3 із 6 осіб, достовірно частіше, ніж серед пацієнтів контрольної групи (в 1 із 20 випадків, р<0,05). Висока частота транслокації bcr/abl за радіаційно-асоційованої лейкемії та її несприятливе прогностичне значення спонукають до застосування в лікуванні препарату іматініб – специфічного інгібітора тирозинкіназної активності. Для проведення диференційного діагнозу між хронічною мієлоїдною лейкемією (ХМЛ) і ГМЛ в осіб, що зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, потрібно використовувати комплекс клінічних, цитологічних, цитогенетичних, молекулярно-біологічних та імунофенотипових досліджень. Мішені дії протилейкемічних препаратів у субстратних клітинах хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ. Серію експериментів у цій роботі було спрямовано на визначення потенційних мішеней цитостатичних препаратів для лікування радіаційно-асоційованих ГЛ. Аналіз експресії ДНК топоізомерази ІІ( за допомогою проточної цитофлуориметрії проведено на зразках субстратних клітин 55 хворих на ГМЛ – 21 на радіаційно-асоційовану та 34 – на спонтанну лейкемію. Показники експресії ферменту в групах не відрізнялись. Різниці в частоті позитивності субстратних клітин на топоізомеразу ІІ( між хворими на радіаційно-асоційовану ГМЛ та пацієнтами зі спонтанним захворюванням не відзначено (0 із 21 та 2 із 34 випадків відповідно, р=0,52). У хворих з позитивною експресією ферменту не виявлено переваг щодо загального виживання. Особливості експресії топоізомерази ІІ( на лейкемічних клітинах пацієнтів, які зазнали дії іонізуючого випромінювання під час аварії на ЧАЕС, таким чином, не є істотним фактором, що визначає незадовільні результати лікування радіаційно-асоційованих ГМЛ. ? Oe >

@

B

Z

]„yya$

Z

?

?

?

?

?

Oe

&

`„?

?’?¬??®eeaaaaaaaaaaaaaaaaaaUUI

&

¤x`„Aa$

`„A

dha$

dh`„Aa$

< D ? ? u a e B, використання інгібіторів рецептора для лікування лейкемій є багатообіцяльним (Kottaridis et al., 2001; Schnittger et al., 2002). Мутаційний статус гена FLT3 аналізували за допомогою ПЛР у 117 хворих на ГМЛ. Обстежено 69 пацієнтів основної групи, серед яких 35 учасників ЛНА на ЧАЕС і 34 жителі радіоактивно забруднених територій з радіаційно-асоційованою ГМЛ та 48 хворих групи контролю зі спонтанною ГМЛ. Частота внутрішніх тандемних подвоєнь FLT3 за ГМЛ виявилась меншою порівняно з очікуваною за даними літературних джерел, як у разі радіаційно-асоційованих (у 7 із 69 пацієнтів), так і в разі спонтанних випадків (у 9 із 48 хворих). Мутації в кодоні D835 активаційної петлі гена FLT3 виявлено у 1 із 69 хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ і у 3 із 48 – зі спонтанною ГМЛ. Статистичної різниці щодо наявності аномалій FLT3 при порівнянні частоти в основній групі з контрольною не визначено. Загалом, мутації FLT3 всіх видів за радіаційно-асоційованої ГМЛ визначено у 8 із 69 пацієнтів (11,6%), з частотою суттєво меншою (р<0,05) порівняно з частотою (30%) в великих групах неселекціонованих хворих на ГМЛ в інших дослідженнях (Yamamoto et al., 2001; Thiede et al., 2002). Отримані результати дозволяють припустити, що мутації гена FLT3 не мають істотного значення в радіаційному лейкемогенезі. Christiansen і Pedersen-Bjergaard (2001) також відзначили низьку частоту мутацій FLT3 за вторинної, терапієзумовленої ГМЛ. Усі передбачені шляхом сіквенування ДНК послідовності пептидів мутантних рецепторів FLT3 за наявності внутрішніх тандемних подвоєнь його JM домену мали повторювану послідовність – тетрапептид аргінін–глютамін–тиронін-глютамін. У пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГМЛ, порівняно із хворими на спонтанну лейкемію, дуплікації зазнали фрагменти JM домену FLT3 більшого розміру. У всіх осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, у разі внутрішнього тандемного подвоєння визначалась хоча б одна алель з дуплікацією послідовності, більшої за 60 пар нуклеотидів. Питання щодо значущості наявності повторюваного мотиву амінокислот та більшої довжини подвоєних ділянок гена за радіаційно-асоційованої лейкемії потребує подальшого вивчення. Важливий висновок, який отримано під час дослідження гена FLT3 – це те, що через рідкісні зміни рецептора FLT3 обмежуються можливості проведення сучасної терапії ГМЛ в опромінених осіб, яка базується на застосуванні його інгібіторів. Але найважливіше полягає в такому. Наявність мутації FLT3 зазвичай тісно корелює з нормальним каріотипом лейкемічних клітин (Schnittger et al., 2002). З огляду на це, низька частота мутацій FLT3 за радіаційно-асоційованої ГМЛ наводить на думку, що досліджені учасники ЛНА та жителі радіоактивно забруднених територій характеризуються наявністю інших, невизначених хромосомних аберацій. Це підтверджує висунуту нами гіпотезу та зроблені в дослідженні висновки про зміщення спектра цитогенетичних і молекулярно-біологічних ознак радіаційно-асоційованих і радіаційно-індукованих випадків ГЛ у бік втрат і набуття хромосомного матеріалу. Саме за такого сценарію в опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС має спостерігатись низька частота мутацій FLT3. Крім того, у разі дуплікації гена лейкемічні процеси в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, непропорційно частіше характеризуються наявністю множинних мутантів. У 10 випадках зафіксовано наявність однієї додаткової смуги (алелі), в 6 випадках – двох і навіть трьох смуг над сигналом нормальної алелі JM домену гена Flt3. Серед пацієнтів з внутрішнім тандемним подвоєнням в JM домені гена, множинні алелі знаходили істотно частіше за радіаційно-асоційованої ГМЛ, ніж за спонтанної (5 із 7 проти 1 із 9 випадків, p<0,05). Цей факт є вагомим доказом на користь того, що ГМЛ в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, характеризується клональною гетерогенністю вже на момент первинної діагностики лейкемічного процесу і підтримує припущення про те, що радіаційно-асоційована ГМЛ частіше, порівняно з лейкемічним процесом de novo, має ознаки генетичної нестабільності. Існування в момент маніфестації, або швидке набуття під час еволюції захворювання декількох лейкемічних клонів, які зазвичай характеризуються дещо відмінними біологічними ознаками, проліферативним потенціалом і стійкістю до хіміопрепаратів, зменшує шанси на успіх стандартної цитостатичної терапії і ускладнює її проведення. Доведено (Kottaridis et al., 2001), що кількісна характеристика мутантів FLT3 за класифікаційною схемою – жодного мутанта, один мутант, більше ніж один мутант, може з успіхом замінити класифікаційну прогностичну схему – мутація є, мутації немає, оскільки більш потужно визначає прогноз щодо рецидивування лейкемічного процесу та безрецидивного виживання. Хворі на ГМЛ з більше ніж однією мутацією FLT3 характеризуються значно вищим рівнем смертності в ремісії та коротшим загальним виживанням (Kottaridis et al., 2001). Клініко-гематологічні особливості та результати лікування радіаційно-асоційованої ГЛЛ. Аналізували медичну документацію 37 хворих із радіаційно-асоційованою ГЛЛ і 29 осіб зі спонтанною. Лімфаденопатія, спленомегалія, гепатомегалія, екстрамедулярні ураження, важкий геморагічний синдром у групах осіб зі спонтанною та радіаційно-асоційованою ГЛЛ виявлялись однаковою мірою. Клінічна картина захворювання як у пацієнтів, які зазнали дії ІР, так і у хворих контрольної групи не відрізнялась щодо загального стану та наявності інфекційного процесу під час маніфестації ГЛЛ та протипоказань до проведення інтенсивної хіміотерапії. Порівнюваним був в основній та контрольній групах і розподіл за морфологічними варіантами ФАБ класифікації. Статистичні відмінності між показниками периферичної крові визначено щодо частки пацієнтів з рівнем тромбоцитів, меншим за 30 * 109/л, яка становила серед ліквідаторів наслідків аварії 5 із 19 осіб і була значно більшою, ніж в осіб контролю (1 із 29 випадків, p<0,05), та жителів забруднених радіонуклідами територій (жодного із 18 випадків, p<0,05). Середній вміст бластних клітин в периферичній крові ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС був значно вищим (p<0,05), ніж хворих на спонтанну ГЛЛ. Інші показники периферичної крові в групах осіб із спонтанною та радіаційно-асоційованою ГЛЛ не відрізнялись. Рівень ЛДГ у сироватці крові визначали у 8 хворих, які зазнали дії ІР, та у 8 пацієнтів контролю. У контрольній групі рівень ЛДГ становив у середньому 456 од/л (95% ДІ 337–576 од/л) і був меншим, ніж серед пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГЛЛ (1074 од/л, 95% ДІ 725–1424 од/л, p<0,005). Серед осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, рівень ЛДГ частіше (у 8 із 8 проти 3 із 8 випадків в контрольній групі, p<0,05) перебільшував значення у 500 од/л, яке вважається верхньою межею нормативних показників. Із досліджуваних факторів несприятливого прогнозу жоден не реєстрували частіше в групі хворих зі спонтанною ГЛЛ. За радіаційно-асоційованої ГЛЛ істотно частіше ніж за спонтанної відзначали не тільки рівень ЛДГ, вищий за 500 од/л, але й вищий за 1000 од/л (у 5 із 8 проти жодного із 8 випадків, p<0,05). Результати лікування досліджено у 64 пацієнтів. Основну групу склали 35 хворих на радіаційно-асоційовану ГЛЛ, контрольну групу – 29 хворих на спонтанну ГЛЛ. Аналіз загального виживання продемонстрував істотні розбіжності в тривалості між хворими на ГЛЛ, які мали в анамнезі відомості про дію радіаційного фактора внаслідок аварії на ЧАЕС, та тими, у яких ГЛЛ виникла спонтанно. Медіана виживання для хворих із радіаційно-асоційованою ГЛЛ склала 293 дні, для пацієнтів із спонтанною ГЛЛ – 807 днів. Імовірність п’ятирічного виживання в групі хворих із радіаційно-асоційованою ГЛЛ становила 19,9% (95% ДІ 10,5–23,3%), у хворих контролю – 30,9% (95% ДІ 16,4–45,4%). Розбіжність у загальному виживанні між двома групами у логранковому тесті була статистично значущою (p<0,05). Під час порівняння загального виживання в трьох серіях хворих визначено, що загальне виживання було найкоротшим у ліквідаторів, проміжним – у евакуйованих та мешканців забруднених радіонуклідами територій і найдовшим – у хворих на спонтанну ГЛЛ. Медіана виживання становила 140, 489 та 807 днів відповідно. Розрахований тренд у загальному виживанні залежно від відношення до однієї із трьох серій був статистично значущим (p<0,05, критерій (2). За однакової інтенсивності цитостатичної терапії повну ремісію досягали частіше в разі спонтанної ГЛЛ (22 із 28 осіб проти 14 із 30 хворих основної групи, p<0,05). Отримані в роботі дані щодо клініко-гематологічних особливостей, результатів лікування радіаційно-асоційованих лейкемій свідчать про необхідність досліджень з удосконалення існуючої класифікації лейкемій. Констатовано систематичну, в багатьох клініках України редукцію загальновизнаних доз препаратів аспарагінази під час лікування ГЛЛ. За аналізом проведених схем терапії стає очевидним, що із впровадженням у клінічну практику пегелірованої форми аспарагінази і пов’язаним з цим зменшенням частоти ускладнень, значно рідше спостерігається обґрунтоване, а в ряді випадків і з надмірної остороги, переривання курсу терапії препаратами аспарагінази, як це було в разі застосуванні звичайних її форм. Кількість хворих, яким виконано повний курс індукційної хіміотерапії при застосуванні пег-аспарагінази, була істотно більшою порівняно із хворими, які отримували інші форми аспарагінази (5 із 5 проти 7 із 32; p<0,005). Детермінанти медикаментозної резистентності та мішені дії протилейкемічних препаратів за радіаційно-асоційованої ГЛЛ. Аналіз експресії транспортних протеїнів (Р-глікопротеїну, MRP та LRP), молекул апоптозу (CD95, BAX, BCL-XL, BCL-2 та р53), мішені дії протипухлинних препаратів – ДНК топоізомерази ІІ( проведено методом проточної цитофлуориметрії на зразках субстратних клітин 19 хворих, у яких діагностовано ГЛЛ за період з 2001 по 2005 рік. Обстежено 10 хворих основної та 9 – контрольної групи. Субстратні клітини лише одного хворого (контрольна група) розцінено як позитивні щодо експресії Р-глікопротеїну. Лейкемія в жодного з пацієнтів не була MRP позитивною. Помірну позитивність щодо експресії LRP у діапазоні 20–50% клітин демонстрували 2 учасники ЛНА на ЧАЕС. Групи хворих на радіаційно-асоційовану і спонтанну ГЛЛ не відрізнялись відносно позитивності субстратних клітин на Р-глікопротеїн, MRP або LRP. Таким чином, експресія Р-глікопротеїну, MRP1 та LRP на лейкемічних клітинах хворих з ГЛЛ, які зазнали дії іонізуючого випромінювання внаслідок Чорнобильської катастрофи, не є істотним фактором, який визначає незадовільні результати їх лікування, а регуляцію рівню експресії транспортних протеїнів, що опосередковують один із механізмів ММР, не слід розглядати за перспективний напрямок лікування радіаційно-асоційованих ГЛЛ. За даними дослідження експресія регуляторів запрограмованої загибелі клітин – CD95, p53, BAX, BCL-2 та BCL-XL, не розмежовує радіаційно-асоційовані та спонтанні випадки ГЛЛ, але у відношенні інгібіторів апоптозу – BCL-2 та BCL-XL, може бути істотною причиною формування стану медикаментозної резистентності, а модуляція функції цих протеїнів – перспективним напрямком покращення результатів лікування ГЛЛ в цілому. В жодного хворого не визначено гіперекспресії р53 або BAX, субстратні клітини лише в одного були негативними щодо експресії CD95. Однак гіперекспресію антиапоптозних протеїнів BCL-2 або BCL-XL визначено у 6 із 10 хворих, які зазнали дії ІР, та у 5 із 9 хворих контрольної групи. Роботами інших дослідників доведена здатність BCL-2 та BCL-XL визначати резистентність клітин до дії цитостатичних засобів (Pallis et al., 1997; Scaffidi et al., 1998). Можна припустити, що механізми ММР, які пов’язані з порушенням апоптозу за рахунок гіперекспресії BCL-2 та BCL-XL, є універсальними і трапляються за ГЛЛ любої етіології з порівнюваною частотою. Різниці в частоті позитивності субстратних клітин на топоізомеразу ІІ( між хворими із радіаційно-асоційованою ГЛЛ та пацієнтами зі спонтанним захворюванням не відзначено (2 із 10 та 0 із 9 випадків відповідно, р=0,47). Транслокацію bcr/abl за ГЛЛ виявлено у 2 із 5 пацієнтів. Один із хворих отримував в процесі лікування іматініб – інгібітор тирозинкінази bcr/abl, застосування якого виявилось надзвичайно ефективним і важливим щодо вирішення клінічної ситуації. При дослідженні методом ПЛР 35 хворих на ГЛЛ єдиною зареєстрованою мутацією гену FLT3 було внутрішнє тандемне подвоєння у жителя забруднених радіонуклідами територій. Статистичної різниці у відношенні наявності аномалій FLT3 за ГЛЛ під час порівняння частоти в основній групі з контрольною не визначено. В учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно забруднених територій з ГЛЛ дотепер не відзначено специфічних факторів резистентності, що відмежовували б їх від спонтанних лейкемій та спонукали б до формування суттєво відмінної від процесів de novo стратегії лікування. У цій ситуації особливе значення в якості компонента хіміотерапії набувають препарати аспарагінази, оскільки діють на позаклітинну мішень – аспарагін, яка не залежить від молекулярно-біологічних характеристик лейкемічних клітин і механізмів ММР. Виснаження аспарагіну в позаклітинному просторі в разі лікування аспарагіназою діє на пухлинну клітину універсально. Узагальнення даних з метою формування стратегії лікування раліаційно-асоційованої ГЛ. З урахуванням молекулярно-біологічної своєрідності, патогенезу радіаційно-асоційованих лейкемічних процесів, особливостей експресії молекул, які визначають медикаментозну резистентність, розроблено стратегію лікування хворих на ГЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС. Принциповим заходом щодо покращення лікування ГМЛ і ГЛЛ в учасників ЛНА та жителів забруднених радіонуклідами територій, який не пов’язаний з характеристиками пухлинного процесу, є забезпечення адекватної цитостатичної терапії індукції ремісії захворювання та терапії супроводу в достатньому обсязі. Відомо, що зниження дози цитостатичних препаратів на 20% в програмах хіміотерапії веде до зменшення ефективності лікування на 50% (Devita, 1997). Інтенсифікація хіміотерапії до загальновизнаних стандартів є першочерговим кроком терапевтичної стратегії, що пропонується. І для основної і для контрольної груп характерною була неадекватність терапії супроводу. Забезпечення пацієнтів адекватною дезінтоксикаційною, антибактеріальною, антимікотичною, замісною терапією слід вважати необхідним заходом для проведення хіміотерапії в повному обсязі та зменшення пов’язаної з нею летальністю. Розроблені пропозиції щодо стратегії лікування ГМЛ і ГЛЛ в учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій зображені на рис. 3 і 4. Важливим результатом роботи стало доведення, що прогностично сприятлива транслокація AML1/ETO трапляється за радіаційно-асоційованої ГМЛ рідше, ніж за спонтанної. Це суттєво обмежує можливості стандартного цитостатичного лікування постраждалих і є аргументом на користь необхідності застосування в лікуванні алогенної трансплантації СГК. В учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій порівняно з особами контрольної групи за ГМЛ частіше траплявся морфологічний варіант М3 і рідше – М4ео, які асоціюються з транслокаціями PML/RAR-alpha і CBFb/MYH11 відповідно (Haferlach et al., 2004) і потребують стратифікованого лікування. У випадку ГМЛ М3 з PML/RAR-alpha необхідно застосовувати ATRA, у разі М4ео з CBFb/MYH11 – стандартну хіміотерапію із використанням високих доз цитозару на етапі консолідації ремісії, а за відсутності такої транслокації – алогенну трансплантацію СГК. Рис. 3. Стратегія лікування ГЛЛ в осіб, постраждалих унаслідок аварії. Примітки: 1. (*) включає ГЛЛ сommon типу, пре-В варіант, Т-ГЛЛ, при числі лейкоцитів менше 30 * 109/л, відсутності транслокацій t(9;22), t(4;11); 2. (**) – ранній пре-В варіант, білінійний ГЛЛ, ранній Т-ГЛЛ, при числі лейкоцитів більше 30 * 109/л, наявності транслокацій t(9;22), t(4;11); 3. (#) – деталі програми наведені у (Hoelzer, 2001). Рис. 4. Стратегія лікування ГМЛ у осіб, постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС. З урахуванням відзначеної поширеності перебудов геному, особливості розподілу варіантів захворювання за ФАБ класифікацією, в комплекс тестів обстеження хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ, крім морфоцитохімічного дослідження та імунофенотипування, необхідно включати дослідження каріотипу за допомогою G-фарбування хромосом та визначення молекулярно-біологічних особливостей пухлинних клітин, а саме: транслокацій PML/RAR-alpha, AML1/ETO та CBFb/MYH11 за допомогою ЗТ-ПЛР та FISH. За первинної діагностики радіаційно-асоційованої ГЛ з маркерів ММР доцільно визначати експресію Р-глікопротеїна, BCL-2 та FAS у разі ГМЛ, BCL-2 та BCL-XL – у разі ГЛЛ, наявність транслокації bcr/abl при ГМЛ і ГЛЛ. Лейкемічні процеси у опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС характеризуються багатофакторністю медикаментозної резистентності, яка включає своєрідність патогенезу, утягування в її формування транспортних протеїнів, порушення реалізації процесів апоптозу, генетичну нестабільність лейкемічного клону та нестачу мішеней для спрямованого протипухлинного лікування. У пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГЛ відзначаються ознаки множинних і конкурентних процесів та чинників, які зумовлюють нечутливість субстратних клітин до цитостатичної терапії. Тому, у разі неможливості стратифікувати хворого з радіаційно-асоційованою ГЛ відповідно до результатів аналізу каріотипу та молекулярно-біологічних особливостей субстратних клітин щодо групи ризику, його слід розглядати як пацієнта групи несприятливого прогнозу захворювання. Особливості формування стану медикаментозної резистентності, його багатофакторний характер, молекулярно-біологічні характеристики субстратних клітин за радіаційно-асоційованих лейкемій спонукають розглядати алогенну трансплантацію СГК як необхідний компонент стратегії лікування. Зважаючи на несприятливі перспективи досягнення повної ремісії під час лікування радіаційних лейкемій із застосуванням стандартних програм хіміотерапії, ініціальна стандартна хіміотерапія може позиціонуватись як циторедуктивна перед здійсненням алогенної трансплантації СГК і не мати за мету обов’язкове досягнення повної ремісії. За відсутності у пацієнта прогностичних маркерів сприятливої відповіді на стандартну хіміотерапію, таких як транслокації AML1/ETO, PML/RAR-alpha та CBFb/MYH11 за ГМЛ, та неможливості здійснити алогенну трансплантацію СГК, хворих з радіаційно-асоційованою ГЛ слід розглядати як першочергових кандидатів на включення до протоколів клінічних випробувань нових методів лікування. Перспективними можна вважати регуляцію рівнів експресії молекул апоптозу і Р-глікопротеїну, використання інгібіторів рецепторів тирозин кіназ і антисмислових олігонуклеотидів. Висока частота транслокації BCR/ABL за радіаційно-асоційованої ГЛ та її несприятливе прогностичне значення спонукають до визначення доцільності та доведення ефективності застосування в лікуванні препарату іматініб. В табл. 3 узагальнено дані дослідження щодо відносної частоти визначення в субстратних клітинах пацієнтів основної та контрольної груп ознак активності механізмів медикаментозної резистентності, які опосередковують молекули апоптозу, транспортні протеїни, наявності мішеней протипухлинних препаратів. Наведені дані окреслюють перспективи модуляції факторів ММР та використання цілеспрямованої терапії для покращення лікування хворих на спонтанні та радіаційно-асоційовані ГМЛ і ГЛЛ і мають раціоналізувати подальший пошук шляхів удосконалення лікування ГЛ. Таблиця 3 Відносна частота визначення в субстратних клітинах молекул, асоційованих з ММР, наявності мішеней протипухлинних препаратів Молекули, асоційовані з ММР, та мішені протипухлинної терапії ГМЛ ГЛЛ Радіаційно-асоційована Спонтанна Радіаційно-асоційована Спонтанна Р-глікопротеїн +++ ++ – – MRP – – – – LRP + + – – CD95 ++ + – – BAX – – – – p53 + – – – BCL-2 +++ + ++ + BCL-XL + + + ++ BCR/ABL ++ – ++ – ДНК топоізомераза ІІ – – – – FLT3 з мутацією + + – – Примітка. Відносну частоту визначення в субстратних клітинах пацієнтів на ГМЛ і ГЛЛ факторів ММР, наявності мішеней протипухлинних препаратів, яка вказує на відносну пріоритетність проведення досліджень з їх модуляції та розробки відповідної цілеспрямованої терапії, позначено шкалою від (–) до (+++), де (–) означає найменшу, а (+++) – найбільшу частоту і пріоритет. Підсумовуючи наведені вище дані зазначимо, що вивчення багатоетапного патогенезу радіаційно-асоційованих ГМЛ і ГЛЛ, подій, які змінюють баланс між клітинною проліферацією та загибеллю, формують при індукованих радіацією захворюваннях стан медикаментозної резистентності слід продовжувати. Накопичення знань щодо шляхів формування патологічного процесу дозволить в подальшому модифікувати терапевтичні цілі та стратегії лікування, уточнити діагностичні маркери та корисні індикатори прогнозу радіаційно-індукованих лейкемій. ВИСНОВКИ На основі комплексного вивчення результатів лікування, клініко-гематологічних, молекулярно-біологічних особливостей, факторів медикаментозної резистентності радіаційно-асоційованих лейкемій наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми щодо оптимізації тактики лікування ГМЛ і ГЛЛ у осіб, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС. Одержано пріоритетні дані про патогенез пухлинного процесу, особливості фенотипових характеристик субстратних клітин, своєрідність перебігу ГЛ у разі радіаційної асоційованості захворювання, розроблено стратегію лікування ГМЛ і ГЛЛ, що розвинулись в учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій. Показано, що ГЛ в учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій характеризується своєрідністю клініко-гематологічної картини. ГМЛ в опромінених осіб частіше, ніж спонтанний лейкемічний процес, представлена промієлоцитарним морфологічним варіантом (М3 за ФАБ класифікацією). За радіаційно-асоційованих ГМЛ і ГЛЛ частіше, ніж у разі спонтанних реєструється підвищений рівень ЛДГ, а за ГМЛ – й інші фактори несприятливого прогнозу перебігу захворювання, зокрема розвиток із МДС, наявність інфекційного процесу та трансфузійна залежність під час маніфестації захворювання. Порівняльний аналіз свідчить, що результати лікування хворих на ГЛ – учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій – істотно відрізняються від таких у разі спонтанних випадків захворювання тривалістю виживання та відповіддю на терапію. Хворі на радіаційно-асоційовані ГМЛ і ГЛЛ рідше досягають повної морфологічної ремісії та характеризуються коротшим загальним виживанням, ніж пацієнти зі спонтанними лейкеміями. Гостра мієлоїдна лейкемія у осіб, які зазнали дії ІР, частіше представлена резистентними до цитостатичного лікування формами захворювання. Встановлено, що лейкемічний процес у осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, характеризується багатофакторністю медикаментозної резистентності, яка включає своєрідність патогенезу, утягування в її формування транспортних протеїнів, порушення регуляції апоптозу, генетичну нестабільність лейкемічного клону та нестачу мішеней для спрямованого протипухлинного лікування. У пацієнтів відзначаються ознаки множинних процесів та чинників, які зумовлюють нечутливість субстратних клітин до цитостатичної терапії. З’ясовано, що спектр молекулярно-біологічних ознак радіаційно-асоційованих випадків ГМЛ зміщений у бік втрат і набуття хромосомного матеріалу з невипадково високою частотою делецій 5q і/або 7q та 7р. Перспективним окремим кандидатом на роль маркера радіаційно-індукованого лейкемічного процесу є точкова мутація гена AML1. Доведено, що транслокації з утягуванням генів AML1 і MLL не є розповсюдженими при лейкемії, що виникла в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, а транслокація AML1/ETO зустрічається за радіаційно-асоційованої ГМЛ рідше, ніж за спонтанної. Показано, що лейкемічні клітини у пацієнтів з ГМЛ, які зазнали дії іонізуючого випромінювання внаслідок аварії на ЧАЕС, частіше, ніж у разі захворювання, що виникло спонтанно, гіперекспресують Р-глікопротеїн. Гіперекспресія Р-глікопротеїну асоціюється з резистентністю лейкемічного клону до цитостатичної терапії. Р-глікопротеїн негативність у разі неадекватності супровідної терапії ГМЛ не зумовлює перевагу щодо загального виживання відносно хворих з гіперекспресією Р-глікопротеїну через підвищену ранню летальність. Встановлено, що лейкемічний процес у осіб, опромінених унаслідок аварії, характеризується порушенням експресії регуляторів апоптозу. За радіаційно-асоційованої ГМЛ частіше, ніж за спонтанній, визначається гіперекспресія антиапоптозного протеїну BCL-2 і негативність щодо експресії проапоптозного рецептора CD95. Значною причиною формування стану медикаментозної резистентності у хворих на радіаційно-асоційовану ГЛЛ слід вважати поширену гіперекспресію інгібіторів апоптозу BCL-2 та BCL-XL. Доведено, що субстратні клітини в учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій, хворих на ГЛ, з високою частотою виявлення є bcr/abl позитивними. Радіаційно-асоційована ГМЛ характеризується транслокацією bcr/abl непропорційно частіше від спонтанної.  Отримані докази, що мутації гена FLT3 не відіграють істотної ролі в лейкемогенезі при розвитку ГМЛ і ГЛЛ в осіб, постраждалих унаслідок Чорнобильської катастрофи, а рецептор FLT3 не може бути перспективною мішенню для лікування радіаційно-асоційованої лейкемії. У разі дуплікації гена FLT3 ГМЛ у опромінених осіб непропорційно частіше, ніж за спонтанної лейкемії, характеризується наявністю множинних мутантів, що свідчить про генетичну нестабільність пухлини.   Особливості формування стану медикаментозної резистентності, його багатофакторний характер, молекулярно-біологічні характеристики субстратних клітин хворих на радіаційно-асоційовані ГЛ – учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій – спонукають більшість із них відносити до групи високого ризику.  Запропоновано стратегію лікування постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС, згідно якої за відсутності у пацієнта прогностичних маркерів сприятливої відповіді на стандартну хіміотерапію та неможливості здійснити алогенну трансплантацію СГК, хворих на радіаційно-асоційовану ГЛ слід розглядати як першочергових кандидатів на включення до протоколів клінічних випробувань перспективних методів лікування. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ У комплекс обстеження хворих на радіаційно-асоційовану ГЛ, крім морфоцитохімічного дослідження та імунофенотипування, необхідно включати дослідження каріотипу за допомогою G-фарбування хромосом та визначення молекулярно-біологічних особливостей пухлинних клітин, зокрема транслокацій PML/RAR-alpha, AML1/ETO, bcr/abl та CBFb/MYH11 за допомогою ЗТ-ПЛР та FISH. При формулюванні діагнозу ГМЛ чи ГЛЛ, яка розвинулась в опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС осіб, крім морфологічного та імунологічного варіанта, наявних молекулярно-біологічних ознак і каріотипу слід вказувати, що процес є радіаційно-асоційованим. З урахуванням високої частоти виявлення транслокації bcr/abl у пацієнтів з ГМЛ і ГЛЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, для проведення диференційного діагнозу між ГЛ і ХМЛ потрібно використовувати комбінацію клінічних, цитологічних, цитогенетичних, молекулярно-біологічних та імунофенотипових досліджень. Першочергові заходи щодо поліпшення результатів лікування ГМЛ і ГЛЛ в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, мають бути спрямованими на забезпечення адекватної цитостатичної терапії індукції ремісії захворювання і терапії супроводу в достатньому обсязі. Алогенну трансплантацію СГК слід розглядати як потрібний компонент стратегії лікування учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій, хворих на ГЛ. Зважаючи на несприятливі перспективи щодо досягнення повної ремісії під час лікування радіаційно-асоційованих лейкемій із застосуванням стандартних програм індукції ремісії, ініціальна хіміотерапія може позиціонуватись як циторедуктивна перед здійсненням трансплантації. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Бебешко В.Г., Клименко В.И., Дягиль И.С., Билько Н.М., Коваленко А.Н., Клименко С.В., Радчук З.В., Оберенко О.А., Любарец Т.Ф., Крячок И.А., Кадникова Т.В., Зотиков Л.А., Михайловская Э.В., Юхимук Л.Н., Коваль А.И., Червякова Е.В., Шолойко В.В.  Гематологические эффекты среди населения Украины, пострадавшего в результате катастрофы на Чернобыльской АЭС // Медицинские последствия аварии на Чернобыльской атомной станции: В 3 кн. / МЧС Украины, АМН Украины, Научный центр радиационной медицины. – К.: “МЕДЭКОЛ” МНИЦ БИО-ЭКОС, 1999. – Кн. 2: Клинические аспекты Чернобыльской катастрофы / Под ред. В.Г. Бебешко, А.Н. Коваленко. – С. 98–134. Здобувачем проведено клініко-гематологічне обстеження, аналіз онкогематологічної патології в осіб, які перенесли ГПХ унаслідок аварії на ЧАЕС. Bebeshko V.G., Klymenko V.I., Dyagil I.S., Bilko N.M., Kovalenko A.N., Klymenko S.V., Radchuk Z.V., Oberenko O.A., Lubarets T.F., Kryachok I.A., Kadnikova T.V., Zotikov L.A., Mikhailovskaya E.V., Yukhimuk L.N., Koval A.I., Chervyakova E.V., Sholoiko V.V.  Hematological effects among Ukrainian population suffered from the Chornobyl accident // Health effects of Chornobyl accident: Monograph in 4 parts / Ed. by A. Vozianov, V. Bebeshko, D. Dazyka. – Kyiv: DIA, 2003. – P. 104–128. Здобувач приймав участь у клініко-гематологічному обстеженні хворих, аналізі онкогематологічної патології в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, дослідженні мутаційного статусу гену р53. Клименко В.І., Любарець Т.Ф., Дягіль І.С., Бурвалова Г.І., Клименко С.В., Черв’якова О.В., Каднікова Т.В.  Особливості перебігу некласифікованого мієлодиспластичного синдрому у осіб, які зазнали дії комплексу факторів Чорнобильської катастрофи // Зб. наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. – 1999. – Вип. 8, кн. 1. – С. 154–158. Здобувач виконував клініко-гематологічне обстеження хворих, аналіз особливостей радіаційно-асоційованого МДС. Клименко В.И., Любарец Т.Ф., Коваленко А.Н., Клименко С.В.  Миелодиспластический синдром: рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами // Эксперим. онкология. – 1999. – Т. 20, № 2. – С. 157–159. Здобувачем проведено аналіз захворюваності на ГЛ та МДС в осіб, які перенесли ГПХ. Бебешко В.Г., Мінченко Ж.М., Цвєткова Н.М., Кучер О.В., Крячок І.А., Клименко С.В.  Проблеми трансплантації кісткового мозку в Україні // Трансплантологія. – 2001. – Т. 2, № 1. – С. 16–22. Здобувачем здійснено аналіз світового досвіду в галузі трансплантології, сформульовано схеми лікування хворих на онкогематологічні захворювання з використанням процедури трансплантації СГК. Бебешко В.Г., Клименко С.В. Биологические особенности и клиническое течение вторичных лейкемий // Онкология. – 2002. – Т. 4, № 3. – С. 217–224. Здобувач приймав участь в аналізі стану проблеми вторинних лейкемій, дослідженні мутаційного статусу гену р53 при ГЛ у постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС, написанні статті. Клименко С.В. Рекомбинантный эритропоэтин в лечении миелодиспластического синдрома // Укр. журнал гематол. та трансфузіол. – 2003. – Т. 3, № 6. – С. 8–15. Бебешко В.Г., Клименко С.В. Мутации FLT3 при острых миелоидных лейкемиях // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2004. – Т. 4, № 1. – С. 5–10. Здобувачем проаналізовано світовий досвід вивчення мутаційного статусу гена FLT3 при ГМЛ, досліджено внутрішні тандемні подвоєння гена FLT3 при лейкеміях у постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС, написано статтю. Клименко С.В., Тротт К.Р., Аткинсон М.Дж., Базыка Д.А., Дубровина Г.В., Роземанн М.  Мутации гена AML1 при миелодиспластических синдромах и острых миелоидных лейкемиях у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2004. – Т. 4, № 2. – С. 20–23. Здобувачем проведено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема ПЛР, сіквенування ДНК, порівняльний аналіз отриманих даних з даними японських дослідників, написано статтю.  Бебешко В.Г., Клименко С.В. Результаты лечения острых миелоидных лейкемий у больных, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации вследствие аварии на Чернобыльской АЭС // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2004. – Т. 4, № 3. – С. 13–18. Здобувачем заплановано та організовано дослідження, опрацьовано архівний матеріал щодо хворих на ГМЛ із заповненням комп’ютерної бази даних, проведено аналіз і синтез матеріалу, написано статтю.  Клименко С.В. Клініко-лабораторні особливості гострих мієлоїдних лейкемій у хворих, які зазнали дії іонізуючої радіації внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС // Медичні перспективи. – 2004. – Т. ІХ, № 3. – С. 109–113.  Бебешко В.Г., Клименко С.В. Лечение острой промиелоцитарной лейкемии // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2004. – Т. 4, № 6. – С. 19–25. Здобувачем проаналізовано методи лікування ГПЛ, викопійовано архівні дані щодо хворих на ГПЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, проаналізовано результати їх лікування, написано статтю.  Клименко С.В., Імамура Н., Клименко В.І. Мутації гену р53 при радіаційно-асоційованих гострих мієлоїдних лейкеміях // Галицький лікарський вісник. – 2004. – Т. 11, № 4. – С. 28–31. Здобувачем зібрано зразки лейкемічних клітин для молекулярно-біологічних досліджень, проаналізовано клінічні данні та результати лікування радіаційно-асоційованої ГЛ в залежності від мутаційного статусу гену р53, написано статтю.  Клименко С.В., Бебешко В.Г., Тротт К.Р., Базыка Д.А., Аткинсон М., Роземанн М.  Мутации гена FLT3 при острых миелоидных лейкозах // Онкология. – 2004. – Т. 6, № 4. – С. 269–272. Здобувачем зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема ПЛР, визначення поліморфізму рестрикції продуктів ампліфікації, аналіз і синтез отриманих даних, написано статтю.  Клименко С.В. Аналіз клініко-лабораторних особливостей гострих лімфобластних лейкемій у хворих, які зазнали дії іонізуючої радіації внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС // Архів клінічної медицини. – 2004. – № 2. – С. 23–25.  Бебешко В.Г., Мінченко Ж.М., Дмитренко І.В., Кучер О.В., Цвєткова Н.М., Крячок І.А., Мішаріна Ж.А., Клименко С.В., Хоменко В.І. Клінічне значення молекулярних маркерів пухлинних клонів у пацієнтів з гострими лейкеміями при проведенні трансплантації кісткового мозку // Трансплантология. – 2004. – Т. 6, № 2. – С. 61–65. Здобувачем проведено аналіз результатів трансплантації кісткового мозку, клінічного значення молекулярних маркерів пухлинних клонів, підготовлено ілюстративний матеріал.  Клименко С.В., Бебешко В.Г., Базика Д.А., Аткінсон М., Роземанн М.  Внутрішні тандемні повторення та мутації кодону D835 гену FLT3 при гострих лімфобластних лейкеміях у постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології: Зб. наук. пр. – К., 2004. – Вип. 10. – С. 152–157. Здобувачем зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема ПЛР, визначення поліморфізму рестрикції продуктів ампліфікації ДНК, аналіз і синтез отриманих даних, написано статтю.  Клименко С.В., Каднікова T.В., Дубровіна Г.В., Коваленко О.М., Базика Д.А., Бебешко В.Г.  Аміфостін в лікуванні гострих лейкемій і мієлодиспластичного синдрому // Медичні перспективи. – 2004. – Т. ІХ, № 4. – Р. 79–82. Здобувачем організовано дослідження, проведено лікування хворих із використанням аміфостіну, проаналізовано та узагальнено клініко-лабораторні дані, написано статтю.  Бебешко В.Г., Клименко С.В., Аткінсон М.Дж., Роземанн М.  Мутації гену FLT3 при мієлодиспластичних синдромах в осіб, які постраждали внаслідок Чорнобильської катастрофи // Галицький лікарський вісник. – 2004. – Т. 12, № 1, Ч. 2. – С. 11–13. Здобувачем зібрано зразки субстратних клітин хворих на МДС, проведено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема ПЛР, визначення поліморфізму рестрикції продуктів ампліфікації ДНК, аналіз і синтез отриманих даних, написано статтю.  Бебешко В.Г., Клименко С.В. Гострі лімфобластні лейкемії серед постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС: аналіз результатів лікування // Онкологія. – 2005. – Т. 7, № 1. – C. 52–54. Здобувачем заплановано та організовано дослідження, опрацьовано архівний матеріал щодо хворих на ГЛЛ із заповненням комп’ютерної бази даних, проведено аналіз і синтез матеріалу, написано статтю.  Бебешко В.Г., Базика Д.А., Клименко С.В., Мазниченко О.Л., Голярник Н.А., Лясківська О.В., Ільєнко І.М., Третяк Н.М., Вдовцов О.О., Сербіненко Т.М., Зубрицька Т.Б., Зінченко В.Н.  Експресія Р-глікопротеїну при радіаційно-асоційованих гострих мієлоїдних лейкеміях // Лікарська справа. – 2005. – № 3. – С. 29–32. Здобувачем заплановано та організовано дослідження, зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено клініко-гематологічні дослідження, оброблено та проаналізовано дані проточної цитометрії, зіставлено та узагальнено отримані результати, написано статтю.  Klymenko S., Trott K., Atkinson M., Bink K., Bebeshko V., Bazyka D., Dmytrenko I., Abramenko I., Bilous N., Misurin A., Zitzelsberger H., Rosemann M.  AML1 gene rearrangements and mutations in radiation-associated acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes // J. Radiat. Res. – 2005. – Vol. 46, № 2. – P. 249–255. Здобувачем заплановано дослідження, зібрано зразки субстратних клітин ГМЛ та МДС, здійснено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема FISH, ПЛР, сіквенування ДНК, оброблено та зіставлено дані, проаналізовано та узагальнено результати досліджень, написано статтю.  Бебешко В.Г., Клименко С.В. Механізми медикаментозної резистентності при гострих лейкеміях: значення транспортних протеїнів // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2005. – Т. 5, № 2. – С. 33–38. Здобувачем проаналізовано світовий досвід дослідження факторів ММР, оброблено та проаналізовано дані проточної цитометрії щодо експресії транспортних протеїнів при ГЛ в осіб, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, написано статтю.  Бебешко В.Г., Базика Д.А., Клименко С.В., Мазниченко О.Л., Голярник Н.А., Лясковська О.В., Ільєнко І.М., Третяк Н.М., Вдовцов О.О., Сербіненко Т.М., Зубрицька Т.Б., Зінченко В.Н.  Експресія молекул апоптозу CD95 та BCL-2 при радіаційно-асоційованих гострих мієлоїдних лейкеміях // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2005. – Т. 5, № 1. – С. 28–32. Здобувачем заплановано та організовано дослідження, зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено клініко-гематологічні дослідження, оброблено та проаналізовано дані проточної цитометрії, зіставлено та узагальнено отримані результати, написано статтю.  Klymenko S.V., Bink K., Trott K.R., Bebeshko V.G., Bazyka D.A., Dmitrenko I.V., Abramenko I.V., Bilous N.I., Zitzelsberger H., Misurin A.V., Atkinson M.J., Rosemann M.  MLL gene alterations in radiation-associated acute myeloid leukemia // Exp. Oncol. – 2005. – Vol. 27, № 1. – P. 71–75. Здобувачем заплановано дослідження, зібрано зразки лейкемічних клітин, здійснено молекулярно-біологічні дослідження, зокрема FISH, проаналізовано та узагальнено результати досліджень, написано статтю.  Клименко С.В., Бебешко В.Г., Базика Д.А., Аткінсон М.Дж., Роземанн М.  Мутаційний статус гену FLT3 при радіаційно-асоційованій гострій мієлоїднії лейкемії: ознаки генетичної нестабільності пухлини // Архів клінічної медицини. – 2005. – № 2. – С. 56–59. Здобувачем зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено клініко-гематологічні та молекулярно-біологічні дослідження, аналіз і синтез отриманих даних, написано статтю.  Клименко С.В., Мішаріна Ж.А., Абраменко І.В., Білоус Н.І., Бебешко В.Г.  Визначення транслокації BCR/ABL при радіаційно-асоційованих гострих мієлоїдних лейкеміях методом флуоресцентної in situ гібридизації // Цитологія і генетика. – 2005. – Т. 39, № 6. – С. 55–59. Здобувачем зібрано зразки лейкемічних клітин, проведено клініко-гематологічні та молекулярно-біологічні дослідження, аналіз і синтез отриманих даних, написано статтю.  Пат. 32234 А Україна. Спосіб діагностики некласифікованого варіанта мієлодиспластичного синдрому як передстадії лейкемії у осіб, що зазнали дії іонізуючого опромінення / В.Г. Бебешко, В.І. Клименко, І.С. Дягіль, Т.Ф. Любарець, Т.В. Каднікова, С.В. Клименко; НЦРМ АМН України. – № 99010349; Заявл. 22.01.99; Опубл. 15.12.2000, Бюл. № 7-ІІ. – 3 c. Здобувач приймав участь у розробці концепції патенту, клінічному обстеженні хворих на МДС, аналізі особливостей радіаційно-асоційованого МДС та етапів трансформації лейкемічного процесу.  Klymenko V., Dyagil I., Klymenko S., Kadnikova T., Burvalova G.  Features of myelodysplastic syndrome in the persons suffered from the Chernobyl accident // Acta Haematologica Polonica. – 1999. – Vol. 30, Suppl. 1. – P. 298–299.  Klymenko V.I., Dyagil I.S., Bebeshko V.G., Klymenko S.V., Bazyka D.A., Lubarets T.F.  Myelodysplastic syndrome in patients who suffered from the Chernobyl accident // Haematologica. – 1999. – Vol. 84, EHA-4 Abstract Book. – P. 177.  Dyagil I.S., Klymenko V.I., Klymenko S.V. All-trans-retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia in radiation exposed // Haematologica. – 1999. – Vol. 84, EHA-4 Abstract Book. – P. 147.  Клименко В.І., Любарець Т.Ф., Дягіль І.С., Базика Д.А., Крячок І.А., Каднікова Т.В., Черв’якова О.В., Шолойко В.В., Клименко С.В., Зотіков Л.О., Білько Н.М.  Гематологічні ефекти у осіб, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддалений період // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”; Тр. ІV з’їзду гематологів та трансфузіологів України. – К.: “Нора–прінт”, 2001. – Вип. 30. – С. 211.  Bebeshko V.G., Klymenko V.I., Bazyka D.A., Dyagil I.S., Sholoiko V.V., Klymenko S.V.  Acute leukemias transformed with myelodisplastic syndrome in victims owing to accident on the Chernobyl atomic power plant // Leuk. Res. – 2001. – Vol. 25, Suppl. 1. – P. 63.  Клименко С.В., Имамура Н., Базыка Д.А., Клименко В.И.  Точечные мутации гена р53 у лиц, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС, с острыми миелоидными лейкемиями // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2002. – Т. 2, №5. – С. 26–27.  Klymenko S.V., Imamura N., Kryachok I.A., Klymenko V.I.  Mutations of p53 supressor oncogene in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome among victims of the Chernobyl accident // Hematol. J. – 2003. – Vol. 4, Suppl. 2. – P. 200.  Klymenko S.V., Kovalenko A.N., Dubrovina G.V., Klymenko V.I.  Amifostine treatment of myelodysplastic syndrome in patient survived acute radiation syndrome due to Chernobyl accident // Leuk. Res. – 2003. – Vol. 27, Suppl. 1. – P. 114.  Bebeshko V.G., Klymenko V.I., Lubaretc T.F., Dyagil I.S., Kadnikova T.V., Belinska I.V., Sholoiko V.V., Chervyakova E.V., Klymenko S.V.  Secondary myelodysplastic syndrome in the persons suffered following Chornobyl accident // Leuk. Res. – 2003. – Vol. 27, Suppl. 1. – P. 9–10.  Klymenko S.V., Atkinson M.J., Bebeshko V.G., Bazyka D.A., Bink K., Dmitrenko I.V., Abramenko I.V., Bilous N., Zitzelsberger H., Rosemann M. AML1 gene rearrangements in radiation-associated acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome // Hematol. J. – 2004. – Vol. 5, Suppl. 2. – P. 76–77. Бебешко В.Г., Клименко В.И., Любарец Т.Ф., Шолойко В.В., Червякова Е.В., Кадникова Т.В., Белинская И.В., Дягиль И.С., Клименко С.В.  Миелодиспластический синдром у лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології: Зб. наук. пр. – К., 2004. – Вип. 10. – С. 255–266.  Bebeshko V.G., Bazyka D.A., Klymenko S.V., Maznichenko О.L., Golarnik N.А., Ljaskivska O.V., Iljenko I.M.  Drug transporters and apoptosis-related proteins expression analysis in acute myeloid leukemia patients exposed to ionizing radiation due to the Chernobyl accident // Haematologica. – 2005. – Vol. 90, Suppl. 2. – P. 379. Klymenko S.V., Bazyka D.A., Maznichenko О.L., Golarnik N.А., Ljaskovska O.V., Iljenko I.M., Tretyak N.M., Vdovcov О.О., Serbinenko Т.М., Zubricka Т.B., Zinchenko V.N., Bebeshko V.G.  Apoptosis-related proteins expression in radiation-associated acute myeloid leukemia // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 116.  Dmytrenko I.V., Bebeshko V.G., Minchenko J.M., Dmytrenko O.O., Tsvetkova N.M., Kucher O.V., Kryachok I.A., Klymenko S.V., Shlyahtichenko T.Y.  Association of the molecular-genetic disturbances and markers of various genetic blood systems in patients with oncohematologic pathology with features of disease flowing on different steps of the hemopoetic cells transplantation // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 168.  Klymenko S.V. Clinical, morphological and molecular genetic features of acute myeloid leukemia developed in patients exposed to ionizing radiation due to the Chernobyl accident // Тез. доп. наук-практич. конф. молод. вчен. та спеціаліст. – К.: Знання України, 2005. – С. 27–28.  Бебешко В.Г., Базыка Д.А., Клименко С.В., Мазниченко О.Л., Голярник Н.А., Лясковская Е.В., Ильенко И.Н.  Анализ экспрессии Bcl-2, CD95 и P-гликопротеина при острых лейкемиях у пациентов, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации вследствие Чернобыльской катастрофы // Матер. ІІІ Междунар. симпозиума “Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты”. – Челябинск, 2005. – С. 61–62.  Клименко С.В., Бебешко В.Г., Базика Д.А. Біологічні особливості та детермінанти медикаментозної резистентності гострих лейкемій в осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС: удосконалення стратегії лікування // Укр. ж. гематол. та трансфузіол. – 2005. – Т. 5, № 4. – С. 100–102. АНОТАЦІЯ Клименко С.В. Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин та механізми медикаментозної резистентності у хворих на гостру лейкемію, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.01.31 – гематологія та трансфузіологія. – Інститут гематології та трансфузіології АМН України, Київ, 2006. У дисертації на основі комплексного вивчення результатів лікування, клініко-гематологічних, цитогенетичних, молекулярно-біологічних особливостей, факторів медикаментозної резистентності радіаційно-асоційованих лейкемій наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми щодо оптимізації тактики лікування гострої мієлоїдної лейкемії (ГМЛ) і гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ) у осіб, які зазнали дії іонізуючої радіації внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. Одержано пріоритетні дані про патогенез пухлинного процесу, особливості фенотипових характеристик субстратних клітин, своєрідність перебігу гострої лейкемії у разі радіаційної асоційованості захворювання, розроблено стратегію лікування ГМЛ і ГЛЛ, що розвинулись в учасників ліквідації наслідків аварії та жителів радіоактивно забруднених територій. Ключові слова: аварія на Чорнобильській АЕС, іонізуюча радіація, віддалені наслідки, кровотворення, периферична кров, кістковий мозок, гостра лейкемія, мієлодиспластичний синдром. АННОТАЦИЯ Клименко С.В. Молекулярно-биологические особенности субстратных клеток и механизмы медикаментозной резистентности у больных с острой лейкемией, которые пострадали вследствие аварии на Чернобыльской АЭС. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.31 – гематология и трансфузиология. – Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины, Киев, 2006. В диссертации на основе комплексного изучения результатов лечения, клинико-гематологических, цитогенетических, молекулярно-биологических особенностей, факторов медикаментозной резистентности радиационно-ассоциированных лейкемий приведено теоретическое обобщение и новое решение научной проблемы оптимизации тактики лечения острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и острой лимфобластной лейкемии (ОЛЛ) у лиц, которые подверглись воздействию ионизирующей радиации (ИР) вследствие аварии на Чернобыльской АЭС (ЧАЭС). Получены приоритетные данные про патогенез опухолевого процесса, особенности фенотипических характеристик субстратных клеток, своеобразие течения радиационно-ассоциированной острой лейкемии, разработана стратегия лечения ОМЛ и ОЛЛ у участников ликвидации последствий аварии (ЛПА) и жителей радиоактивно загрязненных территорий. При ОЛ у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и жителей загрязненных радионуклидами территорий чаще, чем при спонтанных лейкемиях, определяются факторы неблагоприятного прогноза течения заболевания, а именно развитие из миелодиспластического синдрома, наличие инфекционного процесса и трансфузионная зависимость во время манифестации заболевания, уровень ЛДГ выше 500 ед/л при ОМЛ, уровень ЛДГ выше 500 ед/л и выше 1000 ед/л – при ОЛЛ. Больные с радиационно-ассоциированными ОМЛ и ОЛЛ реже достигают полную ремиссию и характеризуются более коротким общим выживанием, чем пациенты со спонтанными лейкемиями. ОМЛ у лиц, которые подверглись воздействию ИР, чаще представлены резистентными к цитостатическому лечению формами. Транслокации с вовлечением генов AML1 и MLL не являются распространенными при лейкемии, которая возникла у облученных вследствие аварии на ЧАЭС, а транслокация AML1/ETO встречается при радиационно-ассоциированной ОМЛ реже, чем при спонтанной. Спектр молекулярно-биологических признаков радиационно-ассоциированных случаев ОМЛ смещен в сторону потерь и прироста хромосомного материала с неслучайно высокой частотой делеций 5q и/или 7q и 7р. Перспективным отдельным кандидатом на роль маркера радиационно-индуцированного лейкемического процесса является мутация гена AML1. С учетом высокой частоты выявления транслокации bcr/abl у больных с ОМЛ и ОЛЛ, которые подверглись воздействию ИР вследствие аварии на ЧАЭС, для проведения дифференциального диагноза между ОЛ и хронической миелоидной лейкемией необходимо использовать комбинацию клинических, цитологических, цитогенетических, молекулярно-биологических и иммунофенотипических исследований. Лейкемические клетки пациентов с радиационно-ассоциированной ОМЛ чаще, чем при спонтанной ОМЛ, гиперэкспрессировали Р-гликопротеин и антиапоптозный регулятор BCL-2, были негативными в отношении экспрессии проапоптозного рецептора CD95. Значимой причиною формирования медикаментозной резистентности у больных с радиационно-ассоциированной ОЛЛ следует считать гиперэкспрессию ингибиторов апоптоза BCL-2 и BCL-XL. Мутации гена FLT3 не играют существенной роли в лейкемогенезе при развитии ОЛЛ и ОМЛ у лиц, облученных вследствие Чернобыльской катастрофы. В случае дупликации гена лейкемический процесс у облученных лиц непропорционально чаще, чем спонтанный, характеризуется наличием множественных мутантов, что свидетельствует про генетическую нестабильность опухоли. У участников ЛПА и жителей загрязненных радионуклидами территорий отмечаются признаки множественных процессов и причин, которые обусловливают нечувствительность лейкемических клеток к цитостатической терапии. Предложена стратегия лечения пострадавших вследствие аварии на ЧАЭС, согласно которой при отсутствии у пациента маркеров благоприятного прогноза стандартной цитостатической терапии и невозможности осуществления аллогенной трансплантации стволовых гемопоэтических клеток, больных с радиационно-ассоциированной ОЛ следует рассматривать в качестве первоочередных кандидатов на включение в протоколы клинических исследований перспективных методов лечения. Ключевые слова: авария на Чернобыльской АЭС, ионизирующая радиация, отдаленные последствия, кроветворение, периферическая кровь, костный мозг, острая лейкемия, миелодиспластический синдром. SUMMARY Klymenko S.V. Molecular biology of substrate cells and multidrug resistance mechanisms in acute leukemia patients suffered from the Chornobyl accident. – Manuscript. Dissertation for the scientific degree of the Doctor of Medical Sciences on specialty 14.01.31 – hematology and transfusiology. – Institute of Hematology and Transfusiology, Kyiv, 2006. The dissertation is devoted to analysis of treatment results, clinical, hematological, citogenetic, molecular-biological features, multidrug resistance determinants of acute leukemia in persons exposed to ionizing radiation due to the Chornobyl accident. The study results allowed to make a general conclusion and to suggest a new solution of the scientific problem relating to treatment optimization of radiation-associated acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL). The priority data was found concerning the tumorigenesis, phenotype of leukemia cells, and clinical course of radiation-associated acute leukemia. The strategy of AML and ALL treatment in clean-up workers and inhabitants of Ukrainian territories with high contamination from radionuclide fallout was developed as well. Key words: Chornobyl Accident, ionizing radiation, remote consequences, hemopoiesis, peripheral blood, bone marrow, acute leukemia, myelodysplastic syndrome. Клінічні випробування Рефрактерність Рецидив Hyper-CVAD# Консолідація та підтримання ремісії до 3 років 8-тижнева програма# з пег-аспарагіназою Спостереження Алогенна трансплантація СГК Високий ризик** Стандартний ризик* ГМЛ PML/RAR-alpha AML1/ETO CBFb/MYH11 Усі інші форми Антрациклінові антибіотики + АТRА “7+3” + консолідація високими дозами цитозару “7+3” + алогенна трансплантація СГК Клінічні випробування BCR/ABL позитивні P-глікопротеїн позитивні Гіперекспресія протеїнів родини bcl-2 Мутація FLT3 Інгібітори кіназ ATRA, антисмислові олігонуклеотиди Модулятори функції Р-глікопротеїну Іматініб Моноклональні антитіла Антиангіоген- ні препарати

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *