.

Механізми індукції апоптозу у лімфомних клітинах під впливом алкалоїдів чистотілу (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
115 3605
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

КАМІНСЬКИЙ ВІТАЛІЙ ОЛЕКСІЙОВИЧ

УДК 577.1:547.943:611.018.15

Механізми індукції апоптозу у лімфомних клітинах під впливом алкалоїдів
чистотілу

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського національного
університету імені Івана Франка МОН України та у відділі регуляції
проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України,

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин,

професор кафедри біохімії Львівського національного університету імені
Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович

Директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення
продуктивності тварин Львівської національної академії ветеринарної
медицини ім. С.З. Гжицького, професор кафедри органічної та неорганічної
хімії.

доктор біологічних наук, доцент

Дробот Людмила Борисівна

Інститут біології клітини НАН України,

в.о. завідувача відділу сигнальних механізмів клітини

Провідна установа – Інститут молекулярної біології та генетики НАН
України, м. Київ

Захист відбудеться “18” жовтня 2006 р. о 14.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН
України за адресою:

вул. Драгоманова, 14/16, м. Львів, 79005.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
за адресою: вул. Драгоманова, 14/16, м. Львів, 79005.

Автореферат розісланий “13” вересня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сполуки природного, зокрема рослинного походження
займають важливе місце у сучасній хіміотерапії пухлин. Зростання
інтересу до цих сполук пов’язане із відкриттям і детальним вивченням
низки цитостатиків рослинного походження та успішним впровадженням у
практику таких антибластичних препаратів як колхамін, вінбластин,
вінкристин, подофілін та ін. Серед сполук рослинного походження слід
виділити алкалоїди – групу біологічно-активних речовин, що мають у своїх
гетероциклах атом нітрогену. Екстракт чистотілу (Chelidonium majus L.)
містить у своєму складі близько 36 диізохінолінових алкалоїдів
(Потопальський, 1992, Taborska et al, 1994) з протопіновою,
протобербериновою та бензофенантридиновою структурою. Серед алкалоїдів
чистотілу за вмістом переважають хелідонін, сангвінарин, хелеритрин,
берберин та коптизин.

В останні роки було з’ясовано деякі механізми біологічної дії окремих
алкалоїдів чистотілу на клітини-мішені. Зокрема, встановлено, що
алкалоїд хелідонін взаємодіє з цитоскелетним білком тубуліном і зумовлює
зупинку клітин у фазі мітозу (Panzer et al, 2001). Хелеритрин,
сангвінарин, берберин та коптизин впливають на процеси дихання в
мітохондріях (Barreto et al, 2003). Сангвінарин та хелеритрин, завдяки
наявності імінних груп, здатні інгібувати активність ензимів та інших
білків, які мають в активному центрі нуклеофільні групи (Фаддеева и др.,
1997). Деякі алкалоїди чистотілу діють як інгібітори протеїнкіназ,
блокують активність транскрипційного фактора NF-kB, який є компонентом
сигнальних шляхів, залучених до індукції проліферації клітин або їх
загибелі (Chaturvedi et al, 1997). У низці робіт (Bhadra et al, 2005,
Das et al, 2003, Mazzini et al, 2003, Schmeller  et al, 1997, Sen et al,
1994) автори звернули увагу на здатність окремих алкалоїдів чистотілу
взаємодіяти з ДНК шляхом проникнення їх планарних молекулярних структур
у ланцюги ДНК.

На лімфопроліферативні захворювання припадає вагома частка злоякісних
новоутворень, вона становить близько 7,5 %, причому смертність від цих
захворювань становить близько 7 % загальної смертності хворих на
злоякісні пухлини (Greenlee R.T. et al, 2000). Пошук і створення
хіміопрепаратів на основі алкалоїдів чистотілу, що проявляють
протипухлинну властивість in vitro та in vivo (Cordes et al, 2002,
Hohenwarter et al, 1992, Kurochkin et al 2000, Nowicky et al, 1996,
Roublevskaia et al, 2000, Ernst et al, 2005, Grinevich et al, 2005)
залишається актуальною проблемою. Здатність алкалоїдів пригнічувати ріст
новоутворень лімфоїдної тканини вивчена недостатньо, зокрема
маловивченими залишаються механізми дії алкалоїдів чистотілу, залучені
до індукції загибелі пухлинних клітин. Нез’ясованими є
внутрішньоклітинні шляхи реалізації апоптозу клітин під впливом окремих
алкалоїдів, потребує уточнення питання, які з алкалоїдів чистотілу є
найбільш ефективними індукторами апоптозу і чи існують інші типи
загибелі клітини, які можуть індукуватися під впливом алкалоїдів
чистотілу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у рамках держбюджетної теми Бх-116Б кафедри біохімії
Львівського національного університету ім. І. Франка “Ензиматичні
системи організму при дії іонізуючого випромінювання та інших
патологічних чинників” № держреєстрації 0103V001918 (2003-2004 pp.).
Окремі дослідження були проведені у межах теми відділу регуляції
проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України “Дослідження
процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого
антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” № держреєстрації
0106U002599 (2005-2007 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити на
клітинному і молекулярному рівнях механізми індукції апоптозу лімфомних
клітин основними алкалоїдами чистотілу – хелідоніном, сангвінарином,
хелеритрином та коптизином.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

вивчити цитотоксичну дію алкалоїдів чистотілу щодо ліній клітин
перещеплюваної мишачої лімфоми NK/Ly, культур лімфомних клітин людини
ліній МТ-4, CCRF-CEM і Jurkat;

дослідити вплив окремих алкалоїдів чистотілу на розподіл лімфомних
клітин за фазами клітинного циклу та їх вплив на прояв апоптозу;

вивчити вплив алкалоїдів чистотілу на рівень та активність білків, що
регулюють апоптоз лімфомних клітин;

з’ясувати вплив алкалоїдів чистотілу на інтенсивність процесів окисного
фосфорилювання та кальцієву ємність ізольованих мітохондрій,
трансмембранний потенціал мітохондрій лімфомних клітин та синтез ATP;

дослідити здатність алкалоїдів чистотілу інтеркалювати в структуру ДНК
лімфомних клітин;

вивчити деструктивні стадії загибелі лімфомних клітин під впливом
алкалоїдів чистотілу.

Об’єкт дослідження: механізми загибелі лімфомних клітин.

Предмет дослідження: вплив окремих алкалоїдів чистотілу на апоптоз
лімфомних клітин.

Методи дослідження: виділення ДНК, виділення мітохондрій,
спектрофотометрія, культивування клітин in vitro, світлова,
флуоресцентна та електронна мікроскопія, електрофорез ДНК та білків у
гелі, Вестерн-блот-аналіз білків, проточна цитофлуориметрія.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено основні шляхи
індукції апоптозу лімфомних клітин під впливом чотирьох основних
алкалоїдів чистотілу. Показано, що хелідонін та сангвінарин є найбільш
ефективними індукторами апоптозу лімфомних клітин людини in vitro.
Вперше показано, що індукція апоптозу сангвінарином, хелеритрином та
коптизином реалізується на мітохондріальному рівні, про що свідчить
вивільнення цитохрому с із мітохондрій та активація ініціюючої
каспази-9. Індукція апоптозу лімфомних клітин під впливом досліджених
алкалоїдів може реалізуватись також із залученням каспази-8, яка приймає
участь у здійсненні рецептор-опосередкованого шляху апоптозу.

Виявлено, що у механізмах дії сангвінарину, хелеритрину та коптизину на
лімфомні клітини залучені пошкоджуючий вплив на мітохондрії та
інтеркаляція у структуру ДНК лімфомних клітин. Сангвінарин і хелеритрин
є сильними інтеркаляторами ДНК лімфомних клітин, спричиняють одно- та
двониткові розриви в ланцюгах ДНК, впливають на трансмембранний
потенціал мітохондрій лімфомних клітин, а також на синтез ATP вже на
ранніх етапах дії. Хелідонін зупиняє клітинний цикл клітин лінії МТ-4
лімфоми людини у G2/M фазі, викликає активацію проапоптичного білка Bad,
однак не інтеркалює у структуру ДНК лімфомних клітин,.

Практичне значення одержаних результатів. З’ясовано механізми індукції
апоптозу лімфомних клітин in vitro за умов дії основних алкалоїдів
чистотілу. Встановлено, які саме з алкалоїдів чистотілу є найсильнішими
індукторами апоптозу, що дозволяє розробити рекомендації щодо їх
випробовування на протипухлинну активність in vivo.

Одержані результати, що стосуються механізмів індукції процесів апоптозу
використовуються при викладанні матеріалу спецкурсу “Молекулярні
механізми регуляції проліферації і диференціації клітин” для магістрів
на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного
університету імені Івана Франка та спецкурсу “Біологія індивідуального
розвитку” для магістрів на кафедрі біології природничо-географічного
факультету Вінницького державного педагогічного університету імені
Михайла Коцюбинського.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за
темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і
статистичну обробку отриманих результатів. Аналіз і обговорення
отриманих даних проведено спільно з науковим керівником,
членом-кореспондентом НАН України Стойкою Р.С. Окремі розділи роботи
детально обговорено з доктором біологічних наук Луциком М.Д. К.б.н.
Фільченков О.О. надав допомогу у проведенні експериментів на проточному
цитофлуориметрі. Електронну мікроскопію здійснено за допомоги к.б.н.
Кулачковського О.Р. Виділення мітохондрій та вивчення деяких їхніх
властивостей проведено за участю Крив’як Н.В.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертації були
представлені на міжнародній конференції “Ionic Soft matter: Novel trends
in theory and applications” (Lviv, Ukraine, April 14-17, 2004),
конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної
біохімії” (Тернопіль, 11-12 листопада 2004 р.), наукових сесіях
Наукового Товариства ім. Шевченка (Львів, 2005 та 2006 рр), на 5-ій
Міжнародній Парнасівській конференції (Київ, 2005), конференції молодих
науковців “Сучасні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2005),
Міжнародному науково-практичному форумі “Основи молекулярно-генетичного
оздоровлення людини і довкілля” на базі Інституту молекулярної біології
та генетики НАН України (Київ, 31 травня-1 червня 2005 р.), щорічних
звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного
університету ім. І. Франка (Львів, 2005-2006), VII Міжнародній
конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної і
клінічної онкології” (Київ, 2006), конференції “Отечественные
противоопухолевые препараты” (Москва, 2006), звітній конференції молодих
вчених Інституту біології клітини НАН України (Львів, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з
них 4 статті у фахових виданнях і 7 тез у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ,
огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень,
аналіз та обговорення результатів досліджень, висновки та список
цитованої літератури. Дисертацію викладено на 150 сторінках і
проілюстровано 47 рисунками та 3 таблицями. Список цитованої літератури
складає 207 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано дані про механізми
загибелі клітин шляхом апоптозу. Детально висвітлено дані щодо
механізмів біологічної дії алкалоїдів на клітини-мішені, в першу чергу,
злоякісні клітини.

Матеріали та методи досліджень. Сангвінарин, хелеритирн, хелідонін та
коптизин очищені з чистотілу (Chelidonium majus L.) д. б. н. Луциком
М.Д. та інженером Осипом Ю.Л і люб’язно надані для роботи. Дослідження
проводили на клітинах лімфоми людини лінії МТ-4, CCRF-CEM та Jurkat, а
також на клітинах мишачої лімфоми лінії NK/Ly, отриманих із банку
клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології та
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ). Клітини
вирощували у середовищі RPMI 1640 (“Sigma”, США) за присутності 10%
сироватки ембріонів великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50
мкг/мл гентаміцину (“Sigma”, США).

Вплив алкалоїдів на ріст і виживання клітин визначали за допомогою
фарбування клітин 0,1% розчином трипанового синього та підрахунком
зафарбованих (мертві) і незафарбованих (живі) клітин.

Вміст білків вивчали за допомогою методу Вестерн-блот-аналізу із
використанням моноклональних антитіл до фрагменту білка PARP
(“Santa-Cruz”, США), каспази-8 та каспази-9 (“Beckman Coulter, Inc.”,
США), каспази-3 (“Chemicon”, США), цитохрому с (“BD Biosciences
Pharmingen”, США) або поліклональних анти-Bcl-2 (“Santa Cruz”, США) та
анти-Bad (“Beckman Coulter, Inc.”, США) антитіл. Отримані дані щодо
рівня білків були проаналізовані та оцифровані за допомогою програми Gel
Pro Analyzer 3.1.

Апоптоз клітин визначали на проточному цитофлуориметрі шляхом фарбування
ядер клітин пропідіййодидом.

Виділення мітохондрій та визначення їх функціонального стану здійснювали
згідно до описаної методики (Дубицький та ін., 1996).

Вміст ATP у клітинах визначали ензиматичним методом, в основі якого
лежить здатність гексокінази за присутності глюкози фосфорилювати
глюкозу. Глюкозо-6-фосфат, що при цьому утворюється, служить субстратом
для глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції. Кількість ATP, яка
прореагувала, еквімолярна кількості NADPН, що утворився у
глюкозо-6-фосфатдегідро-геназній реакції. Кількість NADPН визначали
спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм.

Вплив алкалоїдів на трансмембранний потенціал мітохондрій визначали за
здатністю цих органел накопичувати флуоресцентний барвник родамін-123
(Johnson L. et al, 1981).

ДНК-інтеркаляторну здатність алкалоїдів вивчали за допомогою методів
термоденатурації ДНК та витіснення барвника метилового зеленого з
комплексу з ДНК згідно описаних методик (Schmeller T. et al, 1997). За
графіками визначали концентрацію лігандів, яка витісняє половину
метилового зеленого з його комплексу з ДНК, та температуру плавлення
ДНК.

Виділення апоптичної ДНК проводили, як описано Гонгом (Gong J. et al,
1994). Розділення фрагментів ДНК здійснювали електрофоретично у гелі 1,5
% агарози.

Морфологічні зміни ядер досліджували шляхом зафарбовування ядер клітин
барвником Hoechst 33342 (кінцева концентрація 1,5 мкМ). Клітини
інкубували з барвником при 37 °С протягом 15 хв та концентрували
центрифугуванням до 3 млн/мл. Зразки аналізували на флуоресцентному
мікроскопі при збільшенні х400.

Для електронної мікроскопії зразки готували шляхом фіксування клітин
1,5 % розчином глутарового альдегіду (Sigma Chem. Co, США) із додатковою
фіксацією 2 % розчином OsO4. Препарати зневоднювали у зростаючих
концентраціях етилового спирту і поміщали в епоксидну смолу епон-812
(Fluka, Німеччина) (Уикли, 1975). Зрізи готували на ультрамікротомі
УМТП-6, контрастували 2%-ним розчином уранілацетату протягом 15 хв і
додатково цитратом свинцю та переглядали за допомогою електронного
трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100.

Мікроелектрофорез ДНК індивідуальних клітин у гелі агарози за лужних та
слаболужних умов проводили згідно до методик (Gulston et al, 2002, Olive
et al, 2001).

Усі досліди повторювали тричі з трьома паралельними експериментами у
кожному варіанті. Статистичну обробку даних та побудову графіків
виконували за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Office Excel
2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вплив алкалоїдів чистотілу на апоптоз клітин та їх розподіл за фазами
клітинного циклу. Вплив сангвінарину, хелеритрину та коптизину на ріст
та виживання клітин лімфоми людини лінії МТ-4 представлено на рис. 1.
Подібний характер кривих отримано із використанням лімфомних клітин
людини ліній CCRF-CEM та Jurkat. Початкова концентрація клітин становила
1 млн/мл. На 24 год приріст клітин у культурі становив 40 %. На 24 год
дії сангвінарину чи хелеритрину у концентрації 8 мкг/мл спостерігали
практично повну загибель клітин у культурі. Сангвінарин виявився
найбільш цитотоксичним, при концентрації алкалоїду 2 мкг/мл кількість
живих клітин відносно контролю становила лише 10 %. Хелеритрин виявляв
подібний ефект у концентрації 4 мкг/мл. Коптизин володів помірною
цитотоксичністю, адже при використанні алкалоїду у концентрації 8 мкг/мл
кількість живих клітин відносно контролю становила 40 %. Хелідонін у
концентрації 0,5 мкг/мл повністю пригнічував ріст клітин у культурі.
Максимальний цитотоксичний ефект дії хелідоніну був виражений вже при
використанні алкалоїду у концентрації 2 мкг/мл, кількість живих клітин
відносно контролю становила 40 %.

За даними проточної цитофлуориметрії, хелідонін у концентрації
2,5 мкг/мл призводить до суттєвого збільшення частки клітин лінії МТ-4 у
фазах G2/M (54 % у порівнянні з 19 % у контролі) за рахунок значного
зменшення частки клітин у фазах G0/G1 (12 % у порівнянні з 44 % у
контролі). Сангвінарин та хелеритрин у концентраціях 1 та 2 мкг/мл
відповідно спричиняли зменшення частки клітин у G2/M фазах (9 та 14 %,
відповідно, у порівнянні з 19 % у контролі) із відповідним збільшенням,
в основному, частки клітин у G0/G1 та S фазах клітинного циклу.

Рис. 1. Вплив алкалоїдів чистотілу на виживання клітин лінії МТ-4
лімфоми людини: 1 – сангвінарин; 2 – хелеритрин; 3 – коптизин; 4 –
хелідонін

Збільшення частки клітин у фазі S під впливом коптизину відбувалось за
рахунок зменшення частки клітин у фазах G0/G1.

За результатами проточної цитофлуориметрії найвищий апоптичний індекс
(відсоток гіподиплоїдних клітин) у культурі клітин МТ-4 виявлено при дії
хелідоніну та сангвінарину у концентраціях близьких до індексу
цитотоксичності (ІС50), він становить у середньому 33 та 24 %,
відповідно. При збільшенні концентрації сангвінарину до 2 мкг/мл
спостерігали зниження кількості апоптичних клітин у культурі. На відміну
від сангвінарину, при дії хелідоніну у концентраціях, значно вищих за
ІС50, апоптичний індекс був близьким до 30 %. Значно слабший ефект на
вміст гіподиплоїдних клітин у культурі виявлено при дії хелеритрину та
коптизину. Подібно до дії сангвінарину при використанні хелеритрину у
концентраціях вищих за ІС50 спостерігали зменшення частки гіподиплоїдних
клітин у культурі.

Вплив алкалоїдів чистотілу на рівень білків, задіяних у регуляції
апоптозу. На рис. 2 представлено результати впливу алкалоїдів чистотілу
на вміст цитохрому с у мітохондріальній та цитоплазматичній фракції
клітин лінії МТ-4. З рисунку видно, що під впливом сангвінарину,
хелідоніну та хелеритрину значно зменшується вміст цитохрому с у
мембранній фракції, дещо слабший ефект виявлено під впливом коптизину.

Найбільший вміст цитохрому с у цитоплазмі спостерігали під впливом
сангвінарину. За результатами аналізу, цей алкалоїд у концентрації 0,8
мкг/мл зумовлює зростання вмісту цитохрому с у цитоплазмі приблизно у 8
разів порівняно з контролем.

Під впливом хелідоніну (5 мкг/мл) та хелеритрину (2 мкг/мл) вміст
цитохрому с у цитоплазмі зростав приблизно у 5 та 3 рази порівняно з
контролем. Коптизин у концентрації 10 мкг/мл призводив до зростання
вмісту цитохрому с у цитоплазмі приблизно у 2,3 рази порівняно з
контролем.

На рис. 3 представлено результати Вестерн-блот-аналізу білкових лізатів
клітин лінії МТ-4 з використанням антитіл до проапоптичного білка Bad,
антиапоптичного білка Bcl-2, активної та неактивної форми каспази-9,
неактивної форми каспази-3, а також в-актину.

Рис. 2. Вплив алкалоїдів чистотілу (дія протягом 24 год) на вміст
цитохрому с у мітохондріальній (А) та цитоплазматичній (Б) фракції
клітин лінії МТ-4: 1 – контроль; 2 – сангвінарин 0,8 мкг/мл; 3 –
хелідонін 5 мкг/мл; 4 – хелеритрин 2 мкг/мл; 5 – коптизин 20 мкг/мл.
(Тут і надалі вибрані концентрації речовин близькі до ІС50).

Під впливом сангвінарину та хелеритрину спостерігається зниження рівня
білка Bcl-2 (у межах 15 % відносно контролю). Після 6 год дії хелідоніну
на клітини лінії МТ-4 спостерігали зменшення кількості білка Bcl-2 з
молекулярною масою 25 кДа, що відбувалось за рахунок появи додаткової
смуги, яка була чітко виражена на 24 год інкубації клітин з хелідоніном
і, за даними літератури, є результатом фосфорилювання цього білка.

Під впливом хелідоніну протягом 24 год на клітини МТ-4 спостерігали
зростання рівня білка Bad приблизно у 2,5 рази, порівняно з контролем
(рис. 3). Під впливом сангвінарину через 6 год інкубації рівень білка
Bad зростав приблизно у 1,7 рази, проте знижувався на 24 год (порівняно
з дією на 6 год). Хелеритрин у концентрації 2 мкг/мл призводив до
зростання рівня білка Bad приблизно у 1,3 рази. На 24 год інкубації
клітин з коптизином у концентрації 10 мкг/мл спостерігали зростання
рівня білка Bad приблизно в 1,7 рази порівняно з контролем.

Всі досліджувані алкалоїди зумовлювали активацію ініціюючої каспази-9
(рис. 3). Вже через 6 год дії сангвінарин та хелеритрин зумовлювали
зменшення попередника активної форми каспази-9 на 90 та 80 % порівняно з
контролем, відповідно. Хелідонін на 6 год дії на клітини спричиняв
зниження вмісту попередника активної форми каспази-9 приблизно на 15 %,
а на 24 год дії алкалоїду вміст неактивної форми становив 70 % відносно
контрольного рівня. Як видно з рис. 3, на 24 год дії коптизину у
концентрації 10 мкг/мл приблизно на 30 % знижується рівень попередника
активної форми каспази-9. Найбільший рівень активної форми каспази-9
спостерігали на 6 год дії сангвінарину та на 24 год дії хелідоніну. На
24 год інкубації клітин лінії МТ-4 з сангвінарином вміст активної форми
каспази-9 зменшувався порівняно з дією цього алкалоїду протягом 6 год.
Як видно з рис. 3, під впливом хелеритрину у концентрації 2 мкг/мл також
спостерігається зростання вмісту активної форми каспази-9.

Під впливом сангвінарину протягом 6 год спостерігали зменшення вмісту
попередника активної форми каспази-3 приблизно на 65 %, а на 24 год дії
вміст прокаспази-3 зменшувався на 90 % порівняно з контролем. На 6 та 24
год дії хелеритрину вміст прокаспази-3 зменшувався приблизно на 60 %
порівняно з контролем. При використанні хелідоніну в концентрації 5
мкг/мл рівень прокаспази-3 у клітинах лінії МТ-4 знижувався на 20-25 %
порівняно з контролем.

Рис. 3. Вплив алкалоїдів чистотілу на вміст білків-регуляторів апоптозу
у клітинах лінії МТ-4: 1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,8 мкг/мл (6
год); 3 – сангвінарин, 0,8 мкг/мл (24 год); 4 – хелідонін, 5 мкг/мл (6
год); 5 – хелідонін, 5 мкг/мл (24 год); 6 – хелеритрин, 2 мкг/мл (6
год); 7 – хелеритрин, 2 мкг/мл (24 год); 8 – коптизин, 10 мкг/мл (24
год).

У результаті роботи встановлено, що у клітинах лінії CCRF-CEM під
впливом хелідоніну, крім активації ініціюючої каспази-9, відбувається
також значна активація каспази-8. Відомо, що каспаза-8 відповідальна за
рецептор-опосередкований шлях апоптозу та ініціюється шляхом зв’язування
лігандів із рецепторами TNFR1, CD95, TRAIL тощо (Lavrik I. et al, 2005).

На рис. 4 представлено результати вивчення впливу алкалоїдів чистотілу
на фрагментацію білка PARP-1 у клітинах лінії CCRF-CEM із використанням
антитіл до його фрагменту з молекулярною масою 85 кДа, який утворюється
у процесі апоптозу після його специфічного розщеплення каспазою-3.
Найбільший ефект на фрагментацію цього білка виявляв хелідонін.

Рис. 4. Вплив алкалоїдів чистотілу на фрагментацію білка PARP-1 у
клітинах лінії CCRF-CEM (час інкубації з алкалоїдами 24 год): 1 –
контроль; 2 – сангвінарин 0,5 мкг/мл; 3 – хелеритрин 0,5 мкг/мл; 4 –
хелідонін 2 мкг/мл; 5 – хелідонін 10 мкг/мл; 6 – коптизин 10 мкг/мл.

Після 24 год інкубації клітин із хелідоніном у концентраціях 2 та 10
мкг/мл у 8 разів зростала кількість фрагментованої форми білка PARP-1
порівняно з контрольним рівнем. Сангвінарин та хелеритрин (0,5 мкг/мл)
проявляли слабший ефект (порівняно з хелідоніном) на фрагментацію
PARP-1, адже кількість фрагментованої форми цього білка була тільки у 4
рази вищою порівняно з контрольним рівнем (рис. 4).

Дія алкалоїдів чистотілу на мітохондріальному рівні. Морфологічні зміни
у мітохондріях клітин лінії CCRF-СЕМ під впливом алкалоїдів досліджували
на 6 та 24 год їхньої дії. На рис. 5 представлено електронні
мікрофотографії клітин лінії CCRF-CEM після їх інкубації з алкалоїдами.
Як видно з рис. 5, сангвінарин та хелеритрин викликають значні
морфологічні зміни структури мітохондрій. Вже на 6 год дії цих
алкалоїдів має місце порушення структури внутрішньої мітохондріальної
мембрани, на що вказує зменшення кількості крист та їх „зморщування”.
Інший алкалоїд хелідонін на 6 год дії не викликав помітних змін у
морфології мітохондрій.

Рис. 5. Вплив алкалоїдів чистотілу на морфологію мітохондрій клітин
лінії CCRF-СЕМ лімфоми людини (6 год, х 15000). 1 – контроль; 2 –
хелеритрин, 1 мкг/мл; 3 – сангвінарин, 0,6 мкг/мл; 4 – хелідонін, 5
мкг/мл.

?1/43/4B

|

B

|

E

„@

^„@

d?th^„`„?

oaaaooooUoooIIooooooooo

,редньому на 83 % у порівняно з контролем. Коптизин мав слабший вплив на
кальцієву ємність мітохондрій, ніж сангвінарин та хелеритрин, оскільки
знижував накопичення кальцію мітохондріями в середньому на 72 %
порівняно з контролем. Хелідонін практично не впливав на кальцієву
ємність мітохондрій і зменшення цього показника відносно контролю
становило біля 10 %.

Подібну закономірність впливу досліджуваних алкалоїдів (кінцеві
концентрації 40 мкг/мл) було виявлено на швидкість окисного
фосфорилювання. У контролі його швидкість складала 57,5 нмоль ADP/хв на
мг білка. Сангвінарин та хелеритрин повністю пригнічували окисне
фосфорилювання у мітохондріях, а коптизин знижував його швидкість в
середньому на 61 %. За присутності колхаміну та хелідоніну швидкість
окисного фосфорилювання у мітохондріях становила в середньому 89 та 97 %
відносно контролю.

Встановлено, що на 3 год дії сангвінарину та хелеритрину (1 мкг/мл)
зростає кількість клітин, які втратили здатність накопичувати барвник
родамін-123 у мітохондріях на 55 % та 40 %, відповідно, у той же час на
24 год кількість таких клітин становить 95 та 75 %, відповідно. При
використанні цих алкалоїдів у концентрації 2 мкг/мл, вже на 3 год їх дії
спостерігали зменшення накопичення барвника у мітохондріях у більш ніж
90% клітин культури. Після 3 год інкубації з хелідоніном змін у
накопиченні родаміну-123 мітохондріями не спостерігалось. На 24 год дії
хелідоніну кількість клітин зі зниженим трансмембранним потенціалом
мітохондрій становила близько 35 %, причому на 48 год цей показник
зростав до 86 %.

Вже на 3 год дії сангвінарину та хелеритрину (2 мкг/мл) спостерігали
зниження вмісту ATP у клітинах CCRF-CEM до 4 нмоль/млн клітин порівняно
з 15 нмоль/млн клітин у контролі. При використанні хелідоніну у
концентрації 5 мкг/мл на 3 та 9 год дії виявлено достовірне зростання
вмісту ATP на 25-30 % порівняно з контролем. При дії коптизину протягом
3 та 9 год у концентраціях 5 та 20 мкг/мл достовірних змін вмісту ATP у
клітинах відносно контролю виявлено не було, проте при використанні
алкалоїду в концентрації 20 мкг/мл вміст ATP на 24 год у клітинах
знижувався до 8 нмоль/млн клітин, що становить 55 % відносно контролю.

Вплив алкалоїдів чистотілу на конформаційну стабільність та структурну
цілісність ДНК та хроматину. Виявлено, що сангвінарин і хелеритрини є
сильними інтеркаляторами у структуру ДНК клітин лімфоми NK/Ly і в
концентрації 20 мкМ викликають підвищення температури плавлення ДНК на
17,5 (С та 18,5 (С, відповідно (температура плавлення інтактної ДНК
становила 63,5 (С). У тій же концентрації коптизин підвищував
температуру плавлення на 3,5 (С. Хелідонін практично не впливав на
температуру термоденатурації ДНК.

Сангвінарин, хелеритрин та коптизин виявили здатність витісняти
метиловий зелений із його комплексу з ДНК, причому сангвінарин та
хелеритрин були значно ефективнішими, ніж коптизин. Це вказує на те, що
коптизин володіє меншою спорідненістю до ДНК лімфомних клітин NK/Ly
порівняно із сангвінарином та хелеритрином. Хелідонін не володів
здатністю до витіснення метилового зеленого з його комплексу з ДНК, що
вказує на відсутність у цього алкалоїду ДНК-інтеркаляторних
властивостей. Порівняння півмаксимальних ефектів витіснення різними
алкалоїдами метилового зеленого із його комплексу з ДНК показало, що
сангвінарин має у 1,6 рази вищу спорідненість до ДНК лімфомних клітин
NK/Ly, ніж хелеритрин. За показником витіснення метилового зеленого
останній є приблизно в 1,7 рази сильнішим інтеркалятором у структуру
ДНК, ніж дауноміцин, тоді як коптизин володіє приблизно у 13 разів
меншою спорідненістю до ДНК, ніж хелеритрин, і подібний за цим
показником до актиноміцину D.

За результатами електронної та флуоресцентної мікроскопії сангвінарин та
хелеритрин (дія протягом 6 год) зумовлюють агрегацію та конденсацію
хроматину клітини вздовж внутрішньої поверхні ядерної мембрани лімфомних
клітин лінії CCRF-CEM та МТ-4. Після 6 год інкубації клітин CCRF-CEM із
хелідоніном або коптизином у концентраціях, які відповідають ІС50,
помітних змін у структурі ядра виявлено не було. Такі ознаки апоптозу,
як високий ступінь конденсації хроматину у вигляді „чорної дірки” та
розпад ядра на окремі фрагменти, мали місце на 24 год дії хелідоніну.

Рис. 6. Електрофорез ДНК клітин лінії CCRF-СЕМ після 24 год їх інкубації
з алкалоїдами:1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,5 мкг/мл; 3 –
сангвінарин, 1 мкг/мл; 4 – хелеритрин, 0,5 мкг/мл; 5 – хелеритрин, 1,5
мкг/мл; 6 – коптизин, 1 мкг/мл; 7 – коптизин, 10 мкг/мл; 8 – хелідонін,
0,5 мкг/мл; 9 – хелідонін, 5 мкг/мл.

За результатами електрофорезу ДНК у гелі агарози (рис. 6), найбільш
вираженою здатністю викликати олігонуклеосомну фрагментацію ДНК клітин
CCRF-CEM володіли сангвінарин, хелеритрин та хелідонін.

Сангвінарин та хелеритрин виявляли найбільш виражений ефект на
формування ДНК-комет із високим ступенем фрагментації ДНК (3 та 4 клас
комет). Після 6 та 24 год інкубації клітин МТ-4 з сангвінарином або
хелеритрином у концентраціях 0,5 та 1 мкг/мл, відповідно, близько 7 %
клітин формували ДНК-комети (рис. 7). Після підвищення концентрації
сангвінарину до 1 мкг/мл, вже на 6 год 70 % клітин мали високий ступінь
пошкодження ДНК. Подібний ефект на формування ДНК-комет виявляв
хелеритрин у концентрації 4 мкг/мл, оскільки на 6 год кількість
ДНК-комет із високим ступенем пошкодження ДНК перевищувала 75%. Після 6
год інкубації клітин МТ-4 із коптизином чи хелідоніном відсоток
ДНК-комет був близьким до контролю (рис. 7). При дії коптизину на 24 год
кількість ДНК-комет із високим рівнем пошкодження ДНК становила близько
13%. Хелідонін на 6 год дії у концентрації 8 мкг/мл не впливав на
формування ДНК-комет клітинами МТ-4, проте цей показник зростав у
порівнянні з контролем на 24 год і становив близько 34 %.

Встановлено, що здатність алкалоїдів інтеркалювати у структуру ДНК
клітин лімфоми NK/Ly корелює з їх цитотоксичною активністю щодо цих
клітин (коефіцієнт кореляції становить 0,98) (Kaminskyy et al, 2006).
Аналіз отриманих даних також свідчить про подібну залежність між
здатністю алкалоїдів інтеркалювати в структуру ДНК і рівнем порушення
ними процесів поглинання катіонів кальцію і окисного фосфорилювання у
мітохондріях. Така подібність у характері впливу сангвінарину,
хелеритрину чи коптизину дозволяє висловити припущення, що вплив цих
алкалоїдів на дисипацію трансмембранного потенціалу мітохондрій може
бути пов’язаний з їхнім впливом на функції внутрішньої мітохондріальної
мембрани через посередництво мітохондріальної ДНК. Відомо, що ДНК цієї
органели контактує із внутрішньою мембраною мітохондрій у ділянці центру
ori (Albring M. et al, 1977, Borst P. et al, 1972).

Рис. 7. Вплив алкалоїдів чистотілу на пошкодження ДНК клітин лінії МТ-4
після 6 та 24 год інкубації за результатами мікроелектрофорезу ДНК
окремих клітин при слаболужному рН: 1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,5
мкг/мл; 3 – сангвінарин, 1 мкг/мл; 4 – хелеритрин, 1 мкг/мл; 5 –
хелеритрин, 2 мкг/мл; 6 – хелеритрин, 4 мкг/мл; 7 – коптизин, 10 мкг/мл.
8 – хелідонін, 8 мкг/мл

* – p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020