.

Енергетичний стан печінки при гіпотермічному зберіганні та нормотермічній реперфузії (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
113 1881
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Сомов Олександр Юрійович

УДК: 616-005.4: 615.832.9:

576.311.347:57.085.2.

Енергетичний стан печінки при гіпотермічному зберіганні та
нормотермічній реперфузії

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків –– 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії,

м.Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор.

Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія
МАП України, завідувач кафедри хімії і біохімії,

м.Харків

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник.

Падалко Володимир Ілліч, Науково-дослідний інститут біології
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, заступник
директора,

м.Харків

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ

України, кафедра біохімії,

м.Харків

Захист відбудеться “_27__” грудня_2005 р. о 13.30_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15,
вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “24” листопада__2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Ортотопічна трансплантація часто стає єдиним методом лікування при
цілому ряді гострих і хронічних захворювань печінки. Для збереження
функціональної цілісності органа при його консервації суттєвого значення
набуває розчин гіпотермічного зберігання (ГЗ) [Delmas-Beauvieux M.C. et
al., 1993; Kim J.S. et al., 1999]. З огляду на важливість енергетичного
обміну печінки як одного з показників життєздатності органа, існує
об’єктивна необхідність у дослідженнях впливу консервуючих розчинів на
продукцію енергії у клітині.

Актуальність теми. Наразі застосування гіпотермії у трансплантології є
методом вибору, який дозволяє успішно зберігати серце, печінку, нирки й
інші органи [Belzer F.O. et al., 1990]. Звичайне ГЗ органів у розчинах,
які містять непроникаючі осмотичні компоненти, стало одним із досягнень,
що дозволило суттєво збільшити кількість проведених трансплантацій.
Американські дослідники запропонували розчин Університету Вісконсин
(UW), який за останні два десятиріччя став найбільш розповсюдженим
консервуючим середовищем, що замінило мінімальні сольові розчини [Michel
A. et al., 1990]. Застосування розчину UW для ГЗ печінки дозволило
подовжити термін її безпечної консервації в експерименті до 24–48 год і
досягти найбільшої виживаності реципієнтів [Jamieson N.V. et al., 1988].
Але ж дослідження клінічної трансплантології засвідчують, що тривалість
безпечного зберігання печінки не перевищує 10–12 год [Padbury R.T. et
al., 1994], що явно недостатньо для її транспортування на значні
відстані.

На цей час накопичено численний матеріал щодо дослідження метаболічного
стану печінки за умов ішемії/реперфузії, проте цих даних недостатньо для
розуміння механізмів розвитку функціональних порушень органа. Однією з
очевидних причин, які призводять до втрати життєздатності печінки після
гіпоксії, є порушення енергетичного обміну. Не викликає сумнівів, що
найбільш чутливою ланкою енергетичного метаболізму до дії ішемії та
низьких температур є мітохондрії [Nishida T. et al., 1987; Sammut I. et
al., 1998]. Окрім того, останнім часом прийнято розглядати мітохондрії
не лише як головне джерело АТФ, але й як безпосереднього ініціатора
програмованої клітинної загибелі. Низка досліджень вказує на тісну
кореляцію між ураженням енергетичної функції печінки та реалізацією
апоптотичних і некротичних сигналів під час ішемії [Kowaltowski A.J. et
al., 1999; Ockner R.K., 2001; Teoh N.C. et al., 2003; Rudiger H.A. et
al., 2003;]. Протягом гіпоксії та зниження температури можуть
формуватися латентні пошкодження мітохондрій [Petrenko A.Yu., 1992], що
мають тенденцію до посилення під час повернення до фізіологічних умов.
Відомо, що так звані реперфузійні ушкодження органів, що викликаються
комплексом реакцій за участю ендотеліальних клітин судинного русла,
макрофагів та низки прозапальних факторів [Jaeschke H., 1998; Lichtman
S.N. et al., 1999; Teoh N.C. et al., 2003], неминуче супроводжуються
порушеннями функції мітохондрій, що є однією з причин утрати
життєздатності органа [Rosser B.G. et al., 1995; Shaked A. et al., 1997;
Bilzer M. et al., 2000]. У зв’язку з цим уявляється перспективним більш
детальне вивчення енергетичного стану печінки та функціональної
цілісності мітохондрій за умов ГЗ печінки.

Дослідження, що виконувалися в ІПКіК НАНУ, свідчать про те, що
ізольовані гепатоцити зберігають свої метаболічні характеристики
протягом довготривалого ГЗ у сахарозо-вміщуючому розчині (СВР) та
подальшої нормотермічної інкубації в мінімальному сольовому середовищі
[Кравченко Л. П. та ін., 2001]. Оцінка життєздатності за функціональними
тестами свідчить, що СВР не поступається UW, забезпечує високий вміст
АТФ у клітинах та найменший вихід амінотрансфераз до перфузату. Було
показано [Шанина И. В., 2000], що при ГЗ гепатоцитів та цілої печінки у
розчинах, що попереджують розвиток набряку за рахунок непроникаючих
компонентів (сахароза, лактобіонат), первинним є порушення
енергозабезпечення клітин. Проте механізми пригнічення енергетичної
функції залишаються недостатньо вивченими. Одержані результати щодо ГЗ
ізольованих гепатоцитів у СВР, а також невисока вартість його
інгредієнтів служать обґрунтуванням перспективності застосування цього
середовища для консервації цілої печінки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН
України: № 87 “Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих
препаратів ембріональної печінки на метаболізм гепатоцитів в умовах
функціональної недостатності печінки”, № ДР 0202U000833; № 7 “Вивчення
морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин
ембріонів, їхньої кріочутливості й механізмів реалізації біологічної
активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних
станів”, № ДР 0102U002026. Роботу виконано за підтримки гранту “Welcome
Trust” № 069472 (Велика Британія).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – порівняльна оцінка
енергетичного стану печінки після гіпотермічного зберігання у розчині UW
або СВР та подальшої нормотермічної реперфузії (НР).

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Визначити вміст АТФ у печінці на різних етапах ГЗ та НР.

2. Вивчити дихальні параметри мітохондрій після ГЗ та НР печінки.

3. Дослідити вплив ГЗ та НР печінки на вміст калію в мітохондріях.

4. Оцінити стійкість ключових ферментів дихального ланцюга мітохондрій
після ГЗ та НР органа.

5. Дослідити вплив альбуміну на функціональні параметри мітохондрій
після ГЗ та НР печінки.

Об’єкт дослідження – гіпотермічне зберігання печінки щурів у
консервуючих розчинах різного складу.

Предмет дослідження – енергетичний стан печінки щурів і функціональна
активність мітохондрій після ГЗ у розчинах різного складу та НР.

Методи дослідження. У роботі використано методи: полярографії – для
виміряння показників дихання мітохондрій; спектрофотометрії – для
визначення рівня АТФ у гомогенатах печінки і активності Н+-АТФази
мітохондрій; атомно-абсорбційної спектрофотометрії – для визначення
вмісту калію в мітохондріях.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі методів порівняльного
аналізу енергетичного стану печінки щурів уперше були показані
особливості змінювання процесів дихання та окислювального фосфорилювання
мітохондрій після довготривалого ГЗ печінки у розчинах різного складу та
подальшої НР. Встановлено, що при ГЗ печінки у СВР підвищується дихальна
активність мітохондрій, яка зберігається протягом 24 год консервації.
Показано, що розвиток ушкоджень системи окислювального фосфорилювання
мітохондрій після ГЗ печінки у двох середовищах має загальні
закономірності. Альбумін, що входить до складу СВР, сприяє збереженню
високих функціональних параметрів мітохондрій та ефективно попереджує
роз’єднання дихання та окислювального фосфорилювання при ГЗ і НР. В ході
моделювання фізіологічних умов при реперфузії органа вперше було
продемонстровано високі показники збереження та швидкості відновлення
енергетичного обміну печінки після консервації у СВР.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати сприяють
з’ясуванню механізмів пошкодження енергетичного обміну та окислювального
фосфорилювання за умов холодової гіпоксії та подальшої реперфузії
органа. Представлені в роботі дані можна використовувати для
вдосконалення існуючих методів ГЗ печінки, що базуються на застосуванні
розчинів, які містять осмотично активні компоненти. Одержані результати
дозволяють рекомендувати СВР для розробки методу ГЗ печінки людини.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно
здійснено аналіз даних літератури, отримано результати експериментальних
досліджень, проведено їхню статистичну обробку. Автором особисто
проведено первинний аналіз даних і сформульовано попередні висновки.
Разом із науковим керівником автором визначено мету, задачі роботи та
засоби їх вирішення, інтерпретовано отримані результати та зроблено
остаточні висновки. В опублікованих із співавторами працях особистий
внесок здобувача полягає:

– у роботах [1,2,3,4,5] у полярографічному визначенні швидкості
поглинання кисню ізольованими мітохондріями печінки після ГЗ;

– у роботах [5,6] у вивченні стійкості ферментів дихального ланцюга
ізольованих мітохондрій після ГЗ та НР.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на конференції молодих учених Інституту
біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, 2002), Міжнародній
конференції по кріобіології “Cryobiomol” (м. Коїмбра, Португалія, 2003),
на конференціях молодих учених ІПКіК НАН України (м. Харків, 2002,
2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті, з
яких 3 у наукових фахових виданнях, та 2 тези доповідей.

Структура дисертації. Дисертацію викладено на 110 сторінках. Вона
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів,
заключення і висновків. Роботу проілюстровано 9 таблицями і 11
рисунками. Список літератури містить 305 джерел та розміщений на 32
сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Для виконання роботи було використано 80 білих безпорідних ситих щурів
масою 250–300 г. Експерименти проводили згідно з правилами „Європейської
конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються в
експериментальних та інших дослідних цілях” (м. Страсбург, 1985 р.).
Оперативні втручання виконували під наркозом, використовуючи діетиловий
ефір. Об’єктом досліджень служили ціла печінка та ізольовані
мітохондрії.

Після гіпотермічної перфузії печінки консервуючим розчином in situ, її
вилучали та переносили до пластикових бюксів із відповідним розчином
зберігання при 4 oС. ГЗ печінки проводили у холодильнику при 4 oС
протягом 1 або 24 год.

Як контроль використовували печінку, котру було ізольовано без
насичування консервуючим розчином і проведення ГЗ.

У роботі використовували такі консервуючі середовища:

1. СВР – ізотонічний розчин сахарози, збалансований сольовими
компонентами з додаванням 1% бичачого сироваткового альбуміну (БСА)
[Кравченко Л.П., 1993].

2. Розчин UW, спрощений [Mitchell S. et al., 1996].

Після зберігання печінку реперфузували мінімальним бікарбонатним
розчином Кребс-Рингера при температурі 37 оС протягом 60 хв у закритій
перфузійній системі. Перед початком реперфузії на додаткову долю
накладали лігатуру та відрізали фрагмент печінки для визначення вмісту
АТФ у гомогенаті тканини.

Мітохондрії печінки виділяли після різних термінів ГЗ і НР за допомогою
диференціального центрифугування [Мосолова И.М., 1975].

Вміст АТФ визначали спектрофотометрично за методом H. Adams (1963),
використовуючи експрес-набір “Sigma” (США).

Оцінка дихальних параметрів виконувалася за допомогою закритого
платинового електрода Кларка у комірці об’ємом 1 мл при 26 ?С на
полярографі “Rank Brother” model 20 (Велика Британія), що з’єднувався з
персональним комп’ютером.

Активність сукцинатоксидази (КФ 1.3.99.3) досліджували полярографічно у
присутності відновленого цитохрому с при 26 ?С після одноразового
швидкого заморожування мітохондрій у рідкому азоті та швидкого відігріву
на водяній бані при 38 ?С [Петренко А.Ю., 1986].

Визначення внутрішньомітохондріального вмісту калію провадили на
атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115 (“Семі”, Україна) із сумішшю
пропан-повітря, довжина хвилі 766,5 нм.

Активність мітохондріальної Н+-АТФази (КФ 3.6.3.14) досліджували
спектрофотометрично (“Cary 50”, Австралія) за швидкістю зниження
екстинції НАДН при 340 нм, при 30 ?С [Soper J.W., 1978], після
одноразового швидкого заморожування мітохондрій у рідкому азоті та
швидкого відігріву на водяній бані.

Концентрацію білка визначали біуретовим методом [Gornall A.G. et al.,
1949] за допомогою експрес-набору “Sigma” (США).

Одержані результати обробляли на персональному комп’ютері з
використанням програми Origin 6.1. Достовірність змін оцінювали за
допомогою параметричного t-критерію Ст’юдента-Фішера (р l: \ ¦ U 0 2 E I hb#m O O O O O J?`?x?z?‚?–?UU3UU§kd3 O O $ O $Ifa$[kd O $Ifa$§kd® O O O e i j l t v hb#mEH $ O O O ??????????щах, супроводжувалося підвищенням швидкості дихання у станах V4 і V3. Зростання швидкості дихання V4 вказує на збільшення пасивної проникності внутрішньої мембрани мітохондрій для іонів водню [Kacser H. et al., 1973], яка не змінювалася при наступній НР печінки та подовжені терміну ГЗ до 24 год (табл. 1). У той же час дихання у стані V3, при окисленні НАДН-залежних субстратів, достовірно збільшувалося після 1 год ГЗ печінки в СВР і розчині UW на 110% і 50% відповідно. Швидкість дихання у стані V3р при окисленні малат + глутамат також підвищувалася на 95% незалежно від розчину зберігання. Визначною особливістю 1 год ГЗ печінки в СВР було підсилення сукцинат-залежного дихання у станах V4 і V3 на 120% і 95%, відповідно, як порівняно з UW. НР печінки після 1 год ГЗ органа в СВР знижувала швидкість дихання у стані V3 на 35%, тоді як у UW змін не спостерігалося. Збільшення швидкості дихання у стані V3, що відбувалося після ГЗ у СВР, може пояснюватися підвищенням активності переносників дихального ланцюга і АТФ-синтази [Krasinskaya I.P. et al., 1984; Hafner R.P. et al., 1990]. Після 24 год ГЗ в СВР відбувалося подальше зниження швидкості V3. При ГЗ у розчині UW головною особливістю було підвищення швидкості у стані V4, тоді як швидкість V3 не змінювалась і була аналогічною з 1 год ГЗ (табл. 1). Той факт, що швидкість дихання у стані V3 після 1 та 24 год ГЗ печінки у розчині UW була значно нижчою за швидкість дихання у присутності роз’єднувача, свідчить про інгібування АТФ-синтази або про зниження контролю фосфорилювання з боку таких систем, як аденілаткіназа, транслоказа аденінових нуклеотидів, фосфатний переносник [Groen A. K. et al., 1982]. Спираючись на результати полярографічних досліджень, можна зробити висновок, що ГЗ печінки значно впливає на основні енергетичні параметри мітохондрій. Це, в першу чергу, знаходить свій прояв у підвищенні протонної проникності внутрішньої мембрани незалежно від використаного розчину та терміну зберігання. Іншою особливістю є збільшення швидкості дихання V3 при окисленні малат + глутамат після 1 год ГЗ в обох середовищах, що можна пов’язати зі зміною активності АТФ-синтази мітохондрій. Активність Н+-АТФази мітохондрій при ГЗ та НР. У роботах щодо вивчення функціонального стану мітохондрій при консервації органів було встановлено, що найбільш чутливим до ГЗ і НР компонентом системи окислювального фосфорилювання є АТФ-синтаза [Nishida T. et al., 1987; Sammut I.et al., 1998]. Результати, які представлені на рис. 3, свідчать про стійкість Н+-АТФази до ГЗ протягом 1 год та наступної НР. Збільшення термінів ГЗ до 24 год викликало статистично значуще інгібування каталітичної активності у СВР і UW до 65% і 70%, відповідно, відносно 1 год ГЗ. При цьому спостерігалося підвищення олігоміцин-нечутливої активності на 16% у СВР та на 25% – у UW. Слід зазначити, що реперфузія печінки після 24 год ГЗ у СВР призводила до підвищення каталітичної активності, що може свідчити про здатність Н+-АТФази частково відновлювати свою функцію після холодової ішемії. Наразі ще не вивчено молекулярний механізм стійкості АТФ-синтази при ГЗ органів. Інактивація ферменту при гіпотермії може спричинятися модифікацією некаталітичного нуклеотид-зв’язуючого сайта (субодиниці ?1,2,3), що пояснює підвищення швидкості інгібування субкомплексу F1. Таким чином, при зниженні температури необхідна трансформація тільки однієї субодиниці, тоді як для аналогічного гальмування при 30 oС потрібно змінення трьох сайтів зв’язування [Jault J.M. et al., 1994]. Рис. 3. Активність H+-АТФази мітохондрій після 1 та 24 год ГЗ у СВР (1, 2) і UW (3, 4) до (1, 3) і після (2, 4) НР. Примітки: * – достовірно відносно контролю; р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020