Маркери малігнізації у цитологічній діагностиці захворювань щитоподібної залози (автореферат)

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

КІНІЧЕНКО Вікторія Геннадіївна

УДК: 616.441 – 006.6 – 089

Маркери малігнізації у цитологічній діагностиці захворювань щитоподібної
залози

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Львів – 2005

Дисертація є рукописом.

Роботу виконано в Українському науково-практичному центрі ендокринної
хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України

Наукові керівники:

Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор
Благодаров Володимир Миколайович, Національний медичний університет
імені О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра патологічної анатомії,
завідувач.

Заслужений лікар України, кандидат медичних наук Ларін Олександр
Сергійович, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії,
трансплантації ендокринних органів і тканин, директор, Київ.

Офіційні опоненти:

Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор
Галахін Костянтин Олександрович, Інститут онкології АМН України, відділ
патологічної анатомії, керівник, Київ.

доктор медичних наук, професор Боднар Ярослав Ярославович,
Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського
МОЗ України, Інститут морфології, кафедра патологічної анатомії з
секційним курсом та судової медицини, завідувач, Тернопіль.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ
України, кафедра патологічної анатомії, м. Харків.

Захист відбудеться “ 14 “ грудня 2005 р. о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.600.03 Львівського національного
медичного університету імені Данила Галицького МОЗ України (79010, м.
Львів, вул. Пекарська, 52).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного
медичного університету імені Данила Галицького України (79000, м. Львів,
вул. Січових Стрільців, 6).

Автореферат розісланий “ 4 ” листопада 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, Федорів Я. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Частота захворюваності на вузловий зоб залежно від
віку та ендемічності зони проживання досліджуваної популяції коливається
від 2 до 7 %, обумовлюючи ряд питань із діагностики та вибору методу
лікування (Tunbridge W.M., 1977). У свою чергу, серед пацієнтів із
вузловим зобом рак щитоподібної залози (РЩЗ) зустрічається досить рідко
та виявляється приблизно у 5 % випадків (Ramacciotti C.E., 1984). Так,
за даними літератури, частота захворюваності на РЩЗ становить 204-233
тис. пацієнтів на рік, що складає менше від 0,1 % всієї популяції (Hay
I.D., 2002). В Україні у 2001 р. було діагностовано приблизно 2 тис.
випадків РЩЗ і у 2002 році – понад 4 тис. Між 1990 і 1997 рр. в Україні
серед дітей і дорослих зареєстровано 10-кратне збільшення захворюваності
на РЩЗ (Ліхтарьов І.А., 1994).

В існуючій ситуації необхідним є широке впровадження скринінґових
досліджень із метою ранньої діагностики злоякісних новоутворень
щитоподібної залози (ЩЗ). На теперішній час визнано, що тонкоголкова
аспіраційна пункційна біопсія (ТАПБ) є адекватним методом морфологічної
діагностики вузлів ЩЗ, і результати цитологічного аналізу можуть значною
мірою впливати на лікувальну тактику (Heim M., 1984). Проте у деяких
випадках цитологічні ознаки доброякісних і злоякісних пухлин ЩЗ є
схожими, що ускладнює цитологічний аналіз і призводить до діагностичних
помилок, які можуть бути причиною хибного вибору тактики лікування
захворювань ЩЗ (Gharib H., 1994).

З метою підвищення діагностичної ефективності ТАПБ останніми роками
розроблено значну кількість нових методів, в основу яких було покладено
визначення біохімічних особливостей доброякісних і злоякісних пухлин. Як
“маркери злоякісності” використовувалися певні речовини, що дозволило
виявляти структурно-функціональні зміни в тканинах у процесі її
пухлинної трансформації (Okamoto T., 2001; Puxeddu E., 2001).

Дослідження молекулярних змін у пухлинах ЩЗ показали, що вже на ранніх
стадіях пухлинного росту визначаються зміни в експресії тиреоїдної
пероксидази (ТПО) (De Micco С., 2000). Моноклональні антитіла МоАт 47,
спрямовані проти ТПО, здатні маркувати нормальні клітини ЩЗ та клітини
доброякісних пухлин, але не реагують із клітинами злоякісних пухлин.
Також показано, що зменшення імунореактивності ТПО до МоАт 47 корелює з
ростом проліферативної активності та появою морфологічних ознак атипії
клітин (Garcia S., 1998).

Результати дослідження дипептидил-амінопептидази IV (ДАП IV) показали,
що цей ензим бере участь в онкоґенезі ЩЗ, а цитохімічне визначення ДАП
IV розглядається як маркер злоякісності клітин (Aratake Y., 1991).

Наведені вище дані є об’єктивною підставою для ретельнішого вивчення
можливостей застосування імуноцитохімічного дослідження ТПО та
цитохімічного визначення активності ДАП IV в аспіратах вузлів ЩЗ і
обґрунтування доцільності комплексного використання цих методів у
цитологічній діагностиці пухлин ЩЗ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках планових наукових досліджень Українського науково-практичного
центру ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин
МОЗ України, вона є частиною науково-дослідної роботи хірургічного
відділу за № 0198U001478 “Дослідження стану гіпофізарно-тиреоїдної
системи в осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС,
хворих на злоякісні та доброякісні пухлини щитоподібної залози на етапах
їх лікування” (2001-2004 рр.). Автор є виконавцем фрагмента даної НДР.

Мета дослідження. Встановити діагностичну ефективність різних маркерів
маліґнізації за захворювань ЩЗ шляхом комплексного застосування сучасних
методів морфологічного аналізу. Для реалізації мети поставлено такі
завдання.

Задачі дослідження:

Оцінити ефективність ТАПБ у встановленні характеру пухлинного процесу у
ЩЗ і виборі тактики лікування хворих.

Визначити рівень експресії ТПО з використанням МоАТ 47 у доброякісних,
злоякісних і потенційно злоякісних (атипових) вузлах щитоподібної
залози.

Встановити значення імуноцитохімічного дослідження з МоАт 47 для вибору
терапевтичної тактики лікування захворювань ЩЗ.

Порівняти активність ДАП IV у клітинах доброякісних і злоякісних пухлин
ЩЗ.

Провести порівняльний аналіз окремих методів морфологічної діагностики
онкологічних захворювань ЩЗ.

Об’єкт дослідження – цитологічні маркери злоякісного процесу.

Предмет дослідження – експресія маркерів злоякісності (тиреоїдної
пероксидази та дипептидил-амінопептидази IV) за пухлинної патології
щитоподібної залози.

Методи дослідження: здійснено комплексне морфологічне дослідження
матеріалу ТАПБ від пацієнтів із вузловим зобом ЩЗ, яке складалося із
загальноклінічного обстеження хворих, включаючи сонографію ЩЗ, ТАПБ
вузлів ЩЗ, загальноприйнятих методів гісто- та цитологічного аналізу з
використанням сучасних імуноцитохімічних реакцій для встановлення
маркерів маліґнізації ЩЗ, а також методів статистичної обробки
результатів дослідження. Поєднання морфологічних методів із порівняльним
аналізом одержаних результатів дозволило охарактеризувати морфогенез
вузлів ЩЗ, а також деталізувати етапи онкогенезу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено ефективність
імуноцитохімічного визначення ТПО з МоАт 47 у цитологічній діагностиці
вузлів ЩЗ. Здатність цих антитіл маркувати нормальні клітини та клітини
доброякісних пухлин ЩЗ визначається як маркер доброякісності, яка
корелює із зменшенням імунореактивності тиреоїдної пероксидази до МоАт
47, ростом проліферативної активності та появою морфологічних ознак
атипії клітин. Використання імуноцитохімічного дослідження ТПО з МоАт 47
дозволяє визначити зміни в експресії цього ензиму вже на ранніх стадіях
росту пухлини. У роботі вперше на аспіратах вузлів ЩЗ встановлено
ефективність цитохімічного визначення активності ДАП IV, що дозволяє
вірно діагностувати всі злоякісні пухлини та розцінювати підвищену
активність ДАП IV як точний маркер злоякісності пухлин ЩЗ.

У роботі вперше проведено порівняльний аналіз загальноприйнятого
цитологічного дослідження та сучасних методів морфологічного аналізу
захворювань ЩЗ, який дозволив встановити діагностичну ефективність
комплексного застосування імуноцитохімічного дослідження ТПО з МоАт 47 і
цитохімічного визначення активності ДАП IV у цитологічній діагностиці
вузлів ЩЗ.

Практичне значення одержаних результатів. Відповідно до потреб
практичної ендокринології на підставі результатів дослідження
запропоновано комплексне застосування сучасних імуноцитохімічних методів
із використанням маркерів маліґнізації та загальноприйнятого
цитологічного аналізу у діагностиці захворювань ЩЗ на передопераційному
етапі. Застосування цих маркерів дозволяє уникнути хибно-негативних
результатів, тобто усуває ризик гіподіагностики раку ЩЗ. Використання
такого методичного підходу дозволяє також зменшити кількість
хибно-позитивних результатів у порівнянні із загальноприйнятим
морфологічним дослідженням, що дає можливість зменшити кількість
неадекватних хірургічних втручань із приводу доброякісних утворень ЩЗ.
Використання імуноцитохімічного дослідження ТПО з МоАт 47 полегшує
диференційну діагностику доброякісних і злоякісних новоутворень ЩЗ, а
цитохімічне визначення активності ДАП IV є маркером раку.

Отже, вищевказані методи можуть застосовуватись як скринінґові для всіх
пацієнтів із вузловою патологією ЩЗ для підвищення ефективності
цитологічної діагностики захворювань ЩЗ, що дозволяє зменшити кількість
невиправданих хірургічних втручань без ризику пропустити рак. За
матеріалами виконаної роботи розроблено та впроваджено у практику
оптимальні схеми цитологічного дослідження аспіратів вузлів ЩЗ із
застосуванням імуноцитохімічних маркерів, встановлено об’єктивні
морфологічні критерії вибору терапевтичної тактики лікування хворих на
онкопатологію ЩЗ на базі терапевтичного та хірургічного відділів
Українського науково-практичного центру ендокринної хірургії,
трансплантації ендокринних органів і тканин (УНПЦЕХТЕОіТ). Результати
роботи доповнюють сучасні уявлення про онко- та морфогенез захворювань
ЩЗ, а їх використання у спеціалізованих клініках може підвищити
ефективність роботи останніх.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто розроблено основні
теоретичні та практичні положення роботи, проведено інформаційний пошук
та аналіз першоджерел наукової літератури. Автор самостійно провела
цитологічні, цитохімічні, імуноцитохімічні, гістологічні дослідження,
виконала аналіз та узагальнення отриманих результатів. Основні
положення, що виносяться на захист, і висновки дисертації сформульовані
автором спільно з науковими керівниками. Клінічне забезпечення роботи
здійснено під керівництвом к.м.н. О.С. Ларіна: підбір пацієнтів,
виконання ТАПБ вузлів ЩЗ, допомога у статистичній обробці матеріалу.
Гістологічна верифікація вузлової патології ЩЗ під керівництвом проф.
В.М. Благодарова дозволила адекватно порівняти результати цитологічних
досліджень. Цитологічні, гістологічні, імуноцитохімічні дослідження та
ТАПБ вузлів ЩЗ виконано на базі відділення патоморфології та цитології
УНПЦЕХТЕОіТ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідалися та обговорювалися на науково-практичних конференціях
республіканського та міжнародного рівнів: 44-й науково-практичній
конференції з актуальних проблем ендокринології (Харків, 2000); I з’їзді
асоціації цитологів України (Київ, 2000); ХХ з’їзді хірургів України
(Тернопіль, 2002); Кримській республіканській конференції з актуальних
питань доброякісних і злоякісних захворювань щитоподібної залози
(Сімферополь, 2002); науково-практичній конференції з міжнародною участю
“Сучасні підходи до діагностики та лікування вузлового зоба” (Київ,
2002), науково-практичній конференції “Йододефіцитні захворювання
щитоподібної залози. Лікувальна тактика, лікування” (Тернопіль, 2005),
а також на розширеному засіданні Вченої ради УНПЦЕХТЕОіТ разом із
співробітниками кафедри патологічної анатомії НМУ імені О.О.Богомольця,
науковими співробітниками лабораторії цитології та патоморфології
Інституту онкології АМН України (2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей (4 з них у фахових
виданнях, рекомендованих ВАК України), 3 роботи опубліковано у
матеріалах наукових з’їздів і конференцій.

Структура дисертації. Роботу викладено на 160 сторінках, вона
складається зі змісту, переліку умовних позначень, вступу, огляду
літератури, розділу, в якому охарактеризовано матеріал і методи
дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення
результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних
першоджерел, який включає 265 бібліографічних описів. Дисертацію
проілюстровано 67 рисунками та 20 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Морфологічне дослідження виконано на
матеріалі аспіратів вузлів ЩЗ, отриманих під час тонкоголкової
аспіраційної пункційної біопсії від 240 хворих. ТАПБ вузлів ЩЗ
виконувалася безпосередньо дисертантом із використанням голок 25G. Під
контролем УЗД проводилися пункції вузлів залози, що не пальпувалися.
Ефективність проведеної ТАПБ оцінювалась одразу ж після маніпуляції
шляхом забарвлення одного зі скелець розчином толуїдинового синього.

Досліджених 240 хворих було розподілено на дві групи: для 150 пацієнтів
І групи виконували цитологічне дослідження та імуноцитохімічне
дослідження із МоАт 47, для 90 пацієнтів ІІ групи цитологічний діагноз
встановлювався за результатами імуноцитохімічного дослідження ТПО та
цитохімічного визначення активності ДАП IV.

Верифікація цитологічних висновків за допомогою патогістологічних
методів, яка базувалася на критеріях загальноприйнятої класифікації ВООЗ
пухлин ЩЗ (1988), дала можливість виявити у 150 пацієнтів І групи 98
доброякісних захворювань ЩЗ і 26 злоякісних пухлин залози, а у 90
пацієнтів ІІ групи – 77 доброякісних захворювань ЩЗ і 13 злоякісних
пухлин.

Аспірати щитоподібної залози та післяопераційний матеріал оброблено з
використанням цитологічних, імуноцитохімічних, цитохімічних і
гістологічних методів дослідження.

Для цитологічного дослідження аспірати забарвлювали за методом
Май–Грюнвальда–Гімза (МГГ). У відповідності до методичних рекомендацій
Gharib H. і співавт. (1994) цитологічні висновки розподілено на 4 типи:
неінформативні, доброякісні, сумнівні та злоякісні.

Для імуноцитохімічного дослідження аспірати фіксовано впродовж 24 годин
при температурі 4?С, у подальшому для інактивації ендогенної
пероксидази інкубували 10 хвилин у 0,3 % розчині перекису водню.
Активність ферменту досліджено із використанням моноклональних антитіл
47 (Coger, Франція) у розведенні 1:50 із застосуванням
стрептавідин–біотин–пероксидазного універсального набору (DAKO Glostrup,
Данія) за методикою, рекомендованою De Micco C. і співавт. (1994).

Для оцінки результатів імунологічної реакції з МоАт 47 підраховували
відсоток клітин, що прореагували з антитілами, а також враховували
якість і розташування реакції у цитоплазмі клітин. Доброякісними вважали
такі утворення щитоподібної залози, у цитологічних препаратах яких
кількість позитивно маркірованих фолікулярних клітин перевищувала 60 %,
злоякісними – ті, у цитологічних препаратах яких вміст таких клітин був
меншим.

Для цитохімічного визначення активності дипептидил–амінопептидази IV
аспіраційний матеріал фіксували та забарвлювали відповідно до методичних
рекомендацій Aratake Y. і співавт. (1991). Активність ферменту оцінювали
за інтенсивністю реакції та відсотком позитивно маркірованих
фолікулярних клітин і позначали індексом від до 4 (0 – 0%, 1 – <25 %, 2 – 25-50 %, 3 – 50-75 %, 4 – >75 %). Загальний індекс реакції визначали
множенням індексу інтенсивності на індекс відсотка маркірованих клітин.

Для світлооптичного дослідження післяопераційний матеріал фіксували у 7
% розчині формаліну, заключали в парафін і забарвлювали гематоксиліном
та еозином.

Для оцінки результатів цитологічного дослідження аспіратів ЩЗ
використано критерії діагностичної інформативності, що застосовуються у
лабораторній діагностиці (Pichon M.F., 2001). Згідно з цими
рекомендаціями, діагностична чутливість (ДЧ) – це відсоток правильно
діагностованих злоякісних новоутворень, діагностична специфічність (ДС)
– відсоток правильно діагностованих доброякісних новоутворень,
діагностична ефективність (ДЕ) – відсоток сукупності усіх правильно
діагностованих випадків.

Справжньо-позитивними вважались результати цитологічного дослідження про
злоякісну природу пухлини, що були підтверджені даними гістологічного
дослідження. За хибно-позитивні приймали результати, які за даними
цитологічного дослідження були злоякісними, а після гістологічного
дослідження встановлювався діагноз доброякісної пухлини.
Справжньо-негативними результатами були доброякісні або сумнівні випадки
цитологічного дослідження, які за результатами гістологічного
дослідження відносились до групи доброякісних пухлин ЩЗ. Слід зазначити,
що до хибно-позитивних результатів відносили і сумнівні цитологічні
висновки.

Результати дослідження. За результатами цитологічних досліджень
доброякісні пухлини найчастіше були тотожними колоїдним вузлам,
макрофолікулярним аденомам або тиреоїдитам. Серед 150 хворих І групи у
98 виявлено пухлини доброякісної природи (65 %), підтверджені
гістологічно.

Згідно з результатами стандартного цитологічного дослідження (І група
пацієнтів) отримано 26 цитологічних висновків щодо злоякісної природи
пухлин ЩЗ, що складає 17 % усіх випадків. Після їх гістологічного
дослідження діагноз раку підтверджений у 22 випадках (84,6 %), у 4
випадках (15,4 %) діагноз раку не підтверджено.

На особливу увагу заслуговує третя група, тобто сумнівні результати
цитологічного дослідження. За даними літератури, вони складають від 5 %
до 30 % усіх цитологічних результатів, що підтверджено і отриманим нами
результатами. Так, серед 150 пацієнтів І групи у 26 випадках (17 %)
отримано сумнівні висновки. Після гістологічного дослідження діагноз
раку підтверджено лише у 4 випадках, а у 22 виявлено доброякісні
пухлини: 8 фолікулярних аденом, 5 атипових аденом, 4 аденоми з Б-клітин,
1 фетальна аденома та 1 тиреоїдит із цитологічними ознаками атипії
клітин.

Отже, основну проблему у цитологічній діагностиці вузлів ЩЗ складає
група так званих сумнівних діагнозів. До неї відносять випадки із
цитологічними ознаками атипії, що нагадують “фолікулярні неоплазії”. Цей
діагноз встановлюється на основі цитологічних досліджень, коли в
епітеліальних клітинах, згрупованих у мікрофолікулярні структури, наявні
або відсутні атипія ядер та їх мітотична активність.

У подібних випадках діагноз фолікулярного раку ЩЗ (ФРЩЗ) може бути
встановлений лише за наявності капсулярної або судинної інвазії. Звідси
й висновок, що препарати тканини з центральних зон фолікулярної пухлини
можуть бути сумнівними, хоча цього ще не досить для підтвердження
діагнозу ФРЩЗ. Водночас, цитологічний діагноз “фолікулярної неоплазії”
розглядається як “діаґностично сіра зона” у патології ЩЗ, коли
відрізнити фолікулярну аденому від фолікулярного раку неможливо (Baloch
Z.W., 2002). Результати власних досліджень показали, що навіть після
повторного дослідження випадків, які були сумнівними за результатами
стандартного цитологічного дослідження, не вдається достовірно
відрізнити доброякісний процес від злоякісного. Тому є підстави вважати,
що у подібних випадках не існує можливості виключити РЩЗ, і такі
пацієнти підлягають хірургічному лікуванню.

У власному дослідженні для статистичного аналізу результатів цитологічні
висновки про доброякісний характер процесу приймались як негативні, а
сумнівні та злоякісні – як позитивні. Аналіз отриманих результатів у
цьому напрямку показує, що стандартне цитологічне дослідження для
діагностики раку є достатньо інформативним методом, чутливість якого в
усіх спостереженнях складає майже 100 %. Проте специфічність його є
низькою (79 %), а кількість хибно-позитивних результатів складає 17,3 %.
Загалом діагностична ефективність стандартного цитологічного
дослідження, за нашими даними, дорівнює 82,7 %.

Отже, на підставі отриманих даних можна вважати, що використання
традиційних методів цитологічного дослідження наразі має певні обмеження
через досить значну частку хибно–позитивних результатів (17,3 %). Тому в
нашій роботі ми використовували імуноцитохімічне визначенні ТПО із МоАТ
47 у комбінації зі стандартним цитологічним дослідженням.

Аналіз отриманих даних імуноцитохімічного дослідження ТПО із МоАт 47 у
хворих І групи в усіх випадках доброякісної патології ЩЗ виявив
позитивні результати, що свідчить про здатність МоАт 47 маркувати
клітини нормальної ЩЗ і доброякісних пухлин. Для оцінки результатів
імунологічної реакції з МоАт 47 підраховували відсоток позитивно
маркірованих клітин, а також враховували якість реакції в їх цитоплазмі.
На основі цих даних нами встановлено два види результатів: доброякісними
вважали цитологічні препарати, де понад 60 % клітин були позитивно
маркіровані антитілами, злоякісними – ті, в яких кількість фолікулярних
клітин, що прореагували із МоАт 47, була ?60 %.

Серед 26 хворих І групи (рак ЩЗ за результатами дослідження з МоАт 47),
у 22 після гістологічного дослідження діагноз підтверджено. У 20 з них
при імуноцитохімічному дослідженні визначалася негативна реакція з МоАт
47, а у 2 випадках виявлено понад 60 % маркірованих клітин
(хибно-негативні результати).

V

??????над 60 % (хибно-негативний результат). У І групі кількість
хибно-позитивних результатів досліджень з МоАт 47 склала 5 випадків. У
всіх цих випадках при імуноцитохімічному дослідженні визначалося менше
60 % позитивно маркірованих клітин, а після гістологічного дослідження
було встановлено діагноз доброякісної патології.

Отже, отримані дані свідчать, що імуноцитохімічне дослідження з МоАт 47
залишається недосконалим без урахування результатів стандартного
цитологічного дослідження, тому що при оцінці результатів реакції, крім
артефактів, виявляються якісні або кількісні її зміни у випадках
доброякісних пухлин із цитологічними ознаками атипії.

У 3 випадках, що були визнані як доброякісна патологія за результатами
імуноцитохімічного дослідження (>60 % позитивно маркірованих клітин),
після гістологічного дослідження у 2 хворих встановлено діагноз
папілярного раку (ПР) та в 1 випадку – діагноз фолікулярного раку (ФР).
У 2 пацієнтів із ПР позитивну реакцію з МоАт 47 виявлено у 100 % клітин.
У цих випадках імуноцитохімічне дослідження проводилося на не
репрезентативних препаратах, де виявлялися лише нормальні клітини ЩЗ.
Утім при стандартному цитологічному дослідженні цих випадків було
поставлено діагноз раку, оскільки в препаратах виявлялися клітини з
ознаками атипії.

У випадку ФР виявлялося 75 % позитивно маркірованих МоАт 47 клітин. У
цих препаратах визначалися пласти доброякісних клітин із чіткою
позитивною реакцією, а також не маркіровані клітини з характерними
морфологічними ознаками ФР.

Отже, 2 хибно-негативні випадки з МоАт 47 були результатом недоліків
технологічного приготування препаратів, а у випадку ФР, де визначалися
цитологічні ознаки атипії клітин, у 75 % клітин виявлено позитивну
реакцію. З іншого боку, одержані результати підтверджують дані
літератури про зникнення або зниження реакції, яка відбувається за
рахунок якісних або кількісних змін молекули ТПО, що свідчить про зміну
антигенної експресії епітопу, який специфічно розпізнається МоАт 47.

На особливу увагу заслуговують випадки атипових аденом, у яких при
імуноцитохімічному дослідженні виявлялося зменшення інтенсивності
реакції з МоАт 47 і зникнення її навколо ядра клітини.

З метою стандартизації результатів імуноцитохімічного дослідження ми
визначали відсоток позитивно маркірованих МоАт 47 клітин без урахування
інтенсивності реакції та змін її топографічного розташування, розділивши
результати дослідження на дві групи: висновки про доброякісний процес
(кількість позитивно маркірованих клітин понад 60 %) і висновки про
злоякісний процес (кількість позитивно маркірованих клітин ?60 %).

Згідно з результатами порівняння імунологічної реакції із МоАт 47
кожного відсоткового інтервалу із остаточними гістологічними діагнозами
у більшості доброякісних пухлин визначалося понад 80 % позитивно
маркірованих МоАт 47 клітин. У 5 хибно-позитивних випадках кількість
клітин, що позитивно прореагували з МоАТ 47, склала менше 60 % (1
фолікулярна аденома, 3 атипові аденоми, 1 тиреоїдит). У всіх випадках
злоякісних пухлин імунологічна реакція або не визначалася взагалі, або
складала <60 % позитивно маркірованих МоАт 47 клітин. Отримані результати свідчать про існування певних обмежень даного методу дослідження. Тому у власних дослідженнях проводилось імуноцитохімічне визначення ТПО із МоАТ 47 у комбінації зі стандартним цитологічним дослідженням. При цьому застосування імуноцитохімічного дослідження із МоАт 47 при аналізі доброякісних пухлин ЩЗ відіграє важливу роль у підтвердженні доброякісного характеру процесу. У випадках злоякісних пухлин ЩЗ результати імуноцитохімічного дослідження також доповнюють результати стандартного цитологічного дослідження. У сумнівних випадках діагноз встановлюється на основі комплексного аналізу цитологічних ознак клітин і результатів імуноцитохімічного дослідження (табл. 1). Результати нашого дослідження дали можливість вивчити також умови, за яких виникали розбіжності між стандартним цитологічним дослідженням та імуноцитохімічним визначенням ТПО із МоАт 47. Це відбувалось у випадках неправильного забору матеріалу або приготування цитологічних препаратів. У випадках атипових аденом із вираженими цитологічними ознаками атипії клітин і нерівномірною за інтенсивністю та локалізацією реакцією таких клітин із МоАт 47 остаточний діагноз встановлювався лише після гістологічного дослідження. Розбіжності між двома методами також виявлялися при дослідженні доброякісних захворювань із цитологічними ознаками дистрофії та атипії клітин на тлі нерівномірної реакції їх із МоАт 47. Таблиця 1 Результати комплексного застосування стандартного цитологічного та імуноцитохімічного досліджень у порівнянні з гістологічними діагнозами Гістологія кількість випадків Цитологія МоАт 47 Цитологія/МоАт 47 Д Абс. к., (%) С/З Абс. к., (%) > 60 %

Абс. к., (%)

? 60 %

Абс. к., (%)

Д

Абс. к., (%)

З

Абс. к., (%)

Фолікулярна аденома

74 66

(89 %) 8

(10,8 %) 73

(98,6 %) 1

(1,4 %) 73

(98,6%) 1*

(1,4 %)

Аденома із Б-клітин

5 1

(20 %) 4

(80 %) 5

(100 %) 0

(0 %) 5

(100 %) 0

(0 %)

Фетальна аденома

8 7

(87,5 %) 1

(12,5 %) 8

(100 %) 0

(0 %) 8

(100 %) 0

(0 %)

Атипова аденома

12 4

(33 %) 8

(66 %) 9

(75 %) 3

(25 %) 9

(75 %) 3*

(25 %)

Тиреоїдит

4 2

(50 %) 2

(50 %) 3

(75 %) 1

(25 %) 3

(75 %) 1*

(25 %)

Гіперпластичний зоб

9 7

(77 %) 2

(22 %) 9

(100 %) 0

(0 %) 9

(100 %) 0

(0 %)

Багатовузловий зоб

12 11

(91,6 %) 1

(8,3 %) 12

(100 %) 0

(0 %) 12

(100 %) 0

(0 %)

Папілярний рак

22 0

(0 %) 22

(100 %) 2

(9 %) 20

(90,9 %) 0

(0 %) 22

(100 %)

Фолікулярний рак

4 0

(0 %) 4

(100 %) 1

(25 %) 3

(75 %) 0

(0 %) 4

(100 %)

Всього

150 98

(65,3 %) 52

(34,6 %) 122

(81,3 %) 28

(18,6 %) 119

(79,3%) 31

(20,6%)

* хибно-позитивні результати, Д – доброякісні результати, С – сумнівні
результати,

З – злоякісні результати, Абс. к. – абсолютна кількість.

Результати проведеного комплексного стандартного цитологічного
дослідження та імуноцитохімічного визначення ТПО із МоАТ 47 були
коректовані з урахуванням можливих розбіжностей між цими методами за
умов порівняння їх із гістологічними діагнозами.

Згідно з результатами статистичного аналізу комплексного застосування
цих методів хибно-негативні результати в усіх дослідженнях були
відсутні, а діагностична чутливість самого методу склала 100 %, тобто
повністю виключалася можливість пропустити рак. Використання цього
методу дозволило нам досягти підвищення діагностичної специфічності (96
%) у порівнянні зі стандартним цитологічним дослідженням (79 %). Отже,
при комплексному використанні даних методів діагностична ефективність
цитологічного дослідження захворювань ЩЗ склала 96,6 %.

У ІІ групі, що включала 90 пацієнтів, ми намагались оцінити діагностичну
ефективність комбінованого використання імуноцитохімічного дослідження
ТПО із МоАт 47 і цитохімічного визначення активності ДАП IV. При
цитохімічному визначенні активності ДАП IV в аспіратах у всіх 13
випадках злоякісних пухлин виявлялася позитивна реакція у фолікулярних
клітинах, тобто у власних дослідженнях діагностовано всі злоякісні
пухлини. Це підтверджує дані літератури про те, що підвищена активність
ДАП IV є маркером злоякісності пухлин ЩЗ.

Проте серед 77 хворих цієї групи, в яких були гістологічно підтверджені
доброякісні захворювання, у 12 визначалася позитивна реакція ДАП IV із
загальним індексом від 4 до 12, і тому було зроблено висновок про
злоякісну природу пухлин. Отже, при застосуванні даного методу у власних
дослідженнях виявлено 12 хибно-позитивних результатів, а хибно-негативні
результати були відсутні. У даній групі у 5 пацієнтів, у яких
гістологічно були підтверджені доброякісні захворювання, при
імуноцитохімічному дослідженні ТПО кількість маркірованих МоАт 47 клітин
була меншою від 60 %. Ці випадки розцінено як хибно-позитивні, а
хибно-негативні результати були відсутні.

Отже, комбіноване застосування імуноцитохімічного дослідження ТПО з МоАт
47 і цитохімічного визначення активності ДАП IV у ІІ групі надало
можливості правильно встановити діагноз злоякісного процесу ЩЗ у 100 %
хворих, а хибно-негативні результати були відсутні. У цих випадках при
імуноцитохімічному дослідженні виявлялося <60 % позитивно маркірованих клітин із МоАт 47, а загальний індекс реакції ДАП IV складав від 4 до 12. У цілому діагностична чутливість даних методів склала 100 %, а діагностична ефективність їх застосування – 86,6 % для ДАП IV та 94,4 % для МоАт 47. Утім діагностична специфічність ДАП IV (86,6 %) була нижчою, ніж для МоАт 47 (93,5 %): кількість хибно-позитивних результатів при цитохімічному визначенні ДАП IV складала 12 випадків, а при імуноцитохімічному дослідженні із МоАт 47 – лише 5 (табл. 2). Таблиця 2 Порівняльна характеристика результатів дослідження МоАт 47 та ДАП IV із заключними гістологічними діагнозами (ІІ група) Гістологічний діагноз Кількість випадків ДАП IV МоАт 47 Індекс 0 – 3 Абс. к., (%) Індекс 4 – 12 Абс. к., (%) >60 %

Абс. к., (%)

?60 %

Абс. к., (%)

Фолікулярна аденома

50 42

(84 %) 8*

(16 %) 49

(98 %) 1*

(2 %)

Аденома із Б-клітин

1 1

(100 %) — — 1*

(100%)

Фетальна аденома

10 8

(80 %) 2*

(20 %) 8

(80 %) 2*

(20 %)

Атипова аденома

3 3

(100 %) — 3

(100 %) —

Хронічний тиреоїдит

4 3

(75 %) 1*

(25 %) 3

(75 %) 1*

(25 %)

Дифузний токсичний зоб

3 3

(100%) — 3

(100 %) —

Багатовузловий зоб

6 5

(83 %) 1*

(16 %) 6

(100 %) —

Папілярний рак

12 — 12

(100 %) — 12

(100%)

Фолікулярний рак

1 — 1

(100 %) — 1

(100%)

Всього

90 65

(72,2 %) 25

(27,7 %) 72

(80 %) 18

(20 %)

* хибно-позитивні результати, Абс. к. – абсолютна кількість.

У 12 випадках, що були хибно-позитивними за результатами цитохімічного
визначення активності ДАП IV, після гістологічного дослідження
встановлений діагноз доброякісного захворювання (8 фолікулярних аденом,
2 фетальні аденоми, 1 тиреоїдит та 1 багатовузловий зоб). У цих випадках
оцінка реакції з ДАП IV ускладнювалася внаслідок артефактів реакції,
обумовлених наявністю значної кількості елементів тла та макрофагів, що
нашаровувалися на фолікулярні клітини, викликаючи феномен посилення
реакції. Аналогічні зміни спостерігалися в онкоцитарних клітинах і
фолікулярному епітелії з цитологічними ознаками гіперплазії.

При імуноцитохімічному дослідженні з МоАт 47 із 77 випадків гістологічно
підтверджених доброякісних захворювань у 5 випадках хибно-позитивних
результатів визначалося менше 60 % клітин, що позитивно прореагували з
МоАт 47. Серед таких пухлин були: 1 аденома ембріональної будови, 1
фетальна аденома, 1 аденома з Б-клітин. У цих випадках виявлено
кількісні та якісні зміни імунологічної реакції з МоАт 47, що частково
може пояснюватися значними цитологічними ознаками атипії та дистрофії
фолікулярних клітин. Згідно з аналізом результатів дослідження МоАт 47
та ДАП IV лише один хибно-позитивний результат був загальним для обох
методів (у цьому випадку після гістологічного дослідження встановлено
діагноз тиреоїдиту).

Отже, імуноцитохімічне дослідження ТПО з МоАт 47 та цитохімічне
визначення активності ДАП IV можна вважати взаємодоповнюючими методами
дослідження. За результатами аналізу статистичних показників їх
комбінованого застосування діагностична чутливість їх залишається
незмінною і складає 100 %, хибно-негативних результатів не було, а
діагностична специфічність даного дослідження склала 98,6 %.

Наведені результати досліджень підтверджують дані літератури про те, що
імуноцитохімічне дослідження ТПО з МоАт 47 полегшує диференційну
діагностику добро- та злоякісних пухлин ЩЗ, а цитохімічне визначення
активності ДАП IV є маркером злоякісного процесу. Іншими словами, за
умов правильного виконання, обидва методи можуть застосовуватись як
скринінґовий тест для всіх пацієнтів із вузлами ЩЗ з метою підвищення
ефективності цитологічної діагностики доброякісних захворювань ЩЗ. При
цьому терапевтичне спостереження може бути тактикою вибору, а
хірургічних втручань можливо уникнути без ризику пропустити рак. На
основі результатів нашого дослідження логічно припустити, що дані
маркери можна застосовувати для виявлення раку, а також визначення
обсягу хірургічного втручання. Аналогічні результати отримані у
дослідженнях інших авторів, де показано, що у випадках із висновками
ТАПБ, що не викликають сумніву щодо малігнізації, експрес-гістологічне
дослідження рідко впливає на обсяг операції. Отже, у пацієнтів із такими
результатами ТАПБ доцільно проводити тиреоїдектомію, а
експрес-гістологічне дослідження використовувати переважно під час
ревізії стану лімфатичних вузлів. Крім того, результати наших досліджень
свідчать про те, що використання даних методів дозволяє зменшити
кількість хибно-позитивних результатів із 17% при стандартному
цитологічному дослідженні до 3,3 % при імуноцитохімічному дослідженні з
МоАт 47 і до 13,3 % при цитохімічному визначенні активності ДАП IV, а
застосування цих маркерів дає можливість підвищити діагностичну
специфічність і діагностичну ефективність методів цитологічної
діагностики пухлин ЩЗ у цілому.

ВИСНОВКИ

У дисертації вирішене актуальне наукове завдання, що полягає у
встановленні діагностичної ефективності маркерів малігнізації за
захворювань ЩЗ шляхом комплексного застосування сучасних методів
морфологічного аналізу: імуноцитохімічного дослідження тиреоїдної
пероксидази з МоАт 47 і цитохімічного визначення активності ДАП IV.

Провідна роль у діагностиці пухлинних захворювань ЩЗ належить ТАПБ із
комплексним морфологічним дослідженням аспіратів із використанням
маркерів малігнізації (МоАт 47 і ДАП IV) з метою селекції вузлів залози
для визначення лікувальної тактики.

Імуноцитохімічний аналіз аспіратів вузлів ЩЗ із використанням МоАт 47
показує абсолютну діагностичну чутливість (100 %) цього методу на основі
зниження експресії тиреоїдної пероксидази у клітинах злоякісної та
потенційно злоякісної природи, що є підставою для його широкого
використання при оперативному лікуванні пухлин ЩЗ.

Визначення нормального рівня експресії ТПО, що є об’єктивним критерієм
для встановлення доброякісного характеру пухлинного процесу, необхідно
розглядати як метод вибору в практичній ендокринології при обґрунтуванні
терапевтичної тактики без ризику пропустити рак залози.

Відсутність імуноцитохімічної реакції з МоАт 47 в аспіратах вузлів ЩЗ і
висока активність ДАП IV у них є характерною морфологічною ознакою
злоякісної природи пухлини, що дозволяє визначити обсяг оперативного
втручання на передопераційному етапі.

Комплексне використання маркерів малігнізації (МоАт 47 і ДАП IV ) у
діагностиці захворювань ЩЗ на передопераційному етапі дозволяє зменшити
відсоток неадекватних хірургічних втручань з приводу доброякісних пухлин
залози.

Використання імуноцитохімічного аналізу ТПО із МоАт 47 і цитохімічне
визначення активності ДАП IV виключає можливість хибно-позитивних
результатів і дозволяє підвищити діагностичну ефективність цитологічної
діагностики захворювань ЩЗ у цілому.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Савченко В.Г. Імуноцитохімічні та цитохімічні методи у діаґностиці раку
щитоподібної залози // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. –
2004. — №3. – C.23-27.

Савченко В.Г., Черенько С.М., Ларін О.С. Визначення активності
дипептидил-амінопептидази IV (ДАП IV) у цитологічній діагностиці
захворювань щитоподібної залози // Лабораторна діагностика. – 2003. – №
2. — C. 43-45.

Cherenko S.M. Gorobeyko M.B. Savchenko V.G. Molecular markers for
well-differentiated thyroid cancer // Experimental oncology. – 2002. –
V.24. – P.83-88.

Vasily V. Vasko, Jean Gaudart, Claude Allasia, Victoria Sanchenko, Julie
Di Cristofaro, Motoyasu Saji, Matthew D Ringel and Catherine De Micco
Thyroid follicular adenomas may display features of follicular carcinoma
and follicular variant of papillary carcinoma // Eur. J. of Endocrinol.
– 2004. – V.151. – P.1-9.

Ларін О.С., Черенько С.М., Горобейко М.Б., Паламарчук В.О., Кініченко
В.Г. Діагностика, хірургічне лікування та комбіноване лікування,
моніторинг пацієнтів хворих на рак щитоподібної залози: Методичні
рекомендації. – Київ, 2005. – 44 с.

Савченко В.Г. Роль тонкоголкової аспіраційної біопсії в діагностиці
вузлів щитоподібної залози // Доповідь на республіканській
науково-практичній конференції за міжнародною участю “Сучасні підходи до
діагностики та лікування вузлового зобу” (Київ, 18-19.10.2002). –
Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. – 2002. — №1(1). –
С.12-14.

Савченко В.Г. Цитологическая диагностика узлов щитовидной железы с
использованием маркеров малигнизации // Матеріали 44-ої щорічної
науково-практичної конференції “Актуальні проблеми ендокринології”
(Харків, 21-23 жовтня 2000): Тези доповідей. – Харків, 2000. – С. 26.

Савченко В.Г., Васько В.В., Ларин А.С. Использование маркеров
малигнизации в цитологической диагностике узлов щитовидной железы //
Матеріали VI з’їзду ендокринологів України (Київ, 23-25 травня 2001р.),
Ендокринологія. – 2001. – Т. 6, Додаток. – С. 258.

АНОТАЦІЯ

Кініченко В.Г. Маркери малігнізації у цитологічній діагностиці
захворювань щитоподібної залози. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за
спеціальністю 14.03.02 – патологічна анатомія. – Львівський національний
медичний університет імені Данила Галицького, Львів, 2005.

У дисертації визначено достовірне поліпшення діагностичної ефективності
комбінованого застосування стандартного цитологічного дослідження,
імуноцитохімічного визначення активності тиреоїдної пероксидази із
моноклональними антитілами 47 (МоАт 47) і визначення активності
дипептидил-амінопептидази IV (ДАП IV) у діагностиці захворювань
щитоподібної залози. Чутливість і специфічність стандартного
цитологічного дослідження склали 100 % і 79 % відповідно. При
комбінованому застосуванні імуноцитохімічного дослідження з МоАт 47 і
визначення активності ДАП IV чутливість метода склала 100 %, а його
специфічність – 98,6 %. Використання цих маркерів дозволяє підвищити
діагностичну ефективність ТАПБ, а також може застосовуватися не лише у
селекції вузлів ЩЗ для оперативного лікування, але й з метою визначення
обсягу хірургічного втручання.

Ключові слова: тонкоголкова аспіраційна пункційна біопсія, маркери
злоякісності, тиреоїдна пероксидаза, моноклональні антитіла 47 проти
ТПО, дипептидил–амінопептидаза IV.

АННОТАЦИЯ

Киниченко В.Г. Маркеры малигнизации в цитологической диагностике
заболеваний щитовидной железы. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по
специальности 14.03.02 – патологическая анатомия. – Львовский
национальный медицинский университет имени Данила Галицкого МЗ Украины,
Львов, 2005.

В диссертации установлено достоверное повышение диагностической
эффективности комбинированного применения стандартного цитологического
исследования, иммуноцитохимического определения активности тиреоидной
пероксидазы с моноклональными антителами 47 (МоАт 47) и определения
активности дипептидил-аминопептидазы IV (ДАП IV) в диагностике
заболеваний щитовидной железы.

ТАПБ с последующим цитологическим анализом является эффективным методом
в селекции узлов щитовидной железы для оперативного лечения, что
позволяет выявить болем 90 % злокачественных новообразований щитовидной
железы.

Снижение уровня экспрессии ТПО характерно для злокачественных клеток
потенциально злокачественных (атипичных) узлов щитовидной железы.
Использование этого метода позволяет выявить все злокачественные опухоли
щитовидной железы и рекомендовать оперативное лечение. Установление
факта нормального синтеза этого белка является объективным критерием
доброкачественной природы пунктируемого узла. Применение этого метода
может обосновывать выбор терапевтической тактики без риска пропустить
рак.

Отсутствие иммуноцитохимической реакции с МоАт 47 в фолликулярных
клетках пунктируемых узлов и высокая активность ДАП IV в этих же клетках
является абсолютным признаком злокачественности узла щитовидной железы.
В такой ситуации объем хирургического вмешательства может быть определен
на дооперационном этапе.

При комбинированном применении иммуноцитохимического исследования с МоАт
47 и определения активности ДАП IV чувствительность метода составила 100
%, а его специфичность – 98,6 %.

Применение комплекса цитологических, цитохимических и
иммуноцитохимических методов в изучении аспиратов узлов щитовидной
железы позволяет в предоперационном периоде достоверно установить
природу пунктируемого образования щитовидной железы и служить
обоснованием для определения оптимальной тактики лечения.

Ключевые слова: тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия, маркеры
злокачественности, тиреоидная пероксидаза, моноклональные антитела 47
против ТПО, дипептидил–аминопептидаза IV.

SUMMARY

V. Kinichenko. Malignancy markers in cytology diagnosis of diseases of
thyroid. – Manuscript.

Thesis for obtaining Сandidate of Medical Sciences Degree in speciality
14.03.02 – pathologic anatomy. – Danilo Galithskiy Lviv National State
Medical University, Lviv, 2005.

In the thesis it was estimated a diagnostic efficacy of combined use of
standard cytology, thyroid peroxidase immunocytochemistry with
monoclonal antibody 47 and dipeptidyl-aminopeptidase IV staining in
diagnosis of thyroid nodules. The sensitivity and the specificity of
standard cytology was 100 %, and 79 % respectively. The specificity of
100 % was achieved by a combination of MoAb immunostaining and DAP IV
staining on FNA, its sensitivity was 98.6 %. Combined use of these
markers increases the accuracy of FNA. These techniques can be used not
only to select the patients with thyroid nodules for surgery but also to
estimate the extent of resection required.

Key words: fine needle aspiration cytology, thyroid nodules, malignancy
markers, thyroid peroxidase, anti-TPO monoclonal antibody 47,
dipeptidyl-aminopeptidase IV.

PAGE \* Arabic 20

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *