Біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх вплив на формування бобово — ризобіального симбіозу у рослин сої (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

БУЛАВЕНКО ЛЮДМИЛА ВАЛЕРІЇВНА

УДК 579.22+582.736+577.482

Біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх вплив на
формування бобово — ризобіального симбіозу у рослин сої

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ — 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі мікробіологічних процесів на твердих поверхнях
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Курдиш Іван
Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН
України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих
поверхнях

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Іутинська Галина Олександрівна, Інститут мікробіології
і

вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу
загальної та ґрунтової мікробіології

доктор сільськогосподарських наук, професор Волкогон Віталій Васильович,
директор Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м.Київ

Захист відбудеться “21” квітня 2004 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських
дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного,
154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул.
Заболотного, 154)

Автореферат дисертації розіслано «18» березня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник
Пуріш Л.М. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що запаси фосфору в ґрунтах досить великі,
проте основна їх частина знаходиться в недоступних для рослин формах.
Забезпечення рослин рухомими формами фосфору може вирішуватись двома
шляхами. Одним з них є внесення мінеральних добрив, а другим —
використання мікроорганізмів, які покращують доступність фосфору для
рослин [Патика, 1993; Тараріко с соавт, 1997; Чайковська, 1997]. В ряді
країн розробляються прийоми активізації аборигенної мікрофлори ґрунту і
ведуться пошуки високоактивних фосфатмобілізуючих мікробних культур та
оптимізуються шляхи їх інтродукції в кореневу зону рослин [Liste, 1993;
Milic, 1996; Курдиш, 2001; Суховицкая с соавт, 2002]. Однак, в Україні
вони поки що не знайшли широкого застосування в сільськогосподарському
виробництві. Тому, виділення мікроорганізмів, що характеризуються
високою активністю мінералізації як органічних, так і важкорозчинних
неорганічних сполук і які можуть стати основою ефективних препаратів для
рослинництва є досить актуальним.

Особливо перспективним напрямком є створення мікробних препаратів
комплексної дії на рослини на основі двох чи декількох штамів [Li, 1990;
Liste, 1993; Omar et al., 1994; Курдиш, 2001]. До складу таких
препаратів доцільно вводити мікроорганізми, що характеризуються
азотфіксуючою і фосфатмобілізуючою дією, а також здатні продукувати
біологічно активні речовини, які стимулюють ріст рослин. Застосування
таких препаратів дозволить зменшити використання в рослинництві хімічних
добрив і пестицидів, обмежити забруднення ними довкілля і отримувати
екологічно чисту сільськогосподарську продукцію. В останні роки цьому
питанню присвячено чимало досліджень і вже одержані певні успіхи
[Канівець, 1990; Андреюк с соавт, 1999; Колмаз, 2000; Курдиш з співавт.,
2003; Малиновська, 2003].

Проведення подальших досліджень в цьому напрямку дозволить розробити
наукові передумови створення високоефективних бактеріальних препаратів
комплексної дії для рослинництва.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась в межах науково-дослідної роботи відділу
мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами «Закономірності
впливу високодисперсних матеріалів на функціонування змішаних культур
мікроорганізмів, що мобілізують ряд біогенних елементів» (держбюджетна
тема 2.28.9.3.), «Підтримання і розвиток Української колекції
мікроорганізмів» (№ державної реєстрації 0102 W007446).

Мета і задачі досліджень. Мета дисертаційної роботи полягала у розробці
наукових передумов створення бактеріальних препаратів комплексної дії
для рослин сої на основі фосфатмобілізуючих та азотфіксуючих бактерій.

Відповідно до поставленої мети завданнями наших досліджень були:

• виділення і ідентифікація нових штамів бактерій, здатних мобілізувати
фосфати з органічних та важкорозчинних неорганічних сполук фосфору;

• дослідження активності мінералізації деякими видами бактерій
органічних сполук фосфору і мобілізації фосфату з його важкорозчинних
неорганічних сполук;

• визначення залежності фосфатазної активності виділених культур
бактерій від ряду фізико-хімічних факторів;

• оцінка впливу природних глинистих матеріалів на фосфатазну активність
бактерій;

• дослідження впливу бактеріальних композицій на основі Bradyrhizobium
japonicum та інших бактерій, на різні етапи формування
бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої.

Об’єктами дослідження були представники фосфатмобілізуючих бактерій роду
Bacillus та азотфіксуючі мікроорганізми родів Azotobacter і
Bradyrhizobium.

Предметом дослідження були біологічні властивості фосфатмобілізуючих
бактерій і їх вплив на формування бобово — ризобіального симбіозу у
рослин сої.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань
використовували мікробіологічні, фізіологічні, біохімічні, вегетаційні а
також статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше виділено та ідентифіковано нові штами роду Bacillus, які
характеризуються високою активністю мобілізації фосфору як з його
органічних, так і важкорозчинних неорганічних сполук.

Визначено фізико-хімічні параметри для прояву максимальної фосфатазної
активності у найбільш перспективного штаму B.subtilis 5 та досліджено
вплив природних глинистих мінералів на фосфатазну активність цього
штаму.

На основі бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum,
фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та азотфіксуючих бактерій роду
Azotobacter, створені нові мікробні композиції, які значно стимулюють
формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої.

Найбільшим стимулюючим ефектом на формування бобово-ризобіального
симбіозу у рослин сої характеризувалися композиції B.japonicum
634б+B.subtilis 5, а також B.japonicum 634б+A.chroococcum 20 і
B.japonicum 10К+A.vinelandii 56.

Практичне значення одержаних результатів.

Виділено нові високоактивні штами фосфатмобілізуючих бактерій роду
Bacillus, які поповнили Українську колекцію мікроорганізмів.
Запропоновано удосконалений метод визначення фосфатазної активності, що
дозволяє значно підвищити надійність одержаних результатів.

Запропоновані нові бактеріальні композиції на основі Bradyrhizobium
japonicum, фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та Azotobacter є
перспективними для створення бактеріальних препаратів комплексної дії на
рослини сої.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором
особисто. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми
дисертації, проведено статистичну обробку всіх отриманих
експериментальних даних, їх аналіз та співставлення з існуючими даними
літератури, а також підготовку матеріалів результатів досліджень для їх
публікації. Автором самостійно досліджена активність мінералізації
деякими видами бактерій органічних сполук фосфору і мобілізації фосфату
з його важкорозчинних неорганічних сполук. Визначена залежність
фосфатазної активності у виділених бактерій від ряду фізико-хімічних
факторів і вмісту глинистих мінералів.

Виділення та ідентифікацію фосфатмобілізуючих бактерій виконано сумісно
з к.б.н. Рой А.О, яка є співавтором відповідних публікацій. Вплив
мікробних композицій на основі Bradyrhizobium japonicum на розвиток
рослин сої у вегетаційних дослідах виконано сумісно з к.б.н.
Н.М.Мельниковою і к.б.н. Л.В.Титовою, які також є співавторами
публікацій. У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні
результатів брав участь науковий керівник д.б.н. проф. Курдиш І.К.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були
представлені на звітних конференціях-конкурсах наукових робіт Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (2000, 2002
рр.); Міжнародній конференції «Микробиология и биотехнология на рубеже
21 столетия» (Мінськ, 2000); II установчому з’їзді Українського
мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); Міжнародній конференції
«Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів» (Одеса, 2001);
Міжнародній науково-практичній конференції «Аграрна освіта і наука на
початку третього тисячоліття» (Львів, 2001). 8 Українському біохімічному
з’їзді (Чернівці, 2002); Всеукраїнській конференції молодих вчених
«Засади сталого розвитку аграрної галузі» (Київ, 2002); Міжнародна
конференція «Біологічні науки і проблеми рослинництва» (Умань, 2003).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з
яких 7 статей (5 — у фахових виданнях) та 3 – у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 144
сторінках машинописного тексту і складається із структурних частин:
«Вступ», «Огляд літератури», «Матеріали і методи досліджень»,
«Результати досліджень» (включає три розділи власних досліджень),
«Заключна частина», «Висновки», «Список використаних джерел», який
містить 268 посилань (з них 115 іноземних авторів). Робота містить 23
таблиці та 22 рисунки.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури представлений двома розділами, в одному з яких наведено
аналіз даних сучасної літератури щодо вмісту сполук фосфору в ґрунтах та
особливостей його мобілізації різними видами мікроорганізмів.

В другому розділі описані властивості бульбочкових бактерій роду
Bradyrhizobium (їх таксономія, морфологія, культурально-фізіологічні
особливості та закономірності взаємодії з рослиною–хазяїном), а також
висвітлено питання впливу чистих та асоціацій бактерій на основі
Bradyrhizobium japonicum на врожайність рослин сої.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень були 16 штамів фосфатмобілізуючих бактерій роду
Bacillus, які були виділені нами із зразків чорноземного ґрунту трьох
областей України — Київської, Черкаської і Кіровоградської, а також
B.polymyxa ВК, який був одержаний з музею культур Інституту
сільськогосподарської мікробіології УААН від доктора
сільськогосподарських наук В.І.Канівця. В роботі використовували два
виробничі штами бульбочкових бактерій: B.japonicum 634б (селекції
Всеросійського інституту сільськогосподарської мікробіології,
Санкт-Петербург – Пушкін) та B.japonicum 10К (селекції відділу загальної
та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім.
Д.К. Заболотного НАНУ, Київ, який увійшов в Українську колекцію
мікроорганізмів під номером 6023). Досліджували також азотфіксуючі
мікроорганізми роду Azotobacter, а саме A.vinelandii 56 і A.chroococcum
20 , які були надані з музею культур відділу загальної та ґрунтової
мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного
НАНУ професором Антипчук А.Ф., і A.chroococcum 21 і Agrobacterium
radiobacter 204 люб’язно надані академіком УААН В.П.Патикою, за що їм
щиро вдячні.

Методи досліджень. Бактерії культивували в залежності від мети
дослідження на рідких поживних середовищах — Менкіної, Муромцева, Ешбі
або манітно-дріжджовому середовищі (МДС), в які додавали гліцерофосфат
кальцію в кількості 0.2 г/л.

Визначення чисельності бактерій проводили методом серійних розведень.

Для виділення спороутворюючих бактерій використовували метод прямого
висіву із зразків чорноземного ґрунту на агаризоване середовище Менкіної
з додаванням лецитину [Андреюк Е.И., 1988]. Фенотипову характеристику
досліджуваних штамів проводили загальноприйнятими методами [Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, 1997]. Були досліджені морфологія
клітин, культуральні властивості, рухливість, забарвлення за Грамом,
потреба в сполуках натрію для росту, утворення аміаку, індолу,
сірководню, та ацетилметилкарбінолу, тип метаболізму. Визначали
здатність бактерій редукувати нітрати, гідролізувати сечовину, казеїн,
крохмаль, продукувати лецитиназу та каталазу.

Здатність мікроорганізмів мінералізувати органічні та мобілізувати
фосфати з неорганічних сполук фосфору оцінювали за інтенсивністю їх
росту у відповідних поживних середовищах і накопиченню в культуральній
рідині фосфату. Концентрацію останнього в середовищі визначали методом
Фіске-Субароу з молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою [Лурье, 1971].

Фосфатазну активність визначали колориметричним методом з використанням
фенолфталеїнфосфату натрія [Калашникова,1971]. Нами запропонована нова
модифікація даного методу, яка полягає в зміщенні точки виміру
інтенсивності забарвлення фенолфталеїну в область рН 11,5 — 12,5, що
дозволяє отримувати більш стабільні значення забарвлення фенолфталеїну і
позбавитись нелінійності результатів цього методу (рис.1.).

Кількість білку в реакційній суміші визначали спектрофотометрично при
280 нм, а також за методом Бредфорда [Bradford,1976].

При дослідженні впливу високодисперсних матеріалів на фосфатазну
активність бактерій, застосовували природні глинисті мінерали
монтморилоніт і палигорськіт Черкаського родовища бентонітових глин, які
вносили в реакційну суміш у відповідних концентраціях. В ряді
експериментів використовували мінерали, подрібнені до колоїдного стану.
Монтморилоніт є мінералом шаруватого типу, представлений
пластівцеподібними частками розмірами 0.05 мкм, що утворюють ізометричні
форми. Палигорськіт – це алюмосилікат шарувато-стрічкового типу з
голкоподібними частками. Їх розмір досягає 0.2–0.5 мкм [Тарасевич,
Овчаренко, 1975].

Досліди з впливу чистих культур Bradyrhizobium japonicum та змішаних з
іншими видами бактерій на різні етапи формування бобово-ризобіального
симбіозу, проводили на рослинах сої Glycine max L. (Merr.) районованих
сортів Чорнобура та Мар’яна (селекції Інституту фізіології рослин та
генетики НАНУ і Інституту землеробства УААН), що вступають в симбіотичні
взаємовідносини з бульбочковими бактеріями. Насіння сої протягом 1
години оброблювали культуральною рідиною мікроорганізмів. При цьому
кількість азотобактера в суспензіях монокультур складала 0,9 — 1,1(108
клітин в мл, бацил 2,5 — 3,5(108 клітин в мл. Титр B.japonicum 634б і
B.japonicum 10К у всіх варіантах був однаковим і складав відповідно
1,5(108 і 1,7(108 клітин в мл. Співвідношення кількості клітин в
змішаних культурах B.japonicum і інших бактерій було 1:1 і 1:0,1.

Модельні вегетаційні досліди проводили в піщаній культурі, в яку вносили
суміш Гельрігеля [Гродзинский, Гродзинский, 1973], збіднену на азот (0,2
норми). Визначали кількість бульбочок, утворених на коренях, їх
нітрогеназну активність [Hardy, 1968], та приріст наземної маси.

Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи
варіаційної статистики [Лакин, 1990].

РОЗДІЛ 3. ФОСФАТМОБІЛІЗУЮЧА АКТИВНІСТЬ ДЕЯКИХ ВИДІВ БАКТЕРІЙ

Із зразків чорноземного ґрунту виділено 216 ізолятів спороутворюючих
бактерій, з яких відібрано 16 найбільш активних штамів. Була проведена
їх ідентифікація. Показано, що всі штами належать до родини Bacillaceae
і є представниками роду Bacillus. На підставі морфолого-культуральних і
біохімічних особливостей, виділені нами спороутворюючі бактерії
віднесені до наступних видів роду Bacillus — B.megaterium — 5 штамів,
B.subtilis — 4 штами, B.pumilus — 4 штами, B.cereus — 3 штами.

Проведені нами дослідження процесу мінералізації органічних сполук
фосфору бактеріями роду Bacillus показали, що всі виділені штами
інтенсивно росли і мінералізували гліцерофосфат кальцію і фітин з
накопиченням в культуральній рідині значних кількостей фосфату. При
культивуванні досліджуваних штамів у рідкому поживному середовищі
Менкіної з гліцерофосфатом кальцію протягом 3-х діб, чисельність
бактерій зростала на три порядки, а в середовищі накопичувалось від 40
до 284 мг/л іонів фосфату. Найбільш активне накопичення фосфату в
культуральній рідині спостерігалось у штамів B.megaterium 9 і 12 (204 —
284 мг/л), B.subtilis 5 і 15 (234 — 219 мг/л) та B.cereus 6 і 10 (120 —
251 мг/л) (табл.1).

Таблиця 1

Ростова активність і накопичення фосфату при культивуванні бацил

в середовищі з гліцерофосфатом кальцію

Досліджувані бактерії Вміст життєздатних бактерій, клітин в 1 мл
Накопичення РО43- в культуральній

рідині,

мг/л рН

початковий (105 кінцевий

(108

початкове кінцеве

Bacillus megaterium 1 1,6 2,0 96,0 7,0 6,6

B.megaterium 2 1,4 0,23 40,0 6,9 6,4

B.megaterium 9 7,3 36,0 204,0 6,8 6,3

B.megaterium 12 4,2 1,5 284,0 7,0 6,1

В.megaterium 16 0,9 2,4 118,0 7,1 6,3

B.subtilis 5 1,2 1,6 234,0 7,2 6,4

B.subtilis 11 2,1 1,2 44,0 7,0 6,3

B.subtilis 13 3,1 7,1 58,0 7,2 6,6

B.subtilis 15 1,5 2,8 219,0 7,0 6,3

B.cereus 6 1,4 2,6 120,0 6,9 6,0

B.cereus 10 3,2 17,0 251,0 7,1 6,3

B.cereus 14 3,5 2,1 64,0 7,1 6,4

B.pumilus 3 1,6 6,3 194,0 7,1 6,3

B.pumilus 4 4,8 5,8 120,0 7,1 6,5

B.pumilus 7 0,8 1,0 22,0 7,1 6,8

B.pumilus 8 3,4 4,1 120,0 7,0 6,9

Примітка. Тривалість культивування — 3 доби.

В середовищі з фітином, чисельність життєздатних клітин у більшості
досліджених штамів була на порядок нижче, ніж в середовищі з
гліцерофосфатом кальцію і, як правило, становила (0,5 — 13,0)(107 клітин
в 1 мл. (табл.2). Однак, така ростова активність характерна не для всіх
досліджуваних штамів. Наприклад, кількість клітин у суспензії B.pumilus
3 і B.pumilus 4 в порівнянні з усіма іншими досліджуваними штамами, була
досить високою і становила (1,2 — 1,8)(109 клітин в 1 мл. Ці два штами,
на нашу думку є перспективними для подальших досліджень, оскільки
відомо, що бактерії не є найбільш активними продуцентами фітаз [Билай,
1989; Зинин с соавт., 2003]. Накопичення фосфату в культуральній рідині
здійснювалось також менш активно, за виключенням B.cereus 14 (105,0
мг/л) і В.megaterium 16 (138,0 мг/л). Необхідно відмітити, що B.cereus
14 і В.megaterium 16 характеризувались високими показниками
фосфатмінералізації і в середовищі з гліцерофосфатом кальцію. Ряд
штамів, які слабо росли в середовищі з фітином, не накопичували фосфат в
культуральній рідині, що, ймовірно, обумовлено низькою фітазною
активністю цих бактерій і повним споживанням РО43- бактеріями в процесі
їх росту.

Зважаючи на те, що до складу комплексних бактеріальних препаратів для
рослин сої вводять, насамперед, азотфіксуючі мікроорганізми родів
Bradhyrhizobium і Azotobacter, була досліджена їх фосфатмінералізуюча
активність. Базуючись на результатах попередніх досліджень з вивчення
взаємовідносин між різними видами бактерій родів Bacillus, Azotobacter
та Bradhyrhizobium, в даній роботі були застосовані штами A.vinelandii
56 і B.japonicum 634б.

Показано, що A.vinelandii 56 і B.japonicum 634б при рості в середовищі
Ешбі або манітно-дріжджовому, в яких єдиним джерелом фосфору був
гліцерофосфат кальцію, характеризувались значною ростовою активністю і
накопичували за сім діб культивування понад 108 кл/мл. При культивуванні
у подібних умовах A.vinelandii 56 накопичував незначні кількості фосфату
(до 17 мг/л), тоді як у B.japonicum 634б цей іон у середовищі не
виявлявся.

Необхідно відмітити, що виділені бактерії роду Bacillus інтенсивно
ростуть в середовищах не тільки з органічними сполуками фосфору, але і
важкорозчинним фосфатом кальцію, накопичуючи в середовищі (1,3 —
4,17)(108 клітин в мілілітрі та 78 — 148 мг/л фосфату.

Останнім часом в Україні запропоновано ряд перспективних
фосфатмобілізуючих бактерій для використання у сільськогосподарському
виробництві. Одним з них є B.polymyxa ВК, на основі якого в Україні
розроблена технологія виробництва і застосування біопрепарату
фосформобілізуючих бактерій — поліміксобактерину [Токмакова с соавт.,
1997].

Нами проведена порівняльна характеристика інтенсивності мобілізації
фосфату з органічних сполук фосфору штамом B.polymyxa ВК і виділеним
нами штамом B.subtilis 5 (pис.2).

Як видно з одержаних результатів, в середовищі Менкіної з
гліцерофосфатом кальцію або фітином досліджувані культури суттєво
відрізнялись за ростовою активністю і здатністю накопичувати фосфат. За
9 діб культивування бактерій в середовищі, що містило гліцерофосфат
кальцію, B.subtilis 5 накопичував понад 350 мг/л фосфату, в той час як
B.polymyxa ВК лише 5мг/л. В аналогічних умовах в середовищі з фітином,
B.subtilis 5 накопичував до 106 мг/л, а B.polymyxa ВК — 68 мг/л РО43-.
Однак, в середовищі з трикальційфосфатом B.polymyxa ВК активніше
накопичував фосфат порівняно з B.subtilis 5. Більш активна мобілізація
фосфату B.polymyxa ВК, ймовірно, пов’язана з більшим підкисленням
середовища.

В останні роки виділенню фосфатмобілізуючих бактерій та дослідженню
процесу фосфатмобілізації присвячено чимало робіт [Токмакова с соавт.,
1997; Чайковська, 1997; Андреюк с соавт, 1999; Малиновська, 2003].
Порівняння активності мінералізації органічних сполук фосфору у
виділених нами фосфатмобілізуючих бактерій з деякими описаними в
літературі, дозволяє зробити висновок про більш високу активність
мінералізації органічних сполук фосфору B. subtilis 5.

Розділ 3. ФОСФАТАЗНА АКТИВНІСТЬ ДЕЯКИХ ВИДІВ

МІКРООРГАНІЗМІВ

Встановлено, що виділені фосфатмобілізуючі мікроорганізми
характеризуються високою фосфатазною активністю. Порівняльне дослідження
фосфатазної активності клітин B.subtilis 5 і B.megaterium 12 показало,
що вона проявляється в досить широкому температурному діапазоні (від
10(С до 65(С) і досягає максимальних значень при 55(С (рис.3). В цих
умовах фосфатазна активність у B.subtilis 5 склала 260 мкмоль/г(год., а
у B.megaterium 12 – 100 мкмоль/г(год. Зважаючи на те, що рівень
фосфатазної активності клітин B.subtilis 5 перевищував в 2-3 рази
аналогічний показник у B.megaterium 12, для подальших експериментів ми
відібрали B.subtilis 5.

Дослідження залежності фосфатазної активності B.subtilis 5 від рН
середовища показало, що висока ферментативна активність у даного штаму
спостерігається в досить широкому діапазоні рН 7,2 — 11,1 і досягає
максимальних значень в області рН 9,5 — 10,0 (рис.4) та в кінці
логарифмічної фази росту культури (рис.5).

Було розраховано, що для фосфатази B.subtilis 5 Км дорівнює 4,2 мМ, а
ФАmax — 475 мкмоль/г(год.(рис.6).

Відомо, що лужні фосфатази мікроорганізмів є металоферментами [Эйхгорн,
1978]. Як показано на рис.7, в присутності Mg2+, Ca2+ ферментативна
активність B.subtilis 5 збільшується. Максимальний стимулюючий ефект (на
160% і 70% в порівнянні з контролем) спостерігали при концентрації іонів
металів 10 мкг/мл і 30 мкг/мл, відповідно (рис.7).

За літературними даними, одні і ті ж іони в залежності від їх
концентрації можуть збільшувати або зменшувати каталітичну активність
ферментів. Так і в наших дослідах, подальше підвищення концентрації цих
елементів призводило до зниження ферментативної активності. Іони металів
можуть не тільки збільшувати, але і знижувати каталітичну активність
ферментів. В наших дослідах Cu2+, Mn2+, Zn2+ навіть в концентрації 0,5
мкг/мл інгібували фосфатазну активність B.subtilis 5 (рис.7).

Відомо, що в молекулі лужної фосфатази E.coli в утворенні
внутрішньоланцюгових дисульфідних зв’язків приймають участь чотири
цистеїнових залишки. Найчастіше інгібуючу дію іонів металів на лужні
фосфатази пояснюють їх здатністю утворювати сульфіди як з цистеїном, що
входить до складу ферментів, так і з продуктами розпаду [Диксон, 1982].
Можна було б припустити, що саме цей механізм є визначальним у
інгібуванні ферменту у наших дослідах. Проте, на відміну від всіх інших
лужних фосфатаз, бацилярні лужні фосфатази не мають в своєму складі
цистеїнових залишків [Вершинина с соавт., 1997]. Тому, механізм
інгібуючої дії досліджених катіонів металів, ймовірно, має іншу природу.

>

V

D

`„

0

2

4

6

8

:

< >

V

Z

?

?

e&^’?+2-?-I.0oeoeoeeeeaeeeOeNEE??E?N?

?

‘kdv

‘kd,

3Одним із основних компонентів ґрунтів є глинисті мінерали [Тарасевич,
Овчаренко, 1975]. Мікроорганізми різних таксономічних груп здатні
вступати у взаємодію з високодисперсними матеріалами, що в значній
більшості випадків призводить до змін їх фізіологічних властивостей
[Курдиш, 2001]. Оскільки даних щодо впливу глинистих мінералів на
фосфатазну активність бактерій роду Bacillus не достатньо, нами було
досліджено це питання. Показано, що палигорськіт в концентраціях
0,6-10,0 г/л суттєво не впливав на фосфатазну активність B.subtilis 5
(рис.8). Підвищення концентрації мінералу до 20,0 г/л призводило до
збільшення фосфатазної активності на 22%. Монтморилоніт більш суттєво
стимулював фосфатазну активність цих бактерій. При внесенні в реакційну
суміш 20,0 г/л цього мінералу фосфатазна активність зростала на 40%.
Збільшення фосфатазної активності в деяких варіантах досліду, можливо
пов’язано з екстракцією мінеральних домішок, які входять до складу
даного мінералу і стимулюють фосфатазну активність. До таких домішок
можуть належати катіони магнію і кальцію, які збільшують ферментативну
активність B.subtilis 5.

Таким чином, нами показано, що природні глинисті мінерали палигорськіт і
монтморилоніт не тільки не знижують фосфатазну активність B.subtilis 5,
але і в деяких випадках її підвищують. Цей факт є важливим, оскільки в
нашому відділі показана можливість і перспективність застосування цих
мінералів в якості наповнювачів при виготовленні гранульованих
бактеріальних препаратів [Курдиш з співавт., 2003].

РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM 634Б В ЧИСТИХ І ЗМІШАНИХ
КУЛЬТУРАХ НА ПРОРОСТАННЯ НАСІННЯ СОЇ

Згідно літературних даних, позитивна дія азотфіксуючих мікроорганізмів
може відбуватися не тільки за рахунок фіксації атмосферного азоту, але й
завдяки стимулюючій дії продуктів метаболізму цих мікроорганізмів на
проростання насіння й швидкість накопичення маси рослин, особливо у
ранні фази онтогенезу [Лысак, 1990; Sagnow, 1990]. Виявлення стимулюючої
дії як азотфіксуючих, так і фосфатмобілізуючих бактерій дозволяє більш
повно використати їх корисні властивості при створенні нових ефективних
мікробних препаратів. Враховуючи це, ми дослідили вплив чистих культур
Bradyrhizobium japonicum, Bacillus і Azotobacter а також їх комбінацій
на енергію проростання насіння сої та формування її проростків.

Як видно з рис.9, інокуляція насіння сої сорту Чорнобура культуральною
рідиною монокультур Bacillus subtilis 5, Azotobacter vinelandii 56,
Bradyrhizobium japonicum 634б незначно стимулювала енергію проростання
та схожість насіння. Однак, під впливом цих бактерій помітно
збільшувалась (на 10 — 27%) кількість нормально сформованих проростків.
Аналогічні результати були одержані і для сорту Мар’яна.

З літературних джерел відомо, що формування і функціонування
бобово-ризобіального симбіозу покращується, коли для інокуляції насіння
чи рослин поряд з бульбочковими бактеріями застосовують мікроорганізми
інших таксономічних груп. Проте, такий підхід може призводити і до
негативних наслідків [Мильто, 1982; Суховицкая, 2002]. Виходячи з цього,
нами досліджено вплив бактеріальних композицій на інокуляцію насіння сої
сортів Чорнобура і Мар’яна. Одержані результати суттєво не відрізнялись
від отриманих при обробці насіння сої монокультурами досліджуваних
мікроорганізмів.

РОЗДІЛ 5. ВПЛИВ БАКТЕРІАЛЬНИХ КОМПОЗИЦІЙ НА ОСНОВІ BRADYRHIZOBIUM
JAPONICUM НА РОЗВИТОК РОСЛИН СОЇ У ВЕГЕТАЦІЙНИХ ДОСЛІДАХ

Результати проведених нами досліджень показали, що бінарні культури на
основі B.japonicum, азотобактера і бацил по різному впливали на
формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої. У більшості
випадків відгук рослин залежав від складу бінарних бактеріальних
суспензій, а також кількісного співвідношення їх компонентів. Так, в
змішаній культурі B.japonicum 634б з фосфатмобілізуючими бактеріями
B.subtilis 5 в кількості 1*108 та 1*107 клітин/мл, а також з
A.chroococcum 20 в кількості 1*107 клітин/мл, спостерігали суттєву
активізацію процесів бульбочкоутворення (на 42 — 71%) в порівнянні з
варіантами, де насіння інокулювали монокультурою ризобій (табл.3). При
цьому позитивна дія комбінації мікроорганізмів B.japonicum 634б +
B.subtilis 5 мала більш виражений характер. Використання для інокуляції
насіння таких бактеріальних композицій, як B.japonicum 10К + B.subtilis
5 і B.japonicum 10К + A.chroococcum 20, що містили 1*108 і 1*107
клітин/мл, відповідно, призводило також до значної активізації
бульбочкоутворення (на 30%). Проте найбільш ефективно впливали бінарні
культури B.japonicum 10К з бактеріями B.megaterium 12 і A.vinelandii 56
в кількості 1*107 клітин/мл. У цьому випадку кількість бульбочок на
корінні рослин сої збільшувалась на 48 і 205% відповідно. Необхідно
відмітити, що залежність ступеня впливу азотфіксаторів роду Azotobacter
і фосфатмобілізуючих бацил на формування бобово-ризобіального симбіозу у
рослин сої від кількості цих мікроорганізмів в бінарних бактеріальних
композиціях була характерна і для інших варіантів (табл.3).

Інокуляція насіння сої змішаними суспензіями B.japonicum 634б та
B.subtilis 5 викликала не тільки збільшення кількості бульбочок,
утворених на корінні рослин сої, але і їх ваги в порівнянні з
монокультурою, а також сприяла підвищення загальної нітрогеназної
активності бульбочок, в той час як при використанні обох штамів бацил в
змішаних культурах на основі B.japonicum 10К спостерігали її зниження.
Тільки в бінарній культурі B.japonicum 10К з B.megaterium 12 в кількості
108 кл/мл було відмічено збільшення загальної нітрогеназної активності
бульбочок на 19% (табл.3).

Використання бінарної бактеріальної композиції B.japonicum 634б +
B.subtilis 5 при співвідношенні їх компонентів 1:1 і 1:0,1, призводило
також до збільшення маси надземної частини рослин і їх висоти на 76 —
74%. Суттєве збільшення висоти рослин спостерігалося і у випадку
використання композицій B.japonicum 634б+B.megaterium 12 (табл.4). Слід
відзначити, що збільшення надземної маси рослин сої спостерігалось також
при передпосівній обробці насіння змішаними культурами B.japonicum 10К +
B. subtilis 5 і B.japonicum 10К + B.megaterium 12.

Виходячи з одержаних нами результатів, слід відмітити, що азотобактер і
бацили в композиціях на основі B.japonicum не завжди покращували
розвиток рослин сої і формування ними бобово-ризобіального симбіозу.
Так, присутність фосфатмобілізуючих бактерій в деяких варіантах не
тільки не стимулювала але, навпаки, призводила в ряді випадків до
деякого інгібування нодуляційних процесів і азотфіксації у рослин сої
(табл.3; 4).

Таблиця 3

Формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої сорту Чорнобура
під впливом змішаних культур Bradyrhizobium japonicum та бактерій родів
Bacillus і Azotobacter

Варіант Кількість бульбочок на одну рослину Вага бульбочок, г
Нітрогеназна активність, мкМ C2H4/ за 1 годину на 1 рослину

B.japonicum 634б + H2O * 31 + 3 0,46 + 0,03 26,4 + 1,8

B.japonicum 634б + A. vinelandii 56 * 32 + 3 0,51 + 0,04 21,5 + 3,2

B.japonicum 634б + A. vinelandii 56 ** 35 + 3 0,57 + 0,05 32,5+2,2а

B.japonicum 634б + A.chroococcum 20 33 + 3 0,58 + 0,06 31,1+ 1,7

B.japonicum 634б + A.chroococcum20 40 + 3а 0,57 + 0,05 27,2+ 1,4

B.japonicum 634б + B. subtilis 5 * 44 + 3а 0,65 + 0,05а 27,9+ 4,0

B.japonicum 634б + B. subtilis 5 ** 53 + 5а 0,55 + 0,03 35,7+ 2,2а

B.japonicum 634б + B. megaterium 12 * 22 + 3а 0,33 + 0,03а 18,6+ 4,9

B.japonicum 634б + B. megaterium 12 * 35 + 2 0,38 + 0,02а 20,4+ 2,1

B.japonicum 10К + H2O 40 + 5 0,45 + 0,03 24,3 + 2,3

B.japonicum 10К + A. vinelandii 56 * 56 + 8 0,50 + 0,07 21,1 + 2,9

B.japonicum 10К + A. vinelandii 56 ** 82 + 8а 0,75 + 0,06а 18,3 + 2,6

B.japonicum 10К + A.chroococcum 20 * 41 + 7 0,49 + 0,06 23,8 + 2,6

B.japonicum 10К + A.chroococcum20 * 52 + 5 0,56 + 0,06 25,7 + 2,6

B.japonicum 10К + B.subtilis 5 * 52 + 5 0,60 + 0,07 13,5 + 1,2а

B.japonicum 10К + B.subtilis 5 ** 40 + 5 0,37 + 0,04 12,6 + 2,3а

B.japonicum 10К + B. megaterium 12 * 33 + 4 0,26 + 0,04а 28,8 + 6,3

B.japonicum 10К + B.megaterium 12 ** 59 + 5а 0,32 + 0,02а 8,2 + 0,9а

Примітки:

1. * — співвідношення бактерій в суспензії 1:1,

** — співвідношення бактерій в суспензії 1:0,1;

2. а — достовірно відмінні значення в порівнянні з варіантом, де
використовувалася монокультура брадіризобій при p = 0,05.

Таблиця 4

Вплив моно- і змішаних культур азотфіксуючих і фосфатмобілізуючих
бактерій на розвиток надземної частини рослин сої сорту Чорнобура

Варіант Вага сухої надземної частини рослин, г висота рослин, см

Контроль (насіння без обробки) 0,72 + 0,04 15,8 + 0,6

B.japonicum 634б + H2O * 0,92 + 0,08а 18,5 + 1,2а

B.japonicum 10К + H2O * 0,84 + 0,04а 19,4 + 0,6а

B. subtilis 5 + H2O * 0,94 + 0,07а 18,0 + 0,8а

B. subtilis 5 + H2O ** 0,73 + 0,03 17,7 + 0,6а

B. megaterium 12 + H2O * 0,88 + 0,07а 20,9 + 0,9а

B. megaterium 12 + H2O ** 1,01 + 0,08а 20,2 + 1,2а

B.japonicum 634б + B. subtilis 5 * 1,27 + 0,08а 23,8 + 0,7а

B.japonicum 634б + B. subtilis 5 ** 1,25 + 0,10а 26,1 + 0,9а

B.japonicum 634б + B. megaterium 12 * 0,87 + 0,05а 24,9 + 0,9а

B.japonicum 634б + B. megaterium 12 ** 0,86 + 0,04а 27,7 + 0,9а

B.japonicum 10К + B. subtilis 5 * 0,90 + 0,06а 19,8 + 0,5а

B.japonicum 10К + B. subtilis 5 ** 1,10 + 0,09а 21,6 + 0,7а

B.japonicum 10К + B. megaterium 12 * 1,03 + 0,08а 19,1 + 0,7а

B.japonicum 10К + B. megaterium 12 ** 1,15 + 0,15а 18,1 + 0,8а

Примітки:

1. * — співвідношення бактерій в суспензії 1:1,

** — співвідношення бактерій в суспензії 1:0,1;

2. а — достовірно відмінні значення в порівнянні з варіантом, де
використовувалася монокультура брадіризобій при p = 0,05.

В то й же час, необхідно відзначити, що в більшості варіантів при
інокуляції насіння сої моно- і змішаними культурами досліджуваних нами
мікроорганізмів спостерігалося збільшення ваги і росту надземної частини
цих рослин (табл.4). При цьому обробка насіння бінарними бактеріальними
композиціями, як правило, сприяла більш суттєвій активізації ростових
процесів.

З огляду на той факт, що бактерії, які були використані нами є не тільки
азотфіксаторами, але і достатньо активними продуцентами біологічно
активних речовин, можливо допустити, що стимулюючий вплив на формування
бобово-ризобіального симбіозу при їх використанні відбувається за участю
двох механізмів — екскреції рістстимулюючих речовин і збагаченні
прикореневої зони азотом.

Відмінність між штамами бацил у впливі на становлення симбіотичних
відносин між рослинами сої і специфічними до них ризобіями, як було
показано нами (табл.3; 4), може бути обумовлено кількісною і якісною
різницею в продукуванні бактеріями речовин, які здатні стимулювати ріст
і розвиток рослинного організму.

Таким чином показано, що виділені бактерії роду Bacillus в середовищах з
органічними або неорганічними сполуками фосфору, характеризуються
інтенсивним ростом і здатністю накопичувати значні кількості фосфату. На
основі бактерій родів Bradyrhizobium, Bacillus і Azotobacter, створено
нові бактеріальні композиції які характеризуються стимулюючим впливом на
формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої сортів Чорнобура і
Мар’яна.

ВИСНОВКИ

Виділено 216 ізолятів спороутворюючих бактерій, що здатні мінералізувати
органічні сполуки фосфору з яких відібрано 16 найбільш активних штамів.
Проведена їх видова ідентифікація і показано, що всі виділені
мікроорганізми належать до родини Bacillaceae і є представниками роду
Bacillus, а зокрема – B.megaterium, B.subtilis, B.pumilus, B.cereus.

Встановлено, що виділені штами бактерій роду Bacillus характеризуються
високою активністю мобілізації фосфору з його органічних та
важкорозчинних неорганічних сполук. В середовищах з такими сполуками, ці
бактерії інтенсивно ростуть та накопичують понад 200 мг/л фосфату.

Удосконалено метод визначення фосфатазної активності з використанням
фенолфталеїнфосфату натрію. Показано, що найбільш активним
фосфатмобілізуючим бактеріям B.subtilis 5 та B.megaterium 12 властива
лужна фосфатаза. В оптимальних за температурою (55(С) і рН (9,5-10,0)
умовах фосфатазна активність B.subtilis 5 становить 260 мкмоль/г(год., а
B.megaterium 12 — 100 мкмоль/г(год. Показано, що фосфатазна активність
цих бактерій активується катіонами Mg2+, Ca2+ і інгібується катіонами
Cu2+, Mn2+, Zn2+, а також аніонами ортофосфату (РО43-).

Додавання природних глинистих мінералів палигорськіту і монтморилоніту в
реакційну суміш в концентраціях до 20,0 г/л, супроводжувалось
збільшенням фосфатазної активності B.subtilis 5 на 22 — 40% відповідно.

На основі бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum, Bacillus
subtilis 5 та Azotobacter vinelandii 56 створено нові бактеріальні
композиції для інокуляції насіння сої. Застосування цих композицій
сприяє збільшенню кількості нормально сформованих проростків на 10–27%.

Показано, що бактеріальні композиції на основі бульбочкових бактерій
Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та
азотфіксуючих бактерій роду Azotobacter, значно стимулюють формування
бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої. Найбільшим стимулюючим
ефектом характеризувалися композиції B.japonicum 634б+B.subtilis 5, а
також B.japonicum 634б+A.chroococcum 20 і B.japonicum 10К+A.vinelandii
56.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Булавенко Л.В., Бега З.Т., Курдиш І.К. Мобилизация фосфора некоторыми
микроорганизмами из труднорастворимых неорганофосфатов // Бюлетень
Інституту сільськогосподарської мікробіології. — 2000. — № 4. — С. 55 —
56. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження по
вивченню фосфатмобілізуючої здатності деяких видів бактерій, здійснено
аналіз та інтерпритацію одержаних результатів).

Рой А.А., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Новые штаммы почвенных бацилл,
минерализующие органические соединения фосфора // Мікробіологічний
журнал. — 2001. — Т. 63, № 4. — С.9 — 15. (Здобувач особисто провів
літературний пошук, брав участь в лабораторних дослідженнях по виділенню
та ідентифікації бактерій роду Bacillus, аналізі одержаних результатів
та написанні статті).

Мельникова Н.Н., Булавенко Л.В., Курдиш И.К., Титова Л.В., Коць С.Я.
Формирование и функционирование бобово-ризобиального симбиоза у растений
сои при интродукции штаммов родов Azotobacter и Bacillus // Прикладная
биохимия и микробиология. — 2002. — 38, № 4. — С. 427 — 432. (Здобувач
безпосередньо брав участь в постановці вегетаційних дослідів по впливу
бактерій Bradyrhizobium japonicum з іншими бактеріями на формування і
функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої, провів аналіз
та інтерпретацію даних).

Мельникова Н.Н., Булавенко Л.В., Титова Л.В., Курдиш І.К. Вплив
азотфіксуючих та фосфатмобілізуючих бактерій на формування і
функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої // Вісник
Львівського державного аграрного університету. — 2002. — № 6. — С. 145
— 151. (Здобувачем особисто проведено аналіз літературних даних, брав
участь в дослідженнях впливу комбінацій бактерій на основі B.japonicum
на формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин
сої).

Булавенко Л.В., Рой А.А., Курдиш И.К. Сравнительная характеристика
ростовой и фосфатмобилизирующей активностей Bacillus subtilis 5 і
Bacillus polymyxa ВК // Вісник Одеського національного університету. —
2001. — Т. 6, № 4. — С.43 — 46. (Здобувачем особисто проведено
експериментальні дослідження фосфатмінералізуючої активності Bacillus
subtilis 5 і Bacillus polymyxa ВК, здійснено аналіз та інтерпритацію
даних, підготовлено матеріали статті до друку).

Титова Л.В., Рой А.А., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Комбинированные
бактериальные препараты на основе глинистых минералов и композиции
почвенных микроорганизмов // Вісник Одеського національного
університету. — 2001. — Т. 6, № 4. — С.305 — 308.(Здобувач особисто брав
участь в постановці вегетаційних дослідів по впливу гранульованих
препаратів фосфатмобілізуючих і вільноживучих азотфіксуючих бактерій на
ризосферний грунт і продуктивність томатів, здійснив аналіз одержаних
результатів, сформулював висновки).

Курдиш І.К., Рой А.О., Бега З.Т., Булавенко Л.В. Гранульовані
бактеріальні препарати комплексної дії на рослини // Збірник наукових
праць Уманського державного аграрного університету (спеціальний випуск).
Біологічні науки і проблеми рослинництва. – Умань, 2003. – С. 267 – 270.
(Здобувач безпосередньо брав участь в дослідженнях впливу бактеріальних
препаратів на деякі види рослин, особисто дослідив фосфатазну активність
ряду бактерій, що входять до складу гранульованих бактеріальних
препаратів.)

Рой А.А., Бега З.Т., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Мобилизация фосфора из
органо- и неорганофосфатов бактериями родов Вacillus и Azotobacter //
Материалы Международной конф. «Микробиология и биотехнология на рубеже
21 столетия» (Минск, 1-2 июня 2000г.). — Минск: ЗАО «ПРОПИЛЕИ», 2000. —
С. 96 — 97.

Булавенко Л.В., Рой А.О., Курдиш І.К. Фосфатазна активність деяких видів
мікроорганізмів // Украинский биохимический журнал Т.74, № 4б (додаток
2). — 2002 / Матеріали 8 Українського біохімічного з’їзду (ЧЕРНІВЦІ
2002). — Чернівці. — 2002. — С.65.

Булавенко Л.В., Курдиш І.К. Фосфатазна активність бактерій роду Bacillus
// Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених «Засади сталого
розвитку аграрної галузі» (КИЇВ 2002). — Київ: Інститут агроекології та
біотехнології. — 2002. — С.94 — 95.

АНОТАЦІЯ

Булавенко Л.В. Біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх
вплив на формування бобово — ризобіального симбіозу у рослин сої .–
Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія.– Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена дослідженню біологічних властивостей
фосфатмобілізуючих бактерій і їх впливу на формування бобово —
ризобіального симбіозу у рослин сої. Виділено та відібрано перспективні
штами фосфатмобілізуючих бактерій, які пропонуються для виготовлення
бактеріальних препаратів комплексної дії. Досліджена здатність виділених
бактерій мінералізувати органічні та розчиняти важкорозчинні неорганічні
сполуки фосфору.

Вивчено залежність фосфатазної активності B.subtilis 5 від температури,
рН середовища, стадії розвиту культури, вмісту катіонів деяких металів
та неорганічного фосфату. Показано стимулюючий вплив на фосфатазну
активність B.subtilis 5 природних глинистих мінералів монтморилоніту і
палигорськіту, які є компонентами багатьох типів ґрунтів.

У вегетаційних дослідах встановлено, що бактеризація насіння сої штамами
Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючими бактеріями роду Bacillus,
а також бактеріями роду Azotobacter, супроводжувалась збільшенням
кількості нормально сформованих проростків, а також значним
стимулюванням формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої. На
підставі одержаних результатів, відібрані нові мікробні композиції, які
є перспективними для вирощування сої.

Ключові слова: фосфатмобілізуючі бактерії, фосфатазна активність, соя,
бульбочкові бактерії, азотфіксуючі мікроорганізми, бобово-ризобіальний
симбіоз.

АННОТАЦИЯ

Булавенко Л.В. Биологические свойства фосфатмобилизирующих бактерий и их
влияние на формирование бобово — ризобиального симбиоза у растений сои
.– Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология.– Институт микробиологи и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена исследованию биологических свойств
фосфатмобилизирующих бактерий и их влиянию на формирование бобово —
ризобиального симбиоза у растений сои. Из выделенных 216 изолятов
спорообразующих микроорганизмов отобрано 16 штаммов рода Bacillus,
которые отличались активным ростом и способностью минерализовать
органические соединения фосфора. Установлены межштамовые различия в
фосфатминерализирующей активности исследуемых бацилл. Наиболее активные
штаммы в средах с органическими соединениями фосфора накапливали более
108 клеток в миллилитре и свыше 200 мг/л фосфата, что свидетельствует о
их высокой фосфатминерализирующей активности. В среде с
труднорастворимым неорганическим соединением фосфора (фосфатом кальция)
выделенные бактерии также характеризовались интенсивным ростом и
накапливали порядка 140 мг/л фосфата.

Сравнительная характеристика фосфатмобилизирующей активности B.subtilis
5 и B.polymyxa ВК показала, что B.polymyxa ВК менее активно, чем
B.subtilis 5 минерализирует органические соединения фосфора, но более
активен на среде с фосфатом кальция.

Для определения ферментативной активности бактерий предложен
оптимизированный метод, который позволяет значительно повысить точность
полученных результатов. Установлено, что фосфатазная активность у
наиболее перспективных штаммов B.subtilis 5 и B.megaterium 12 составляет
260 мкмоль/г(год. и 100 мкмоль/г(год. соответственно. Исследована
зависимость фосфатазной активности B.subtilis 5 от стадии роста
культуры, концентрации субстрата, содержания в реакционной среде
катионов некоторых металлов. Показано, что максимальная фосфатазная
активность у B.subtilis 5 наблюдается в диапазоне рН 9,5-10,0 и
температуре 55(С.

Установлено, что внесение в реакционную среду глинистых минералов
монтмориллонита или палыгорскита в концентрациях до 20,0 г/л вызывало
увеличение фосфатазной активности B.subtilis 5. Этот факт может быть
объяснен наличием в структуре исследуемых минералов катионов магния,
который, возможно, и увеличивает фосфатазную активность данного штамма.

На основе клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum,
фосфатмобилизирующих бактерий рода Bacillus а также бактерий рода
Azotobacter, созданы новые бактериальные композиции для инокуляции
растений сои. Обработка ее семян данными композициями бактерий
значительно стимулировала формирование бобово-ризобиального симбиоза у
растений сои. Наибольшим стимулирующим эффектом характеризовались
композиции B.japonicum 634б+B.subtilis 5, а також B.japonicum
634б+A.chroococcum 20 і B.japonicum 10К+A.vinelandii 56.

Ключевые слова: фосфатмобилизирующие бактерии, фосфатазная активность,
соя, клубеньковые бактерии, азотфиксирующие микроорганизмы,
бобово-ризобиальный симбиоз.

ABSTRACT

Bulavenko L.V. Biological properties of phosphate-mobilized
bacteria and their influence on formation of legume-rhizobium symbiosis
of soybean plants.– Manuscript.

The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 –
microbiology. D.K. Zabolotny Institute of microbiology and virology of
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to research of biological properties of
phosphate-mobilized bacteria and their influence on formation of
legume-rhizobium symbiosis of soybean plants. The perspective strains of
phosphate-mobilized bacteria which are proposed for development of
bacterial preparations of complex action are isolated and selected. The
possibility of isolated bacteria to mineralizate of organic phosphor
compounds and solve inorganic hard-solving phosphor compounds is
studied.

The dependence of phosphatase activity of B.subtilis 5 on temperature,
environment pH, culture growth stage, concentration of metal cations and
inorganic phosphate is investigated.

It is shown that nature clay minerals of montmorillonite and
palygorskite which are components of many soil types stimulate
phosphatese activity of B.subtilis 5.

The bacterization of seeds soybean by Bradyrhizobium japonicum strains,
phosphate-mobilized bacteria of Bacillus species and bacteria of
Azotobacter species is found to lead increase number of normal formed
sprouts, and stimulation of formation of legume-rhizobium symbiosis of
soybean plants in vegetative experiments. On the base of obtained
results new microbe compositions are selected for perspective use in
growing of soybean.

Keywords: phosphate-mobilazed bacteria, phosphate activity, soybean,
nodulating bacteria, nitrogen fixed microorganisms, legume-rhizobium
symbiosis.

PAGE 14

Рис.8. Вплив природних глинистих мінералів на фосфатазну активність
Bacillus subtilis 5.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *