Біологічні властивості біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел (автореферат)

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ПОЛТАВСЬКА ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА

УДК 57.017:579.873+001.814

Біологічні властивості біфідобактерій, ізольованих з різних природних
джерел

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної
Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, проф., член-кор. НАН
України Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий
співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Кіпріанова Олена Андріївна, Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий
співробітник відділу антибіотиків;

доктор медичних наук,
старший науковий співробітник Авдєєва Лілія Василівна, Інститут
епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України,
провідний науковий співробітник лабораторії загальної мікробіології,

Провідна організація: Одеський національний університет ім. І.І.
Мечникова, кафедра мікробіології і вірусології.

Захист відбудеться “15” листопада 2006 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою:

Україна, Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ, ДСП,

вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “ 13 “ жовтня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник
Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біфідобактерії — група мікроорганізмів, яка є
складовою частиною нормальної мікрофлори шлунково-кишкового тракту
людини, особливо дітей. В цьому плані дані наукових досліджень, присутні
в літературі, спрямовані в основному на вивчення складу цих
мікроорганізмів при різних дисбіотичних станах макроорганізму. Досить
широко наведені дані про використання цих мікроорганізмів у складі
біопрепаратів і продуктів харчування. В той же час біологія
біфідобактерій вивчена недостатньо. Описано більше 30 видів
біфідобактерій, які відрізняються незначними морфологічними і деякими
фізіолого-біохімічними властивостями. Тому систематичне положення
окремих представників цього роду є предметом дискусій і потребує більш
детального вивчення особливостей цих бактерій. Значний прогрес в галузі
молекулярної біології і еволюційної систематики мікроорганізмів дозволив
переглянути систематичне положення роду Bіfіdobacterіum, але ці дані
поодинокі. Практично відсутні відомості про біологічні властивості
біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел, і вплив на них
середовища існування. Майже не вивченою екологічною нішею для
біфідобактерій залишається травний тракт холоднокровних тварин.

Біфідобактерії широко використовуються для корекції нормофлори у складі
пробіотиків і продуктів функціонального харчування після
антибіотикотерапії. В той же час практично не вивчена їх
антибіотикочутливість. Це питання є дуже важливим, тому що дозволяє
раціонально і цілеспрямовано використовувати біфідобактерії при
проведенні бактеріотерапії. Тим часом в літературі майже відсутні
подібні відомості.

Адгезивні властивості бактерій являють собою фактор взаємодії мікро- і
макроорганізму. Цей процес в останні роки привертає особливу увагу
вчених, але він майже не з’ясований у біфідобактерій по відношенню до
епітеліальних клітин макроорганізму. Цікавим є вивчення адгезії до
вагінального епітелію, яка є важливою для з‘ясування природи адгезинів
цих мікроорганізмів.

Для підвищення ефективності пробіотичних препаратів в останні роки
приділяється увага використанню стимуляторів росту біфідобактерій, так
званих пребіотиків. Приводяться поодинокі дані відносно впливу лактулози
і інуліну на ріст біфідобактерій, відсутні відомості про вплив цих
пребіотиків на прояв біфідобактеріями їх біологічних властивостей,
зокрема антагоністичної і адгезивної активності. Вивчення цих питань є
актуальним, тому що розкриває ще одну зі сторінок біології такої
важливої групи мікроорганізмів, як біфідобактерії.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Робота виконана у відповідності з
напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України в межах бюджетних тематик відділу
фізіології промислових мікроорганізмів “Дослідження систематичного
положення та фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів, які
мають промислове значення” номер 0198U007755 (1999-2003 рр.) і
“Систематика і біосинтетичні можливості бактерій і дріжджів. Розробка
наукових основ створення за їх допомогою нових біотехнологічних
препаратів і процесів” номер 0104U003000 (2004-2008 рр.); з прикладною
бюджетною тематикою відділу “Розробка наукових основ створення
біотехнології одержання біоконсервантів з використанням пробіотичних
штамів молочнокислих бактерій” номер 0104U003196, а також в межах
проекту “Створення біотехнології виготовлення вагінального пробіотика
для жінок” номер 0104U007734, який виконується в рамках комплексної
програми прикладних досліджень НАН України “Новітні медико-біологічні
проблеми та оточуюче середовище людини”.

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було вивчення біологічних
властивостей біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел;
визначення їх систематичного положення з використанням сучасних
мікробіологічних і молекулярно-генетичних методів; розробка наукових
основ створення пробіотичних препаратів.

У відповідності з поставленою метою були сформульовані наступні
завдання:

Виділити біфідобактерії з різних природних джерел;

Ідентифікувати виділені штами з використанням традиційних
морфолого-культуральних, фізіолого-біохімічних і молекулярно-генетичних
методів;

Вивчити ростові характеристики виділених штамів і оптимізувати умови їх
вирощування;

Визначити антагоністичні властивості біфідобактерій до умовно патогенної
мікрофлори;

Вивчити здатність біфідобактерій адгезувати до вагінального епітелію;

Визначити поверхневий моноцукровий комплекс глікокаліксу біфідобактерій;

Вивчити вплив антибіотиків на життєздатність біфідобактерій;

Дослідити вплив лактулози, інуліну і глікогену, на прояв біологічної
активності досліджуваних штамів;

Здійснити відбір штамів з пробіотичними властивостями і оптимізувати
умови їх культивування.

Об’єктом дослідження були штами біфідобактерій, ізольовані з різних
природних джерел, а також штами, які зберігалися у відділі фізіології
промислових мікроорганізмів ІМВ НАНУ.

Предметом дослідження були: видовий склад біфідобактерій, їх
антагоністичні і адгезивні властивості, а також вплив пребіотиків на
біологічну активність біфідобактерій.

Методи дослідження. Сучасні мікробіологічні, біохімічні,
молекулярно-генетичні, а також метод визначення моносахаридів у
глікокаліксі шляхом електронної мікроскопії мікробно-лектинових
комплексів, які візуалізуються завдяки наявності колоїдного золота. В
дослідах використовувались статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Виявлені нові екологічні ніші
існування біфідобактерій. Вперше виділені біфідобактерії, що мешкають в
травному тракті дельфінів, вивчені їх біологічні особливості, що
дозволило розширити відомості про екологію цієї групи мікроорганізмів.
Показано, що серед біфідофлори дельфінів реєструється вид
Bifidobacterium animalis.

Використання широкого діапазону фенотипових властивостей біфідобактерій
дозволило ідентифікувати нові штами, ізольовані з різних природних
джерел, і реідентифікувати штами, які протягом тривалого часу
зберігалися в умовах ліофільного анабіозу.

Вперше показано, що біфідобактерії дельфінів і бджіл проявляють
біологічну активність.

Виявлена адгезивна активність біфідобактерій по відношенню до
вагінальних епітеліоцитів людини і вперше показано, що вона не залежить
від ступеня гідрофобності клітинної поверхні і аутоагрегації клітин цих
мікроорганізмів. З‘ясовано, що в процесі прикріплювання біфідобактерій
до вагінальних епітеліоцитів приймають участь протеазо-, амілазо-,
періодат- і ліпазочутливий компоненти, в залежності від штаму.

Визначено вуглеводний склад термінальних моноцукрів досліджених штамів
біфідобактерій. Встановлена наявність N-ацетил-D-глюкозаміну, сіалової
кислоти, L-фукози, б-D-манози і Я-D-галактози у термінальному складі
глікокаліксу біфідобактерій, встановлена їх роль в процесі адгезії до
поверхні епітелію.

Досліджено вплив лактулози, інуліну і глікогену на параметри росту
біфідобактерій і показано їх взаємозв’язок з антагоністичною і
адгезивною активністю селекціонованих штамів цих мікроорганізмів.

Практичне значення одержаних результатів. Шляхом багатоступеневого
відбору отримана колекція штамів біфідобактерій з високою біологічною
активністю, які є перспективними для створення пробіотичних препаратів.
Запропоновано для стимуляції росту селекціонованих штамів, поряд з
лактулозою і інуліном, вносити в середовище культивування глікоген.
Визначені оптимальні параметри вирощування біфідобактерій для розробки
біотехнології отримання пробіотичних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані
здобувачем особисто: виділені штами біфідобактерій з різних природних
джерел. Переведено в фізіологічно активний стан штами біфідобактерій,
ізольовані від людини і сільськогосподарських тварин, які зберігалися у
відділі фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ НАНУ (штами були
надані к.б.н. Головач Т.М., Інститут мікробіології і вірусології ім.
Д.К. Заболотного НАН України, Київ), проведена ревізія властивостей
біфідобактерій з позицій сучасної систематики. Здобувачем особисто було
проведено ідентифікацію виділених штамів з використанням
мікробіологічних методів, в тому числі АРІ-тестування, а також
генетичних методів, зокрема методу полімеразної ланцюгової реакції з
використанням родоспецифічних праймерів. Здійснено підбір оптимальних
умов культивування штамів біфідобактерій і досліджено їх антагоністичні
і адгезивні властивості, а також відношення до антибіотиків. Здобувач
самостійно проводила роботу по вивченню впливу пребіотиків на біологічні
властивості біфідобактерій, здійснила відбір штамів, ефективних для
створення пробіотичних препаратів і провела оптимізацію умов їх
культивування. Здобувачем особисто було проведено підготовку до
сиквенування гену 16S рибосомної рибонуклеїнової кислоти (рРНК); сумісно
з к.б.н., ст.н.с. Облапом Р.В. (відділ молекулярно-діагностичних
досліджень лабораторії якості та безпеки АПК, Національний аграрний
університет, Київ) проведено сиквенування гену 16s рРНК.

Дослідження наявності певних моноцукрів у глікокаліксі проводили спільно
з к.б.н. Онищенко А.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України, Київ).

Аналіз результатів, їхнє узагальнення і інтерпретацію даних та
формулювання основних положень і висновків дисертації, підготовку до
друку наукових статей здобувачем проведено під керівництвом наукового
керівника дисертаційної роботи д.б.н. Коваленко Н.К.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та
положення дисертації доповідались та обговорювались на конкурсі
експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2003); на
конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ,
2004); на Десятому з’їзді товариства мікробіологів України (Одеса,
2004); на Міжнародній конференції “Пробиотики, пребиотики, синбиотики и
функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы”
(Москва, 2004); на І міжнародній науковій конференції студентів та
аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005); на міжнародній
науковій конференції “Euprobio 2005” (Краків, 2005); на ІІ міжнародній
науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”
(Львів, 2006); на 10-й Пущинській школі-конференції молодих вчених
“Биология – наука ХХІ века” (Пущино, Росія, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт (4
статті у фахових журналах, 6 – в тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 133
сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду
літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень,
результати досліджень і їх обговорення), висновків, списку використаних
джерел, що містить 159 джерел, з них 115 — закордонних авторів. Робота
ілюстрована 33 таблицями і 28 малюнками.

Огляд літератури

Огляд літератури складається з двох підрозділів, в яких висвітлено
сучасний стан систематики біфідобактерій. Описані біологічні властивості
цих мікроорганізмів і показана їх роль у життєдіяльності людини. Велика
увага приділяється питанню створення пробіотичних препаратів на основі
біфідобактерій, а також перспективі використання пребіотиків, зокрема
лактулози і інуліну, у складі пробіотичних препаратів.

експериментальна частина

матеріали і методи досліджень

Об’єктами дослідження були штами біфідобактерій, ізольовані з
шлунково-кишкового тракту людини, сільськогосподарських тварин і комах
(штами зберігалися в колекції відділу фізіології промислових
мікроорганізмів ІМВ НАНУ понад 25 років), а також нові штами
біфідобактерій, ізольовані з кишечнику людини, дельфінів, лабораторних
тварин (мишей), комах і з біопродуктів.

Для отримання монокультур біфідобактерій від людини,
сільськогосподарських і лабораторних тварин використовували
свіжовиділені фекалії дистального відділу кишечника. Виділення
біфідобактерій із бджіл проводили в період ранньої весни (березень 2003
р.). Перед початком препаровки комах присипляли, витримуючи при -40єС
5-10 хвилин. Препарування бджіл проводили в асептичних умовах.
Біфідофлору дельфінів ізолювали зі змивів анального отвору тварини на
площі поверхні 10 см2. З продуктів функціонального харчування
біфідобактерії отримували шляхом серійних десятикратних розведень 1г
продукту в фізіологічному розчині з подальшим висівом на агаризоване
середовище і відбором одиничних колоній.

Переведення культур біфідобактерій, що зберігалися в ампулах, в
фізіологічно активний стан проводили шляхом багаторазових їх пересівів з
добором типових для біфідобактерій колоній у стані активного росту.

У ході роботи було здійснено підбір середовища, оптимального для
виділення і культивування досліджуваних штамів біфідобактерій. Для цього
були випробувані 4 склади живильних середовищ: кукурудзяно-лактозне
(КЛС); середовище Блаурока; модифіковане середовище MRS; середовище
“Біфідум”.

Підбір анаеробних умов для первинного виділення і культивування штамів
біфідобактерій проводили на модифікованому агаризованому середовищі MRS.
Використовували наступні методи: культивування у високому стовпчику
рідкого середовища з подальшим нашаруванням на середовище 1 см васпару
(вазелінова олія і парафін 1:1); вирощування в піпетках Пастера;
культивування в апараті В.М. Аристовського ; культивування в анаеробній
системі Gas Pak.

Належність ізольованих нами культур до роду Bifidobacterium
встановлювали шляхом дослідження морфології клітин і колоній
біфідобактерій, забарвлення за Грамом, каталазної та нітратазної
активності, рухливості і утворення газу із глюкози [Квасніков Є.І.,
Нестеренко О.А. 1989; Герхардт Ф., 1983].

Наявність фруктозо-6-фосфат фосфокетолази у клітинному екстракті
біфідобактерій проводили за методом [Scardovi V., 1986] у модифікації
[Orban J.I., Patterson J.A., 2000].

З метою підтвердження родової належності досліджуваних штамів
біфідобактерій також використовували генетичний метод полімеразної
ланцюгової реакції (ПЛР). Виділення ДНК проводили за методом [Maniatis
T., 1982]. Метод ПЛР проводили з використанням родоспецифічних праймерів
наступних послідовностей: (Bif164-f): 5′-GGGTGGTAATGCCGGATG-3′;
(Bif662-r): 5′-CCACCGTTACACCGGGAA-3′ [Matsuki T., 2002]. Праймери були
синтезовані співробітником фірми “Медбіосервіс” Панасенко Г.В. ПЛР
проводили з використанням універсального набору „АмпліСенс-200-1”
(Росія) за методикою, що додавалася до нього. Програма ампліфікації:
94єС 120 сек; 94 єС 70 сек, 62 єС 75 сек, 68єС 75 сек (35 циклів); 68єС
420 сек.

Фенотипові ознаки досліджуваних штамів біфідобактерій визначали за
спектром ферментації вуглеводів з використанням АРІ-систем (Bio Mйrieux,
Inc, France).

Антагоністичні властивості біфідобактерій вивчали з використанням
референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів: Bacillus cereus УКМ
B-908 (ATCC 11778), Escherichia coli B-906 (ATCC 25922 (F-50)), Candida
albicans Y-1918 (ATCC 885-653), Proteus vulgaris B-905 (ATCC 6896),
Pseudomonas aeruginosa B-900 (ATCC 9027), Staphylococcus aureus B-904
(ATCC 25923 (F-49)), Staphylococcus epidermidis B-919 (ATCC 12228),
Klebsiella pneumoniae B-920 (ATCC 10031), наданих співробітниками
відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Для визначення неспецифічної антимікробної дії досліджуваних штамів
біфідобактерій застосовували метод агарового блочка [Егоров Н.С.,
1986.]. Для дослідження утворення біфідобактеріями специфічних
антимікробних сполук використовували метод [Toure R., 2003].

В дослідженні антибіотикочутливості використовували 4 (різних за
механізмом біологічної дії) класи антибіотиків. Визначення
антибіотикочутливості біфідобактерій проводили за методом [Charteris
W.P., 1998].

З метою первинного скринінгу високоадгезивних штамів біфідобактерій
використано експрес-метод [Бріліс В.І., 1986] на моделі “еритроцит —
біфідобактерія”. Про ступінь адгезивності штаму судили за індексом
адгезивності мікроорганізму (ІАМ) – середня кількість мікробних клітин
на 1 еритроциті з урахуванням 50 еритроцитів, що приймають участь у
адгезивному процесі.

Адгезію досліджуваних штамів біфідобактерій до вагінальних епітеліоцитів
проводили, використовуючи вагінальний епітелій гінекологічно здорових
жінок, віком від 20 до 35 років. Підготування розведень вагінальних
епітеліоцитів (106 кл/мл) і культур біфідобактерій (109 кл/мл),
інкубацію їх суміші, а також обрахування отриманих результатів проводили
аналогічно методу [Бріліс В.І., 1986].

Аутоагрегацію клітин біфідобактерій вивчали за методом [Del Re B.,
1998]. Гідрофобність клітин біфідобактерій досліджували за методом
[Perez P.F., 1998].

Для виявлення природи поверхневих структур клітинної стінки
біфідобактерій, що відповідають за їх прикріплення до епітелію піхви,
клітини мікроорганізмів обробляли протеіназою К, трипсином,
хімотрипсином, ліпазою, амілазою, натрія періодатом за методом [Greene
J., 1994].

Дослідження глікокаліксу клітин біфідобактерій проводили за методом
[Оніщенко А.М. зі співавт., 1999].

При дослідженні впливу джерела вуглецю на адгезію біфідобактерій
використовували середовище MRS без вуглеводу (як основу), у яке додавали
по 2% глюкози (контроль), лактулози, інуліну або глікогену.

Для визначення нуклеотидної послідовності фрагментів 16S рДНК
використовували модель сиквенатора 3130 Genetic Analyzer (Hitachi).
Ідентифікацію біфідобактерій проводили за допомогою програми BLAST.

У дослідженні здатності лактулози і інуліну стимулювати ріст
біфідобактерій використовували середовище MRS без м’ясної води, твіну-80
і печінкового екстракту. Пребіотики додавали у кількості 1 і 2%. У
контролі використовували аналогічне середовище MRS з глюкозою.

Дослідження кінетики росту біфідобактерій проводили за методом [Цинберг
М.Б., 2003].

Встановлення оптимального для росту значення рН і температурного режиму
проводили на середовищі MRS з 0,05% цистеїну. Величину рН встановлювали
за допомогою 1N HCl i 10% NH4OH.

Статистичну обробку проводили з використанням пакету комп’ютерної
програми “Excel XP” за загальноприйнятими методиками з урахуванням
t-критерію Стьюдента, рівень вірогідності становив 95% .

Морфолого-культуральні і фізіолого-біохімічні властивості біфідобактерій

Таблиця 1

Штами біфідобактерій,

виділені з різних природних джерел

штами джерело виділення

Bifidobacterium sp. BB-12 біойогурт

Bifidobacterium sp. ABT-1 біоряжанка

Bifidobacterium sp. ABT-2 біокефір

Bifidobacterium sp. L9 кишечник дитини

B. adolescentis PM

Bifidobacterium sp. М39/1 кишечник лабораторних тварин (мишей)

Bifidobacterium sp. М39/2

Bifidobacterium sp. Д69/1 кишечник дельфінів

Bifidobacterium sp. Д69/2

Bifidobacterium sp. Д69/3

Bifidobacterium sp. А53/1 кишечник бжіл

Bifidobacterium sp. А53/2

Bifidobacterium sp. А5

Bifidobacterium sp. А7

На основі вивчення морфолого-культуральних та фізіологічних
властивостей виділених культур нами було відібрано 30 штамів, які
відповідали за своїми

Таблиця 2

Первинний видовий склад біфідобактерій, які зберігалися в колекції
культур ІМВ НАН України*

Назви видів

ізоляти з травного тракту людини ізоляти з травного тракту теплокровних
тварин і комах

Bifidobacterium bifidum G Bifidobacterium globosum ATCC 25864

Bifidobacterium bifidum ATCC 15696 Bifidobacterium globosum 2

Bifidobacterium catenulatum ATCC 27539 Bifidobacterium animalis ATCC
26536

Bifidobacterium liberorum ATCC 15702 Bifidobacterium magnum ATCC 27540

Bifidobacterium breve ATCC 15700 Bifidobacterium ruminale ATCC 25866

Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 Bifidobacterium ruminale 2

Bifidobacterium parvulorum ATCC 15698 Bifidobacterium asteroidеs ATCC
25909

Bifidobacterium sp. 93 Bifidobacterium sp. Д124

*- штами, що вижили

ознаками представникам роду Bifidobacterium (табл. 1, 2). Досліджувані
штами являли собою грампозитивні палички, розміром близько 0,5 – 1,3 х
1,5 – 8 мкм, варіабельні за формою і розташуванням. Зазвичай вигнуті,
булавоподібні і часто розгалужені на кінцях. Нерухливі. Через 48 годин
культивування клітини часто забарвлювалися нерівномірно. Усі
досліджувані штами росли лише в анаеробних умовах. На поверхні твердого
середовища MRS вони утворювали кремово-білі, опуклі, круглі, з рівним
краєм колонії, 1-2 мм в діаметрі, пастоподібної консистенції. Слід однак
зазначити, що колонії штамів, ізольованих з шлунково- кишкового тракту
бджіл та дельфінів,

легко знімались з поверхні агару, але створювали агрегати, які погано
розчинялись у воді, в той час як колонії штамів біфідобактерій,
виділених з інших природних джерел, легко ресуспендувалися в ній.

В напіврідкому середовищі досліджувані штами утворювали колонії у
вигляді “комет”, “гвіздків” та т.п. В рідкому середовищі без створення
анаеробних умов спостерігався придонний ріст у високому стовпчику
середовища, а в анаеробних умовах – рівномірний ріст по всьому об’єму
середовища.

Штами не мали каталазної та нітрат редуктазної активності, не утворювали
газу із глюкози. В усіх клітинних екстрактах була виявлена
фруктозо-6-фосфат фосфокетолаза. У результаті ПЛР-реакції для всіх
штамів біфідобактерій були отримані ПЛР-продукти молекулярної маси 520
п.н., що підтвердило належність цих штамів до роду Bifidobacterium (рис.
1.).

. Рис. 1. Типові продукти ампліфікації, отримані в результаті ПЛР із
застосуванням родоспецифічних праймерів Bif164-f та Bif662-r (1,7 –
маркери, 2-4 – штами роду Bifidobacterium; 5 — позитивний контроль –
Lactobacillus rhamnosus, 6 — негативний контроль – реакційна суміш без
ДНК).

За результатами АРІ-тестування було встановлено, що усі досліджувані
штами біфідобактерій засвоювали галактозу, глюкозу, фруктозу, мелібіозу,
цукрозу, рафінозу. Не засвоювали гліцерин, еритрит, D-арабінозу,
L-ксилозу, адоніт, Я-метил- D-ксилозид, сорбозу, рамнозу, дульцит,
інозит, маніт, сорбіт, Я-метил- D-манозид, Я-метил- L-манозид,
N-ацетил-глюкозамін, арбутін, трегалозу, ксиліт, D-ліксозу, D-тагатозу,
D-фукозу, D-арабітол, L-арабітол, 2-кето-глюконат.

Ідентифікація новоізольованих штамів. B. animalis. До цього виду нами
віднесено 6 штамів, виділених від дельфінів і з біопродуктів (табл. 3).

За результатами АРІ-тестування відповідали виду B. animalis штами, що
здатні були ферментувати лактозу і саліцин, але не глюконат. Штам D69/1
за здатністю засвоювати манозу віднесений до біовару в, в той час як
штами D69/2, D69/3, ВВ-12, АВТ-1 і АВТ-2 є біоварами а, оскільки є
манозонегативними. Штам ВВ-12 не мав здатності засвоювати ескулін і
целобіозу, чим відрізнявся від решти штамів. На відміну від штамів B.
animalis, ізольованих від дельфінів, дані штами не засвоювали
D-туранозу.

B. magnum. До цього виду нами віднесено два штами, виділені від
лабораторних тварин (мишей) (табл. 3). За результатами ідентифікації
являли собою B. magnum, оскільки вони засвоювали лактозу, але не
крохмаль.

B. asteroides. До цього виду нами були віднесені 4 штами біфідобактерій,
виділених від бджіл (табл. 3). Морфологічно клітини цих штамів типові
для виду B. asteroides. Разом з тим, дані ізоляти відрізнялися за
спектром засвоювання деяких

Таблиця 3

Видова належність досліджуваних штамів роду Bifidobacterium за
результатами АРІ – тестування

Назви штамів Результат АРІ — тестування Назви штамів Результат АРІ —
тестування

D69/1 B. animalis В. bifidum ATCC 15696 B. breve

D69/2

B. catenulatum ATCC 27539 B. longum bv. B

D69/3

B. liberorum ATCC 15702 B. pseudolongum

BB-12

B. breve ATCC 15700

ABT-1

B. adolescentis ATCC 15703 B. adolescentis

ABT-2

B. parvulorum ATCC 15698 B. infantis

M39/1 B. magnum B. sp. 93

M39/2

B. bifidum G

A5 B. asteroides B. animalis ATCC 26536 B. globosum

A7

B.globosum ATCC 25864

A53/1

B.globosum 2 B. magnum

A53/2

B. ruminale ATCC 25866

L9 B. breve B. ruminale 2 B. thermophilum

B. magnum ATCC 27540 не визначено

B. adolescentis PM B. longum B. sp. D-124 B. thermophilum

B. asteroides ATCC 25909 B. breve

вуглеводів. Так, штами А5 і А7 метаболізували амігдалін, штам А53/2 не
мав здатності засвоювати ескулін, на відміну від інших штамів.
Спостерігалася штамова різниця у засвоюванні гентіобіози, D-туранози,
5-кето-глюконату. Слід зазначити, що з усіх досліджуваних штамів
здатність засвоювати 5-кето-глюконат мали лише штами, ізольовані від
бджіл.

?

„o

d?^„o

„o

„ o^„o

„o

„ o^„o

&

F

>†Y?Y¬YaYoYiqi

Oe0”yr

TH

TH

Oe0”yr

TH

TH

Oe0”yr

TH

TH

?f?0?????

??

?f?0?????

??

?f?0?????

??

?f?0?????

??

?f?0?????

??

?f?0?????

??

?f?0?????

??



?f?0?????

??



?f?0?????

??



?f?0?????

??

?f?0?????

??

‚‚

‚‚

nkdu

‚‚

‚‚

‚‚

nkdI

‚‚

nkda

‚‚

‚‚

?gYKYY

&`/„?If

2грампозитивні палички — вигнуті, булавоподібні, порівняно короткі за
розміром — 0,5 – 0,7 х 1,5 – 3,0 мкм. За сукупністю властивостей згідно
“Керівництва по визначенню бактерій”-9 Бергі він відноситься до виду B.
breve (табл. 3).

B. longum — до нього був віднесений штам B. adolescentis РМ (табл. 3).
Даний штам не засвоював целобіозу, крохмаль, глюконат і саліцин, що
характерно для цього виду.

Реідентифікація колекційних штамів біфідобактерій, що зберігалися в
колекції культур ІМВ НАНУ. В колекції відділу фізіології промислових
мікроорганізмів понад двадцять п’ять років зберігалися в ліофілізованому
стані штами біфідобактерій, які не підлягалися оживленню. В результаті
АРІ-тестування видова належність штамів, ізольованих від людини,
підтвердилася лише у штама B. adolescentis (табл. 3). Останній, за
даними “Керівництва по визначенню бактерій”-9 Бергі, перейменований в B.
thermophilum. Штам B. magnum не вдалося ідентифікувати через те, що
спектр засвоювання ним вуглеводів не відповідав жодній з існуючих
видових діагностик біфідобактерій.

Використання методу ПЛР і АРІ-тестування дозволило визначити видову
належність у штамів, ізольованих від дельфінів, лабораторних тварин,
бджіл, біопродуктів (B. animalis, B. magnum, B. asteroides) і провести
таксономічну ревізію тих культур, які знаходилися на тривалому
зберіганні в колекції.

Підбір оптимальних умов для культивування біфідобактерій

В результаті досліджень найбільш прийнятними для виділення і
культивування досліджуваних штамів біфідобактерій виявились модифіковане
середовище MRS і середовище “Біфідум” з використанням системи створення
анаеробних умов Gas Pak. Крім того, у дослідженнях по культивуванню
біфідобактерій, в яких використовується лише рідке середовище, можна
застосовувати апарат Аристовського.

Особливості біологічних властивостей біфідобактерій

При вивченні антагоністичної активності нами було застосовано, окрім
глюкози як вуглеводний компонент середовища, лактулозу і інулін,
cпираючись на те, що ці вуглеводи в подальшому можуть слугувати
стимуляторами росту біфідобактерій в макроорганізмі.

Виявлено взаємозв‘язок між використаним джерелом вуглецю і
антагоністичною активністю досліджуваних штамів (рис. 2).

Рис. 2. Залежність антагоністичної активності досліджуваних
штамів біфідобактерій від джерела вуглецевого живлення (1 — P.
aeruginosa, 2 — P. vulgaris,

3 — B. cereus, 4 — E. coli, 5 — K. pneumoniae, 6 – S. еpidermidis, 7 —
S. aureus)

Найбільші зони гальмування росту спостерігалися при вирощуванні
біфідобактерій на середовищі з глюкозою. На середовищі з лактулозою
майже всі штами продукували середні зони інгібування, а незначні – при
вирощуванні їх на середовищі з інуліном. При використанні одночасно
лактулози і інуліну як джерело вуглецю було показано, що комбінація з
цими пребіотиками стимулює антагоністичну активність досліджуваних
штамів біфідобактерій проти окремих тест-культур (у порівнянні з
використанням лактулози і інуліну окремо). Дана стимуляція залежить від
джерела їх виділення (рис. 3).

Рис. 3. Залежність антагоністичної активності досліджуваних штамів
біфідобактерій від джерела виділення при рості на різних вуглецевих
субстратах

(1 — глюкоза, 2 — лактулоза, 3 — інулін, 4 — лактулоза й інулін (1:1))

Оскільки антагоністична активність біфідобактерій може бути обумовлена
також наявністю специфічних антимікробних речовин, у ході роботи цікавим
було визначити наявність таких речовин у виділених штамів
біфідобактерій. При вивченні культуральної рідини досліджуваних штамів
„ex tempore” зони затримки росту тест-мікроорганізмів не спостерігалися.
Після концентрування її в 10 разів було виявлено зони затримки росту
окремих тест-культур (затримка росту кишкової та синьогнійної паличок,
та дріжджів роду Candida не спостерігалася).

Величина зон затримки росту при дії таких сполук була різною в
залежності від джерела виділення біфідобактерій (рис. 4).

Рис. 4. Специфічна антимікробна активність досліджуваних штамів
біфідобактерій проти тест-культур в залежності від джерела їх виділення

Найбільші зони затримки росту спостерігалися у штамів біфідобактерій,
ізольованих з шлунково-кишкового тракту мишей і дельфінів.

Таким чином, вивчення антагоністичних властивостей біфідобактерій,
ізольованих з різних природних джерел, показали, що досліджувані штами є
активними антагоністами умовно патогенних мікроорганізмів, причому ця
активність спостерігається як на середовищі з глюкозою, так і в
присутності пребіотиків. Антимікробна активність біфідобактерій
обумовлена дією органічних кислот і продукуванням специфічних
антибіотикоподібних речовин.

Було вивчено відношення біфідобактерій до 46 антибіотиків, які за
механізмом біологічної дії відносяться до 4 класів.

Досліджені штами були чутливими практично до всіх цефалоспоринів,
пеніцилінів, а також до лінкозамідів, макролідів, тетрацикліну,
хлорамфеніколу, фурадоніну, фуразолідону, рифампіцину. Усі штами
проявили стійкість до аміноглікозидів, налідиксової кислоти,
поліміксину. Майже усі штами були резистентними або помірно чутливими до
хінолонів.

До цефазоліну були нечутливими і помірно стійкими штами B. bifidum 10,
B. catenulatum, B. liberorum, B. ruminale/ 1 та B. adolescentis. Всі ці
штами, за виключенням B. ruminale/ 1, виділені з травного тракту людини,
що, можливо, і пояснює їх резистентність до цефазоліну.

Штами, ізольовані з травного тракту людини і сільськогосподарських
тварин, проявили стійкість та помірну чутливість до оксациліну,
доксицикліну, а також до фузидину.

Таким чином, відношення біфідобактерій до окремих антибіотиків не
залежить від виду і джерела виділення біфідобактерій, а варіює в
залежності від їх штаму і виду антибіотика.

За даними ВООЗ, однією з основних вимог до пробіотиків, що
використовуються при лікуванні бактерійних інфекцій у гінекологічно
хворих і вагітних жінок, є адгезія пробіотичних мікроорганізмів до
вагінального епітелію.

Нами було досліджено адгезію біфідобактерій до еритроцитів, вагінальних
епітеліоцитів, аутоагрегацію і гідрофобність поверхні їх клітин.

Встановлено, що досліджувані штами здатні адгезуватися на еритроцитах і
вагінальних епітеліоцитах. Адгезивна властивість не залежала від виду
біфідобактерій, а лише від їх штамової належності. Адгезія до
еритроцитів та до вагінального епітелію у більшості досліджуваних штамів
біфідобактерій не співпадала (рис. 5).

Виявлено залежність між аутоагрегацією і гідрофобністю клітин
досліджуваних штамів біфідобактерій. З іншого боку, нами не було
встановлено взаємозв’язку між цими властивостями культур і адгезією до
вагінального епітелію (рис. 5).

Показано, що в процесі адгезії до вагінального епітелію у B. longum PM
приймає участь протеазо- і ліпазо-чутливий компоненти клітинної стінки,
в той час як у B. pseudolongum BR — амілазо-, періодат- і ліпазочутливий
компоненти.

Відомо, що в проявленні адгезії значну роль відіграє термінальна
структура бактеріального глікокаліксу, зокрема його моноцукровий склад.
Встановлено, що у штама B. longum PM у великій кількості виявлені
N-ацетил-D-глюкозамін, сіалова кислота, б-D-маноза і L-фукоза (рис. 6).
У поверхневих структурах глікокаліксу штаму B. pseudolongum BR у великій
кількості містилися N-ацетил-D-глюкозамін, сіалова кислота, і
Я-D-галактоза (рис.7). Отримані результати говорять про додаткову роль
цих моноцукрів в адгезивному процесі біфідобактерій.

Нами також виявлено, що лактулоза, інулін та глікоген мають різний вплив
на адгезивну активність біфідобактерій. При використанні лактулози, як
єдиного джерела вуглецю, адгезія штаму B. longum PM збільшувалась майже
вдвічі, в

Рис. 6. Взаємодія лектину Triticum vulgare L., специфічного до
N-ацетил-D-глюкозаміну і сиалової кислоти, з глікокаліксом клітини B.
longum РМ. (Збільшення 15000 Х).

порівнянні з контролем (ІАМ 5,6±0,08 і 3,2±0,12 відповідно).

У той же час,

Рис. 7. Взаємодія лектину Arachis hypogaea L., специфічного до
Я-D-галактози, з глікокаліксом клітини B. pseudolongum BR. (Збільшення
10000 Х).

адгезія штаму B. pseudolongum BR збільшувалась майже вдвічі у порівнянні
з контролем при вирощуванні на глікогені (ІАМ 2,0±0,05 і 3,8±0,06
відповідно), але майже не змінювалася в присутності лактулози (ІАМ
1,6±0,34) і була незначною при використанні інуліну як єдиного джерела
вуглецю (ІАМ 0,6±0,04).

Таким чином, серед вивчених штамів B. longum PM та B. pseudolongum BR
найбільш чітко відповідають вимогам, що надаються ВООЗ до пробіотичних
препаратів.

Ідентифікація біфідобактерій на рівні вивчення їх геному

Згідно вимог ВООЗ/WHO біопрепарат або культуру можна вважати пробіотиком
лише тоді, коли чітко встановлено їх таксономічне положення із
застосуванням сучасних методів ідентифікації, зокрема
молекулярно-генетичних. Зважаючи на це, нами була проведена
ідентифікація на рівні вивчення геному штамів B. longum PM та B.
pseudolongum BR, перспективних для створення вагінального пробіотичного
препарату.

В результаті сиквенування для штамів B. longum PM була отримана
послідовність нуклеотидів, довжиною 501 нуклеотид, а для штаму B.
pseudolongum BR — 504 нуклеотиди. При встановленні видової належності
даних штамів за допомогою BLAST-аналізу послідовності 16S рДНК була
підтверджена видова належність штамів B. longum PM та B. pseudolongum
BR.

Дослідження оптимальних умов культивування штамів біфідобактерій,
перспективних для створення пробіотичних препаратів

В прояві біологічної активності мікроорганізмів, зокрема тих, що
використовуються у складі пробіотичних препаратів, визначальну роль
відіграють умови їх вирощування.

Нами було оптимізовано ріст штамів B. longum PM і B. pseudolongum BR по
рН і температурі. Показано, що залежність питомої швидкості росту від рН
середовища у штамів B. longum PM і B. pseudolongum BR знаходиться у
межах 6,8 – 7,1. Плато оптимального росту за температурою для В. longum
PM знаходилася у межах 37-41єС, для B. pseudolongum BR — 37-39єС.

Порівняльний аналіз ростових характеристик штамів B. longum PM та B.
pseudolongum BR, вирощених в середовищах з пребіотиками, дозволив
констатувати ряд особливостей в кінетиці їх росту в присутності
лактулози, інуліну, глікогену та в середовищі MRS (табл. 4). Так,
тривалість lag-фази в усіх випадках була приблизно однаковою, а при
вирощувані B. pseudolongum BR в середовищі з інуліном вона тривала на 30
хв довше.

Питома швидкість росту, а також максимальна кількість біомаси у
стаціонарній фазі росту штаму B. longum PM на середовищі з лактулозою
були навіть трохи вищою за контрольні показники.

При вирощуванні B. pseudolongum BR в середовищі з інуліном питома
швидкість росту була нижчою за контрольні показники. Крім того, ріст в
середовищі з інуліном характеризувався тривалою log-фазою (понад 25
год), а рівень біомаси був у 2 рази нижче за рівень біомаси при
вирощуванні в середовищі MRS. Отримані результати ми пов’язуємо з
відсутністю здатності B. pseudolongum BR активно використовувати для
свого росту інулін.

При дослідженні динаміки росту штаму B. pseudolongum BR в середовищі з
глікогеном було виявлено, що даний штам досить активно метаболізує цей
субстрат: питома швидкість росту була вищою за контрольну (0,17 год-1 та
0,15 год-1 відповідно), максимальна кількість біомаси досягала 7,1х109
КУО/мл.

Таблиця 4

Ростові характеристики штамів В. longumPM * (1)

і B. pseudolongum BR (2) при культивуванні на середовищах з пребіотиками

Штами Середо-

вища Трива-лість lag-фази, год Питома швидкість росту,год-1 Максимальна
оптична густина суспензії, од Максимальна біомаса, КУО/мл рН

середо-вища

1 MRS 1,9 0,14 3,50 2,3х1010 4,35

лактулоза 2,0 0,15 3,70 2,6х1010 4,30

2 MRS 1,9 0,15 1,75 8,3х109 4,30

лактулоза 2,0 0,12 0,70 4,2х109 5,45

інулін 2,5 0,04 1,00 4,5х106 5,20

глікоген 1,9 0,17 1,55 7,1х109 4,50

*Штам В. longumPM не метаболізує інулін та глікоген. р<0,05 Слід зазначити, що в останні роки актуальним є створення так званих синбіотичних препаратів, що містять як пробіотики, так і пребіотичні речовини для стимулювання росту біфідобактерій. Крім того, поширюється популярність і виробництво продуктів функціонального харчування, які містять пребіотики. Високий вихід біомаси при вирощуванні штаму B. longum PM в середовищі з лактулозою, активне засвоювання глікогену штамом B. pseudolongum BR, а також зниження рН середовища до 4,3-4,5 (оптимальне для вагінального вмісту) дають нам можливість запропонувати ці пребіотики як стимулятори росту пробіотичних культур при створенні комплексних синбіотичних вагінальних препаратів. Отримані дані дають підстави рекомендувати біотехнологічні параметри використання лактулози і глікогену як промоторів росту досліджуваних пробіотичних культур. висновки Дана нова трактовка екології біфідобактерій. Показано, що вони є мешканцями травного тракту не лише людини, але й холоднокровних тварин. Вперше виділені біфідобактерії від дельфінів. Встановлено, що в організмі дельфінів біфідобактерії представлені в основному видом B. animalis, у бджіл – видом B. asteroides, у мишей – видом B. magnum. Показано, що біфідобактерії вимогливі до умов культивування. Оптимальним для їх росту є середовище MRS з 0,05% цистеїну при рН 6,8 – 7,1, температурі 37-41єС в атмосфері строгих анаеробних умов, створених системою Gas Pak. Біфідобактерії, ізольовані з різних природних джерел, є активними антагоністами умовно патогенної мікрофлори. Показано, що їх антагоністичні властивості обумовлені продукуванням органічних кислот і специфічних антимікробних речовин. Антагонізм біфідобактерій залежить від штаму і джерела виділення. Найбільшу активність проявили штами B. breve L9, B. animalis BB-12, B. infantis G, B. magnum M39/1, B. magnum. M39/2, B. longum PM, B. pseudolongum BR. Вперше вивчена чутливість біфідобактерій до 46 антибіотиків, що належать до різних класів і груп. Показано, що найбільшу чутливість проявляють свіжоїзольовані штами біфідобактерій. Усі штами чутливі до лінкозамідів, макролідів, тетрацикліну, хлорамфеніколу, фурадоніну, фуразолідону і рифампіцину; резистентні до аміноглікозидів, налідиксової кислоти, поліміксину, ломефлоксацину. Відношення біфідобактерій до доксицикліну, оксациліну, цефазоліну і фузидину не залежить від джерела виділення і варіює в залежності від штаму. Виявлено, що біфідобактерії проявляють адгезивні властивості до еритроцитів і вагінального епітелію людини. Найбільшу адгезивну активність до еритроцитів проявляють штами, ізольовані від людини (середній індекс адгезивності мікроорганізмів становить 3,46±0,08). Адгезивна активність біфідобактерій по відношенню до вагінальних епітеліоцитів не залежить від ступеня гідрофобності поверхні клітин і аутоагрегації. За процес такого прикріплення у штама B. longum PM відповідають протеазо- і ліпазо-чутливий компоненти клітинної стінки, а у штама B. pseudolongum BR - амілазо-, періодат- і ліпазочутливий компоненти. Встановлено, що в адгезивних процесах штаму B. longum PM значну роль відіграють такі поверхневі вуглеводи глікокаліксу клітинної стінки, як N-ацетил-D-глюкозамін, сіалова кислота, L-фукоза і б-D-маноза, а у штама B. pseudolongum BR - N-ацетил-D-глюкозамін, сіалова кислота і Я-D-галактоза. Показано, що поряд з глюкозою біостимуляторами росту B. longum PM і B. pseudolongum BR є лактулоза і глікоген. Лактулоза, глікоген і в меншому ступені інулін стимулюють також прояв антагоністичних і адгезивних властивостей біфідобактерій. Встановлено комплекс пробіотичних властивостей у штамів B. longum PM і B. pseudolongum BR: вони проявляють високу антагоністичну активність по відношенню до референтних штамів умовно патогенних мікроорганізмів, стійкі до широкого спектру антибіотиків, проявляють високу аутоагрегацію клітин і адгезивну активність до вагінального епітелію. Запропоновані пребіотичні компоненти - лактулоза і глікоген – як біостимулятори росту цих штамів, що робить перспективним використання B. longum PM і B. pseudolongum BR у складі синбіотиків. список робіт, опублікованих за темою дисертації Полтавська О.А., Коваленко Н.К. Антагоністичні властивості біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел // Мікроб. журнал. - 2004. - №6. - С. 70-79. (Здобувачем особисто проведена ідентифікація досліджуваних штамів біфідобактерій, в тому числі методом ПЛР, дослідження їх антагоністичної активності, підготовка культуральної рідини, виявлення антимікробних речовин.) Коваленко Н.К., Полтавська О.А. Вплив пребіотиків на ріст біфідобактерій і лактобактерій // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2004. - №194. - С. 37-41. (Здобувачем особисто виявлено стимуляцію біфідобактерій і лактобактерій в присутності лактулози і інуліну, досліджено вплив даних пребіотиків на життєздатність цих бактерій у пролонгованому режимі зберігання, проаналізовано отримані результати.) Коваленко Н.К., Полтавська О.А. Антибіотикочутливість біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел // Мікроб. журнал. - 2005. - №6. - С. 32-39. (Здобувач особисто аналізувала літературні дані, проводила дослідження, здійснювала статистичну обробку отриманих результатів, підготовила статтю до друку.) Коваленко Н.К., Полтавська О.А. Адгезивні властивості біфідобактерій // Вісник Одеського національного університету. - 2005. – Т.10,№7. - С. 117-124. (Здобувачем особисто проведені дослідження адгезії біфідобактерій до еритроцитів, вагінального епітелію, дослідження впливу джерела вуглецю на процес адгезії, виявлення природи адгезинів, проаналізовано отримані результати.) Коваленко Н.К., Полтавська О.А. Идентификация бифидобактерий, изолированных из разных природных источников // Сборник докладов Международной конференции “Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы”. - Москва. 2004. - С. 26-27. Полтавська О.А., Коваленко Н.К. Антибіотикочутливість біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел // Тези доповідей Х з’їзду ТМУ. - Одеса. 2004. - С. 71. Полтавська О.А., Коваленко Н.К. Вплив лактулози і інуліну на антагоністичну активність біфідобактерій // Тези доповідей першої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. - Львів. 2005. - С. 166. Poltavska O.A., Onishchenko A.M. Adhesive properties of bifidobacteria isolated from human // European Conference on Probiotics and their Applications “Euprobio 2005”. - Cracov (Poland). 2005. - HYPERLINK "http://confer.uj.edu.pl/euprobio/plakaty/plakat24.pdf" http://confer.uj.edu.pl/euprobio/plakaty/plakat24.pdf Полтавська О.А., Коваленко Н.К. Підбір оптимальних умов для культивування різних видів біфідобактерій // Тези доповідей ІІ міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. - Львів. 2006. - С. 315. Полтавская О.А., Онищенко А.Н., Коваленко Н.К. Влияние свойств поверхностных структур бифидобактерий на адгезивную активность // Сборник тезисов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХІ века”. - Пущино, Росія. 2006. - С. 208. АНОТАЦІЯ Полтавська О.А. Біологічні властивості біфідобактерій, ізольованих з різних природних джерел. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2006. З різних природних джерел виділені біфідобактерії, здійснена їх чітка ідентифікація на видовому рівні з вивченням широкого спектру фенотипових ознак з використанням сучасних мікробіологічних і молекулярно-генетичних методів. Проведено вивчення біологічних особливостей виділених штамів у порівняльному аспекті з позиції їх екології. Виявлена стимуляція антагоністичної і адгезивної активності біфідобактерій в присутності лактулози, а також глікогену. Встановлений комплекс пробіотичних властивостей у штамів B. longum PM і B. pseudolongum BR. Лактулоза і глікоген запропоновані як біостимулятори росту цих штамів, що робить перспективним використання B. longum PM і B. pseudolongum BR у складі синбіотиків. Ключові слова: біфідобактерії, ідентифікація, біологічна активність, антибіотикочутливість, пробіотики, пребіотики. АННОТАЦИЯ Полтавская О.А. Биологические свойства бифидобактерий, изолированных из разных природных источников. – Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2006. Диссертация посвящена изучению биологических свойств бифидобактерий, выделенных из разных экологических источников: пищеварительного тракта человека, теплокровных (в том числе дельфинов) и холоднокровних (пчел) животных, из биопродуктов. Исследованы свойства реанимированных штаммов бифидобактерий, хранившихся в коллекции Института микробиологии и вирусологии НАНУ в лиофилизированном виде. Определена видовая принадлежность свежевыделенных бифидобактерий, а также осуществлена реидентификация коллекционных штаммов с исследованием широкого спектра фенотипических признаков с использованием микробиологических (АРI-тестирование) и молекулярно-генетических методов (ПЦР). Они отнесены к видам B. animalis, B. magnum, B. asteroides, B. breve, B. longum, B. pseudolongum, B. adolescentis, B. infantis, B. globosum, B. thermophilum. Проведено сиквенирование фрагмента 16S рДНК, подтвердившее видовую принадлежность штаммов B. longum PM и B. pseudolongum BR. Подобраны оптимальные условия культивирования исследуемых штаммов. Проведен сравнительный анализ роста бифидобактерий на разных питательных средах. Среда MRS с 0,05% цистеина и производственная среда “Бифидум” наиболее полно обеспечивали питательные потребности бифидобактерий. Установлено, что анаэробная система Gas Pak создаёт оптимальные анаэробные условия для культивирования исследуемых штаммов. Изучены антагонистические свойства бифидобактерий. Показано, что все исследуемые штаммы проявили антагонистическую активность по отношению к референс-штаммам условно патогенных микроорганизмов. Антагонистическая активность зависела не от вида бифидобактерий, а от источника их выделения и от тест-микроорганизма. Наиболее активными оказались штаммы, выделенные от лабораторных животных (средние зоны задержки роста 14,67±1,00 - 21,67±0,58 мм), и из биопродуктов (зоны задержки роста 11,33±1,53 - 20,67±0,58 мм). Наименьшую антагонистическую активность проявили штаммы, выделенные от дельфинов – зоны задержки роста 9,33±0,58 - 18,67±2,65 мм. Все исследуемые штаммы бифидобактерий в большей степени угнетали рост S. epidermidis, в меньшей - S. аureus и не влияли на рост C. аlbicans. Установлено, что антагонистическая активность исследуемых штаммов обусловлена продуцированием органических кислот и специфических антимикробных веществ. Исследовано отношение бифидобактерий к антибиотикам разного спектра действия. Они чувствительны практически ко всем цефалоспоринам, пенициллинам, нитрофуранам, а также к линкозамидам, макролидам, хлорамфениколу, рифампицину. Все резистентны к аминогликозидам, налидиксовой кислоте, полимиксину. Отношение бифидобактерий к цефазолину, фузидину, оксациллину, доксициклину не зависело от вида и источника выделения бифидобактерий, а варьировало в зависимости от штаммовой принадлежности и вида антибиотика. Исследованы адгезивные свойства бифидобактерий. Показано, что все выделенные штаммы способны прикрепляться к эритроцитам группы О/I (Rh+) человека. Наибольшую адгезивную активность проявили штаммы, выделенные от человека (средний ИАМ 3,46±0,08). Выявлена способность бифидобактерий к адгезии по отношению к вагинальному эпителию. Показано, что она не зависит от аутоагрегации и степени гидрофобности поверхности бактериальных клеток. Установлено, что в адгезии к вагинальным эпителиоцитам штамма B. longum PM принимает участие протеазо- и липазочувствительный компоненты клеточной стенки, у штамма B. pseudolongum BR – амилазо-, периодат- и липазочувствительный компоненты. Показано также, что за способность к адгезии у штамма B. longum PM отвечают поверхностные моносахариды гликокаликса: N-ацетил-D-глюкозамин, сиаловая кислота, б-D-манноза и L-фукоза; у штамма B. pseudolongum BR - N-ацетил-D-глюкозамин, сиаловая кислота и Я-D-галактоза. Установлено влияние пребиотиков на биологическую активность штаммов B. longum PM и B. pseudolongum BR и стимуляцию их роста. Показано увеличение антагонистической активности исследуемых штаммов в присутствии лактулозы. Адгезивная способность бактериальных клеток увеличивается при наличии в средах лактулозы и гликогена. Полученные данные дают основание рекомендовать биотехнологические параметры использования лактулозы и гликогена в качестве промоторов роста исследуемых пробиотических культур. Ключевые слова: бифидобактерии, идентификация, биологическая активность, антибиотикочувствительность, пробиотики, пребиотики. SUMMARY Poltavska A. Oksana. Biological properties of bifidobacteria isolated from different natural sources. – Manuscript. The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 – microbiology. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006. Bifidobacteria were isolated from different natural sources. Their identification on the species level with use of wide spectrum of modern microbiological and molecular-genetic methods was carried out. The study of biological properties of isolated strains was carried out. The stimulation of antagonistic and adhesive activity of bifidobacteria in presence of lactulose and glycogen was shown. Probiotic properties of B. longum PM and B. pseudolongum BR were determined. Lactulose and glycogen were proposed as growth biostimulators of these strains, so the use of B. longum PM and B. pseudolongum BR in composition of synbiotics is very perspective. Key words: bifidobacteria, identification, biological activity, antibiotic susceptibility, probiotics, prebiotics. PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *