Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ЛУК’ЯНЕЦЬ ОЛЕНА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.352.5:576.382

Роль кальцієвих каналів у функціонуванні нервових та нейроендокринних
клітин в нормі та патології

03.00.02 — Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ — 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий консультант: Академік НАН та АМН України,

Доктор біологічних наук,

професор

Костюк Платон Григорович

директор та зав. відділом загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук,

професор

Шуба Михайло Федорович,

зав. відділом нервово-м?язевої фізіології Інституту фізіології ім. О.О.
Богомольця НАН України.

Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. Директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м?язів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович,

зав. кафедрою біофізики Київського Національного Університету імені
Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О.Богомольця

Захист дисертації відбудеться 28.02.2006 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Акад.
Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 26.01.2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О. ЗАГАЛЬНА
ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми

Однією з перших описаних експериментаторами властивостей кальцієвих
каналів, яка не укладалася в існуючі теоретичні уявлення і залишається
неясною по сьогоднішній день, була надзвичайно висока залежність струму,
протікаючого через кальцієві канали, від внутрішньоклітинної
концентрації іонів Ca2+. Іони Ca2+ в субмікромолярних концентраціях
впливали як на величину струму, протікаючого через канали, так і на
селективність і потенціалозалежні параметри каналу (Kostyuk et al.,
1983). Звичайно, така підвищена чутливість досліджуваного процесу до
іонів Ca2+ асоціюється з високою спорідненістю зв?язування цих катіонів
з білками-мішенями. Найчастіше аналогія проводилася з найпоширенішим з
Ca2+-зв?язуючих блків — кальмодулином. Ці дослідження стимулювали
розвиток уявлення про кальцієвий канал як про Ca2+ -зв’язуючий білок,
яке частково підтверджується сучасними даними про первинну структуру
канальної молекули. Саме з цієї точки зору деякі учені і пояснювали
надзвичайно високу залежність Ca2+ каналів від внутрішньоклітинного
Ca2+. З другого боку, висока чутливість досліджуваного процесу до
концентрації вільного Ca2+ може визначатися і активацією цим катіоном
ряду Ca2+-залежних ферментів, у тому числі і тих, що входять в ланцюжок
метаболізму вторинних посередників із участю протеїнкінази-А або
протеїнкінази-С (РК-А або РК-С) та Ca2+-залежних фосфатаз. Особлива роль
в останній час приділяється участі Ca2+-залежної фосфатази –
кальцинейрину, яка специфічно експресується в нервовій тканині, а отже
може бути залучена в специфічні функції нейронів. Відносно участі
процесів фосфорилування та дефосфорилування в модуляції активності
кальцієвих каналів існує ряд робіт. Проте, із всієї сукупності отриманих
даних, часто суперечливих, не можна зробити однозначного висновку про
молекулярні механізми їх дії в регуляції потенціалокерованого транспорту
Ca2+.

Не менша роль в останній час приділяється і функціональній ролі Ca2+-
каналів. Одним із головних напрямів в цьому сенсі є вивчення ролі
Ca2+-каналів в синаптичній передачі, а саме вивільненні
нейротрансмітерів або екзоцитозі на простих моделях-таких як хромафінні
клітини наднирника. По своєму походженню нейросекреторні хромафінні
клітини мозкової речовини наднирників аналогічні постгангліонарним
нейронам симпатичної нервової системи і тому можуть використовуватись як
експериментальні моделі для дослідження синаптичної передачі. Наявність
в цих клітинах різних типів Ca2+ каналів і цілого ряду популяцій
везикул, що здатні приймати участь у екзоцитозі, та зручність в
використанні цих клітин для проведення багатьох вимірювань одночасно дає
можливість формувати різного типу модельні системи.

З іншого боку, як зараз стає відомим, Ca2+- канали приймають участь у
розвитку і протіканні ряду нейрологічних захворювань. Так, було
припущено, що вони залучені до протікання таких захворювань та станів,
як епілепсія та ішемія/гіпоксія, під час яких внутрішньоклітинний Ca2+
сигнал викликає клітинну загибель або індукує зміни електричної
збудливості нейронів, що може призводити до гіперзбудливості та
синхронної активності багатьох нейронів. Тому дослідження в цьому
напрямку є дуже перспективними.

Найбільш методично зручним для такого роду досліджень є
використовування різних модельних систем, кожна з яких має свої
переваги. В цьому відношенні використання нервових клітин (нейронів
гіпокампу та дорсально-корінцевого ганглію (DRG нейронів) є дуже зручною
моделлю для вивчення патологічних станів нервової системи, використання
ідентифікованих нейронів молюсків Helix роmatia та гібридних клітин
нейробластоми?гліоми (NG108-15) є вельми привабливими моделями для
вивчення процесів регуляції активності Ca2+ каналів і, на кінець,
застосування хромафінних клітин, як водночас моделі синапсу та
секреторної клітини для вивчення ролі Ca2+ — каналів в синаптичних та
секреторних процесах. Унікальну можливість вирішити поставлені завдання
дозволяє застосування широкого кола методів, а саме:
електрофізіологічних методів в конфігураціях whole-cell та cell-attached
для вимірювань інтегрального струму та поодиноких каналів,
флуориметричного, полярографічного, амперометричного,
імуноцитохімічного, методу трансфекції, електронно-мікроскопічний,
конфокальної мікроскопії та інших. Використання цих методів у
комбінованих експериментах дають перевагу точно контролювати параметри,
які впливають на перебіг досліджуваних процесів, таких як парціальний
тиск кисню, концентрація Ca2+, вивільнення трансмітеру та інші.

В наш час дуже актуальною проблемою є вивченя механізмів розвитку
паталогічного захворювання мозку – епілепсії та знаходження нових
ентиепілептичних препаратів (AED) для лікування цієї хвороби. Серед
таких препаратів дуже багато таких, що пов’язані із впливом на іонні
канали, в тому числі на Ca2+ канали та внутрішньоклітинний Ca2+
гомеостаз. Існуючі дані про різноманітну природу та форми епілепсії
свідчать про дуже велику складність в підборі фармакологічних агентів
для лікування цього захворювання, навіть при відомій етіології. Тому в
наш час продовжується бурхливий пошук нових фармакологічних препаратів,
які б дозволили здійснювати ефективне лікування цієї хвороби. Якщо
спочатку нові AED призначалися майже виключно для використовування у
складі комбінованого лікування (в поєднанні з іншими
антиконвульсантами), то останніми роками вони пропагуються як засіб
монотерапії (ізольованого лікування) епілепсії. Крім того,
передбачається, що AED другого покоління дозволяють у ряді випадків
добитися контролю над нападами епілепсії, яка вважалася раніше
рефрактерною. Саме ця обставина є визначаючою в сучасній эпілептології.
Так, можна констатувати, що не дивлячись на інтенсивні дослідження в цій
області та суттєвий прогрес у відкритті механізмів виникнення епілепсії
та її чинників, залишається велика кількість не розв’язаних питань,
особливо в галузі фармакології лікування епілепсії.

Таким чином, завдання з’ясування молекулярних механізмів регуляції
активності кальцієвих каналів внутрішньоклітинними процесами
фосфорилування/дефосфорилування, а також роль Ca2+ каналів в секреторній
функції збудливих клітин та їх роль в розвитку та перебігу ряду
патологій мозку є вельми актуальною; вирішення її сприятиме формуванню
уявлень про фундаментальні принципи функціонування нервових та
нейроендокринних клітин, а також може мати велике практичне значення у
з?ясуванні механізмів виникнення патологій мозку (ішемія, епілепсія) та
ендокринної системи, а також у розвитку нових фармакологічних
препаратів, що використовуються в медичній практиці.

Зв’язок роботи із науковими програмами

Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України:
“Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних
мозкових структур”, а також у відділі біофізики Макс-Планк Інституту
Біофізичної Хімії (Гьоттінген, Німеччина), а також у відділі
фармакології Лондонського Університету (Лондон, Великобританія) в рамках
наукових міжнародних програм Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України.

Мета

Метою даної роботи було дослідження ролі та регуляції потенціалозалежних
Ca2+ -каналів в функціонуванні нервових та нейроендокринних клітин в
нормі та патології.

Завдання досліджень

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

Вивчити представництво та особливості різних типів Ca2+ — каналів в
нервових та нейроендокринних клітинах.

Встановити механізми регуляції активності Ca2+ — каналів процесами
фосфорилування та дефосфорилування.

Вивчити морфологічні особливостей хромафінних клітин та їх везикул, що
залучені до екзоцитозу.

Вивчити роль різних типів Ca2+ каналів в Ca2+-залежному екзоцитозі в
хромафінних клітинах.

Вивчити роль Ca2+ каналів в протіканні гіпоксичного ефекту в нервових
клітинах.

Встановити роль Ca2+ каналів в епілептогенезі та механізмів дії
антиепілептичної сполуки – леветірацетаму.

Наукова новизна отриманих результатів

Створено та застосовано модифікований полярографічний метод вимірювання
парціального тиску кисню в розчині омиваючому клітини, за допомогою
платинових електродів в комбінації із електрофізіологічними та мікро
флуоресцентним методами досліджень. Розроблені електрохімічні методи
вимірювання вивільнення катехоламінів із поодинокої клітини за допомогою
карбонових мікроелектродів. Описані біофізичні та фармакологічні
особливості типів Ca2+ каналів в гібридних клітинах нейробластоми?гліоми
та вперше встановлений тип каналу, який раніше не був ідентифікований у
цих клітинах.

Виявлено механізми зміни активності поодиноких Ca2+ — каналів, викликані
їх РК-А-залежним фосфорилуванням. Показано: участь дефосфорилування
протеїнфосфатазою кальційнейрином в регуляції активності Ca2+ — каналів
і участь різних типів Ca2+ каналів в Ca2+-залежному екзоцитозі в
хромафінних клітинах. Розроблено двоступеневу модель Ca2+-залежного
екзоцитозу в хромафінних клітинах. Зроблено морфологічний аналіз та
досліджено склад везикул в хромафінних клітинах. Досліджено роль Ca2+
каналів в перебігу гіпоксичного ефекту в нервових клітинах. Встановлено
роль різних типів Ca2+ каналів в дії антиепілептичної сполуки –
леветірацетаму в нейронах гіпокампу.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів

Результати дисертаційної роботи представляють як фундаментальний
інтерес, оскільки отримано принципово нові дані про особливості
функціонування потенціалозалежних Ca2+ каналів, їх внутрішньоклітинну
регуляцію, участь у процесі вивільнення нейротрансмітерів та розвитку
ряду патологій мозку, таких, як епілепсія та гіпоксія/ішемія, так і
практичне значення. Останнє пов?язано із встановленням молекулярних
механізмів дії нової ефективної антиепілептичної сполуки –
левотірацетаму (КЕППРА), яка широко використовується в медичній
практиці. Отримані дані дають підстави говорити про функціональну роль
різних типів Ca2+ каналів в ряді нервових та нейроендокринних клітин
ссавців та безхребетних. Результати дослідження представляють інтерес
для біофізиків, біологів, фізіологів, фармакологів, ендокринологів,
молекулярних біологів, медиків, оскільки розширюють наші уявлення про
механізми функціювання та патології нервових та нейроендокринних клітин,
а також механізм дії на нервові клітини фармакологічних засобів,
вживаних в медичній практиці.

Особистий внесок здобувача

Авторкою даної роботи зроблено основний внесок у всі стадії роботи,
включаючи постановку завдань, розробку нових методів дослідження
гіпоксії та секреції, проведення переважаючої кількості експериментів,
аналізу їх результатів та написання статей.

Апробація роботи

Основні положення роботи були представлені на наукових семінарах секції
“Молекулярна нейрофізіологія” Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України, а також на наукових семінарах відділу Біофізики Макс-Планк
Інституту Біофізичної Хімії (Геттінген, Німеччина) і відділу
фармакології Лондонського Університету (Лондон, Великобританія). За
роботи присвячені механізмам синаптичної передачі, що увійшли в
дисертаційну роботу, авторка разом із групою співробітників Інституту
ім. О.О. Богомольця НАН України, була удостоєна Державною Премією
України в галузі науки і техніки в 2003 році. Результати доповідалися на
ряді конференцій, серед них:

XIV Congress of the I.P. Pavlov Ukrainian Physiological Society, Kiev,
1994; The advanced School of Neurochemistry 2nd Biennial Course,
Okazaki, Japan, 1995; Physiological Society Meeting, University College
London); 8th International Congress of the Czech and Slovak
Neurochemical Society, 1996; XXXIII International Congress of
Physiological Sciences IUPS, St.Petersburg, Russia, June 30- July 5,
1997; International Workshop ‘Intracellular Signalling’, 1997, 26-29
July) ; 42nd Annual Meeting of Biophisical Society, 1998, Kansas City,
USA); XV Congress of the I.P. Pavlov Ukrainian Physiological Society,
Donetsk, 1998; Physiological Society Meeting, Liverpool, 1998, 28 April-
1May 1998) ; Forum of European Neuroscience, 1998, Berlin, 27 June-1
July); 12 Meeting of the European Society for Neurochemistry, St.Pet.,
Russia, 1998); Ist Ukrainian Neuroscience Society Meetting, Kiyv, 24-26
November, 1998); 2nd FEPS CONGRESS, 1999, Prague; Fifth IBRO Word
Congress of Neuroscience. Israel, 1999; International Neuroscience
Symposium Cells, Channels and Signals. Kiev, 1999; The Eighth Annual
Meeting of the Israel Society for Neurosciences, Isarael, 1999;
Physiological Society 1000th Meeting, University of Birmingham, United
Kingdom; NATO Workshop, Ca2+ Signaling and Cross-talk, IlCiocco, Italy
2000; III National Congress of Pathophysiologists, 24-27 May, Odessa;
Autumn Workshop «Membranes and Signalling», Kiev, September 4-8, 2000;
Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc 2000, Gif-sur-Yvette, France,
2000; Physiological Society Meeting, King’s College London, UK, December
18-20; Bogomoetz-Nencki Meeting, Sulejow, Poland, 2001; II Conference of
Ukrainian Society for Neurosciences with international participation.
Dedicated to 70-aniversary of Physiology Department at Donetsk State
Medical University. Donetsk, 23-27 May 2001

Joint Meeting of American Epilepsy Society and the American clinical
Neurophysiology Society, Philadelphia, USA, 2001; 29th Gottingen
Neurobiology Conference and the 5th Meeting of the German Neuroscience
Society. 2003; International Scientific Conference of Serbian
Physiological Society “Risk factors and health: from molecule to the
scientific basis of prevention” 2003. 7-9 Nov. Belgrade, Serbia. 29th
Gottingen Neurobiology Conference and the 5th Meeting of the German
Neuroscience Society. 2003, Goettingen, Germany. Annual Meeting of the
American Epilepsy Society, 2004. Dec 3-7, New Orlean, USA. IBRO Advanced
School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea. IV National Congres
of Pathophysiologists of Ukraine with International participation. 26-28
May Chernivtsi, Ukraine. First (Inaugural) Congress of Ukrainian Society
of Cell Biology. 2004. 25-28 April, Lviv. Conference en Neurobiologie
Ladislav Tauc Gif-sur-Yvette, France 2004. I Congress of NIS
Physiologists. 2005. 19-23 Sept., Sochy, Dagomys, Russia.

Публікації

По результатам роботи опублікована 1 монографія, 2 розділи в двох
монографіях, 50 статей та 88 доповідей в наукових вітчизняних і
закордонних журналах.

Структура та об’єм дисертації

Дисертація складається із вступу та 6 розділів, присвячених: огляду
літератури, опису методики, експериментальним результатам і їх
обговоренню, висновкам і списку літератури, що містить 930 найменувань.
Роботу викладено на на 357 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 5
таблицями і 96 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкт дослідження

В роботі було використано декілька типів клітин: хромафінні клітини
наднирника бика і щура; нейрони гіпокампу і DRG щурів, ідентифіковані
нейрони слимака Helix pomatia і гібридні клітини нейробластоми?гліоми
NG108-15.

Виділення окремих хромафінних клітин

Експерименти, описані в даній роботі, проводились на свіжоізольованих
хромафінних клітинах наднирників статевозрілих щурів. Нами
використовувались дорослі (5-6 місяців) самки білих щурів лінії Вістар
масою 180-230 грамів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті
у віварії Інституту фізіології Ім. 0.0. Богомольця НАН України. Для
отримання свіжоізольованих клітин використовувалась стандартна процедура
ферментативної ізоляції. Щура анестезували за допомогою ефіру у
спеціальному ексикаторі. Через 10-15 хвилин, коли тварина знаходилась у
стадії глибокого сну, її декапітували і проводили операцію по виділенню
наднирників. Далі за допомогою тонкої голки через устя вени наднирник
промивався стандартним розчином DPBS (9.6гр/літр), що містив фермент
колагеназу тип ІА (Sigma, США) в концентрації 0.5мг/мл. для видалення
крові, що залишилась в тканині. Ферментативну обробку тканини проводили
в цьому ж розчині на протязі 30/50 хвилин при 37°С. Потім під
бінокуляром на фільтрувальному папері в чашці Петрі, за допомогою
хірургічного леза виділялась більш темна за кольором медулярна частина
наднирника, яка розділялась на тонкі частини товщиною 300/500 ??.
Отримані зрізи інкубувались в розчині DPBS, що містив колагеназу в
концентрації 0.3мг/мл протягом 50/60 хвилин при 37°С. Надалі зрізи
подрібнювались за допомогою спеціальних ножиць на якомога менші частини.
Окремі хромафінні клітини отримувались за допомогою м’якого, повільного
піпетування з використанням піпеток різного діаметру не менше 15
хвилин.Всі експерименти на тваринах проводились у відповідності з
вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин.

Ферментативне виділення окремих DRG нейронів

Експерименти, також проводились на гостроізольованих нейронах гангліїв
дорзального корінця білих щурів лінії Вістар віком 1,5-2 місяці, що
утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту
фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Для отримання клітин
використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Щура
декапітували під легким ефірним наркозом. З області хребта хірургічним
шляхом видалялась шкіра та м’язи, хребет розсікався навпіл в
горизонтальній площині та виділялися грудні та поперекові спинномозкові
ганглії, які поміщалися у чашку Петрі з охолодженим до 4 С розчином DPBS
з глюкозою. Після 2-3 хвилин охолодження ганглії переносилися у розчин
Tyrode, що містив ферменти колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в
концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV, Sigma, США) в концентрації
1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30 хвилин при температурі
37?С. Для отримання суспензії клітин ганглії піпетувалися за допомогою
Пастеровських піпеток різного діаметру у 0.5 мл розчину Tyrode. Отриману
суспензію витримували у чашках Перті на протязі 20-30 хвилин для
закріплення клітин до дна чашки.

Культура клітин гіпокампу

Первинна культура нейронів гіпокампу готувалася з новонароджені щурів
лінії Вістар. Тваринні декапітувались і їх мозок поміщався у
фосфатно-буферний розчин Процедура декапитації проводилася при
дотриманні правил використовування піддослідних тварин Національної
Академії Наук України. Цілий гіпокамп виділявся, зрізи гіпокампу
нарізалися завтовшки 450-550 мкм. Після 10-хвилинної обробки 0.025%
трипсином у фосфатно-буферному розчині при 34°С, тканина промивалася 4
рази в мінімальному середовищі Ігла (Sigma) з додаванням кінської
сироватки (10%) (Gibco). В цьому розчині клітини були механічно
дисоційовані за допомогою Пастерівських піпеток. Для
електрофізіологічних експериментів ми вибирали, під візуальним
контролем, пірамідні нейрони гіпокампу.

Виділення нейронів слимака

Експерименти були виконані на нейронах дорзальної і вентральній
поверхні підглоткового комплексу гангліїв виноградного равлика Helix
роmatia. Тварини містилися в прохолодних тераріумах віварію. Не менше
ніж за тиждень до експерименту молюски переносились в приміщення з
температурою повітря +18?+20?C, де вони находились в добре аеруємому
вологому боксі. Препарування нейронів равликів здійснювалося
безпосередньо перед дослідом і полягало у витяганні навкологлоткового
кільця гангліїв. Для видалення щільних сполучнотканинних оболонок, що
покривають нейрони, препарат інкубували в нормальному розчині Рінтгера,
що містив 1% пронази, на протязі 90 хвилин при температурі 37?С.
Пом’ягчені проназою сполучнотканинні оболонки легко віддалялися за
допомогою мікропінцету і мікроножиць під контролем бінокулярного
мікроскопа. Після відмивання ферменту розчином Рінтгера, клітини
поміщалися в холодильну камеру для інактивації дії ферменту і
знаходилися там при температурі +4?C до початку експериментів. Нервові
клітини такого препарату володіли нормальною активністю і високим опором
мембрани.

Ідентифікація педальних нейронів

Разом з використовуванням в дослідах неідентифікованих нейронів, в
більшій частині експериментів застосовували ідентифіковані нервові
клітини — “педальні нейрони”, отримані по спеціальній методиці. Після
звичайної ферментативної обробки препарату навкологлоткового кільця
гангліїв, з його вентральної поверхні вирізувалися невеликі ділянки
педальних гангліїв. Ці ділянки включали нейрони, прилеглі до групи
нервів (VIII — X), розташованих в цій області ганглія (згідно схемі
Кіліаса, що виходять. Надалі нейрони, локалізовані в цих фрагментах,
після їх механічного виділення, використовувалися для остаточної
ідентифікації по наявності стимулюючої дії 5-НТ на ICa вже в ході
електрофізіологічного експерименту.

Культивування гібридних клітин NG108-15

Культуральне середовище складалося із 90% MEM, 10% FCS (ембріональна
сиворотка теляти), НАТ (хіпоксантін-аміноптерін-тімідін) добавки і
пеніцилін-стрептоміціну. За день до диференціаціі NG108-15 клітини були
перенесені на скляні скельця. Клітини були диференційовані,
використовуючи стандартні процедури, описані раніше шляхом обробки
клітин 10 ?М простагландіном E1 (PGE) і 50 ?М ізобутілметілксантіном
(IBMX) за 3-5 днів до вимірювання. PGE і IBMX були присутні тільки
протягом початкової 48 годин диференціації. Пізніше середовище було
змінене на MEM + 1% FCS + НАТ добавка. В усіх електрофізіологічних
експериментах піпеточний розчин містив 0.1 mM IBMX, щоб запобігти
Ca2+-залежну фосфодістеразну активність. Присутність IBMX ніяким чином
не впливала на інтерпретацію даних, тому що обидві як недиференційовані
так і диференційовані, а також “дикі” типи і трансфековані клітини
оброблялися цим інгібітором.

ОСНОВНІ МЕТОДИ

В роботі використовувався ряд методів, а саме: електрофізіологічні
методи (фіксація мембранного потенціалу, вимірювання активності
поодиноких каналів та вимірювання ємності мембрани), полярографічний та
амперметричний методи, імуноблот аналіз, метод трансфекції,
імуноцитохімії, конфокальної та електронної мікроскопії,
мікрофлуоресцентний метод. Нижче приведено описання основних із них.

Методи фіксації мембранного потенціалу

В даній роботі для реєстрації кальцієвих струмів мембрани нейронів
гіпокампу використовувався метод patch clamp в конфігурації whole сеll.
Експериментальну камеру з прикріпленими до дна клітинами встановлювали в
камеру поміщену на предметному столику інвертованого мікроскопу з
оптикою (Olympus, Японія). Скляні мікропіпетки виготовлялися з
боросилікатного скла (зовнішній діаметр 1.75 мм), використовуючи
витягував піпеток P-97 фірми Sutter Instruments. Після оплавлення
піпетки отримували діаметр кінчика 1 — 2 мкм і опір 2 — 3 М? при
заповненні стандартним «внутрішньоклітинним розчином». Піпетку
з?єднували до вхідної головки підсилювача Dagan PC-One (Dagan Corp.,
США) або EPC-9 (HEKA Electronics, Німеччина). Утворення гігаомного
контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану
прямокутні гіперполяризуючі імпульси амплітудою -10 мВ. Після утворення
«сеll attached» конфігурації компенсували ємність піпетки. “Whole сеll”
конфігурацію одержували, прориваючи мембрану під піпеткою імпульсами
негативного тиску, після чого записували ємнісний струм у відповідь на
гіперполяризуючий імпульс амплітудою -10 мВ і обчислювали ємність
клітини за формулою: Cm = Q/10 де Q — інтеграл струму ємності, Cm —
ємність клітинної мембрани.

Сигнал фільтрували при частоті зрізу 3 кГц за допомогою 3-х полюсного
фільтру Бесселя і 10 kHz цифровим фільтром. Комп’ютерна система
забезпечувала також генерацію командних імпульсів. Збір даних і їх
аналіз здійснювався за допомогою програмного забезпечення PULSE (HEKA
Electronics, Німеччина). Статистичні відмінності були оцінені
дисперсійним аналізом (Анова) з рівнем значущості P.

Вимірювання ємності мембрани

Ємність (Cm) мембрани безпосередньо пропорційна до площі зовнішньої
мембрани; тому зміни в Cm відображають процес ексоцитозу. Ми
використовували метод Lindau і Neher (Lindau & Neher, 1988) для
вимірювання ємності застосовуючи синусоїдний стимул, накладений на DC
підтримуємий потенціал — 70mV в режимі whole-cell. 1KHz, синусна хвиля
величиною 10 mV до піку генерувалася багатоканальним інтерфейсом
(Instrutech, Inc., NY) ITC-16, контрольованим комп’ютером Maкiнтoш
Quadra 700. Генерація синусної хвилі як і компенсація основної частини
ємності клітини і фазочутлива детекція Cm була досягнута з програмним
забезпеченням “Lock-in amplifier”, контрольованим програмним
забезпеченням “Pulse” (HEKA Elektronics). Використовувалася різниця в Cm
(?Cm) до і після деполяризуючих імпульсів, для того щоб виміряти
екзоцитоз протягом імпульсів (Neher & Marty, 1982c; Gillis, 1995). ?Cm
був вирахований off-line, тобто після експерименту, як різниця між
середніми препімпульсними Cm на протязі 50 ms вікна перед деполяризацією
і середньою величиною Cm, виміряною під час 500ms вікна після кінця
деполяризації. Аналіз даних виконувався програмним забезпеченням,
написаним в коді макрокоманд IgorPro (WaveMetrics, Inc., Like Oswego,
орегон) нами (ООЛ), а також використовувався код, написаний доктором
K.D. Gillis.

Вимірювання кисню в електрофізіологічних експериментах

В експериментах та медичній практиці часто застосовують безпосереднє
вимірювання кисню в тканинах або біологічних розчинах використовуючи
електрохімічні методи за допомогою платинового електроду, на якому
відбувається відновлення кисню (Рівняння 1).

O2 + 4e- +4H+ ? 2H2O (1)

Схематичне зображення принципу вимірювань рО2 платиновим електродом під
час електрофізіологічного експерименту представлено на Рис.1. Для
експериментальних електрофізіологічних досліджень в основному
використовується платиновий вимірювальний електрод із скляною ізоляцією
діаметром 0.3 ? 0.5 мм. Найважливішою характеристикою платинового
електроду є його полярографічна характеристика — полярограма.
Полярограма відображає залежність електродного струму (Іе) від
прикладеного електродного потенціалу (Ue) і має нелінійну форму із явно
вираженим плато, при якому і проводять вимірювання.

Полярограма має складну форму, що пояснюється електрохімічними
властивостями електроду та фізичними процесами, такими як формування
подвійного електричного шару, ємнісний та Фарадеївський струми та ін.
Оскільки амплітуда струму на електроді залежить від вмісту кисню в
розчині, то підвищення pO2 приводить до лінійного зростання амплітуди
Іе. Таким чином, знаючи коефіцієнт нахилу залежності Іе від pO2,, можна
вимірювати абсолютне значення pO2 у розчині. Властивості та
характеристики платинового електроду та методів вимірювання pO2 детально
описані в ряді робіт (Konovalenko et al., 1975; Lukyanetz & Shkryl,
2003).

Амперометрія

За допомогою конфігурації «амперометрія» ми реєстрували процес секреції
з найбільшою часовою роздільною здатністю. При прикладанні постійної
напруги 600/800мВ на електрод з карбоновим волокном, який занурений в
фізіологічний розчин, виникає електричний струм, що повільно затухає
протягом декількох сотень секунд. Цей струм виникає через процес
заряджання ємності подвійного шару та окислення певних компонент
поверхні електроду. Після приблизно 5 хвилин загальний струм
стабілізується та складає звичайно 5/10пА. За таких умов можна
розпочинати досліди. Для таких електродів рівень шуму складає в
середньому 0.5/1.5пА при ФНЧ (3-полюсний фільтр Бесселя) 3кГц
(використовуючи підсилювач ЕРС-9 при коефіцієнті підсилення 20мВ/рА).

Електрод з карбоновим волокном електричне можна представити як резистор,
послідовно сполучений з паралельним з’єднанням опору та ємності. Цей
послідовний опір складає 100/500к0м та виникає через контакт між
карбоновим волокном та розчином електроліту 3М КС1 (опір самого волокна
є незначним і складає всього 3/4к0м/см) та ємністю порядку 3/40пФ.
Паралельний опір складає 10/100Гом та залежить від степені обрізання
кінчика електроду. В якості допоміжного (індиферентного) електроду
найкраще всього використовувати хлор-срібний електрод.

Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію

Для вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Са2+]і) ми
використовували кальцій-чутливий барвник Fura-2 AM (Molecular Probes,
США), що має здатність проникати через клітинну мембрану (Grynkiewicz et
al., 1985). Якщо Fura-2 присутня в досить високій концентрації всередині
клітини, вона витісняє всі ендогенні кальцієві буфери і дозволяє
вимірювати загальну кількість іонів кальцію, що входять всередину
клітини.

Клітини інкубували протягом 30 хв. при температурі 37°С в
зовнішньоклітинному розчині, що містив 1/2 ?M Fura-2 АМ. Після цього
клітини відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в
темряві при кімнатній температурі на 30/40 хвилин для завершальної
деестерифікації Fura-2 АМ. Чашка Петрі з клітинами розташовувалась в
полі зору інвертованого мікроскопу Olympus ІХ70 (Токіо, Японія). Для
реєстрації кальцієвих транзієнтів, які виникали внаслідок стимуляції
клітини певним розчином, використовувався підсилювач ЕРС-9 (НЕКА,
Ламбрехт, Німеччина). Керування процесами вимірювання, а також запису
даних контролювався за допомогою комп’ютерної програми «Pulse» та
„Х-chart” (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Для зміни зовнішньоклітинних
розчинів навколо вибраної клітини була застосована система локальної
аплікації. Швидкість зміни розчину складала 0.3 мл/хв. В робочому режимі
збудження флуоресцентного зонду здійснюється при довжинах хвилі 360 (F1)
та 380 (F2) нм за допомогою монохроматора. Реєстрація емісії зонда
проводилась в діапазоні 510 нм за допомогою фотопомножувача. Сигнали з
фотопомножувача подавали на вхід ЕРС-9, який в реальному масштабі часу
розраховував відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах
R=F1/F2. Отримані експериментальні дані оцифровувались та зберігались на
жорсткому диску комп’ютера для наступної обробки.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Ca2+ КАНАЛІВ

Біофізичні властивості Ca2+ каналів на прикладі NG108-15 клітин

Клітинна лінія нейробластоми?гліоми NG108-15 — це гібридна моноклональна
клітинна лінія, штучно сформованої злиттям двох окремих ліній,
нейробластоми миші і лінії щурячих клітин гліоми. Після диференціювання
клітин за допомогою простагландіну E1, NG108-15 клітини показують
електрофізіологічну і фармакологічну схожість до споріднених їм
симпатичних нейронів. Завдяки цим властивостям, NG108-15 клітини можуть
слугувати зручною модельною системою для дослідження властивостей іонних
каналів і як могутній інструмент для експресії чужого генетичного
матеріалу, щоб впливати на різні функції нейрону включаючи активність
Ca2+ каналів. В цьому розділі ми виконали детальну кількісну оцінку
компонентного складу і властивостей LVA і HVA Ca2+ каналів цих клітин, і
вперше опиcали петч-клемп дослідження, що показали, що NG108-15 клітини
експресують четвертий тип Ca2+ каналів — залишковий компонент, який дуже
подібний до LVA струму активацією і кінетикою інактивації, проте, поріг
його активації лежить ближче до компонентів HVA струму, і може належати
до Q-типу каналів.

Підхід, який звичайно використовується для оцінки внеску компонентів
струму – є вимірювання значення піку фармакологічно розділених Ca2+
струмів при потенціалах, що відповідають максимуму I-V кривої. Цей вид
аналізу не оптимальний, тому що в багатоскладових струмах асиметрична
форма I-V кривих для різних компонентів і відносних переміщень їх
максимумів може давати реальні помилки в оцінці їх внеску. Ми, таким
чином, оцінювали Ca2+ інтеграл I-V відношення (?Ca ) який прямо
пропорційний до значення амплітуди Ca2+ струму при даному потенціалі
мембрани, і відображає загальну кількість Ca2+, який може входити в
клітину під час ремп-деполяризації мембрани. Ми вираховували ?Ca як
інтеграл густини струму, узятий уздовж I-V кривої :

(2)

де ICa є амплітуда Ca2+ струму, Cm — це ємність мембрани, Vo і Vt є
початковим і кінцевим значеннями тестового потенціалу і V є потенціал
мембрани.

Як можна бачити із Рис.2, що на відміну від недиференційованих клітин,
Ca2+ вхід через Ca2+ канали (вирахований як ?Ca) в клітину під час
деполяризації, збільшується близько в 13 разів в сферичних
“диференційованих” і близько в 30 разів в клітинах з нейритами.

Підсумовуючи результати можна зазначити, що використовуючи інтеграл
вольт-амперних залежностей, як нову оцінку складових компонентів Ca2+
струму в гібридних NG108-15 клітинах ми визначили істотні зміни в
значеннях і композиції Ca2+ струмів під час клітинної диференціації
(Рис.2). Тільки низькопорогові Ca2+ струми могли спостерігатися в
недиференційованих клітинах; після диференціювання клітин з’являлися
високопорогові Ca2+ струми і загальний Ca2+ струм збільшувався близько в
30 разів. Застосовуючи фармакологічні і біофізичні методи розділення
струмів, ми визначили чотири головні типи Ca2+ каналів в
диференційованих клітинах: приблизно 50%, 20%, 17% складали N-, T-,
L-типи відповідно і 12% залишковий струм, який позбавлений чутливості до
класичних блокаторів LVA і HVA струмів, за винятком ?CTxMVIIC (Рис.3).
Ми встановили, що всі струмові компоненти показали кінетику і
фармакологічні властивості, подібні до нейрональних клітин. Ми також
встановили істотну Ca2+-залежність дії ?CTxGVIA для пригнічення N-типу
Ca2+ каналів — 10mM Ca2+ в омиваючому розчині зменшував в три рази
ефективність токсину до блоку N-каналів. Залишковий компонент, за своїми
особливостями підходив до властивостей Ca2+ каналів Q-типу: він був
чутливим до ?CTxMVIIC і був дуже подібним до Ca2+ каналів T-типу
кінетикою, проте, поріг активації був ближчим до HVA компонентів
(-40mV). Наші результати показують функціональну різноманітність Ca2+
каналів і вперше продемонстрували, що в NG108-15 клітинах експресується
ймовірно Q-тип Ca2+ каналів ?1A сім’ї, який має біофізичні і
фармакологічні властивості, які відрізняються від таких описаних раніше
для T-, L- і N-типів в цих клітинах.

Механізми регулювання поодиноких Ca2+ каналів фосфорилуванням

Високо порогові Ca2+ канали грають важливу роль в запуску і модуляціі в
більшості метаболічних процесів в нервових клітинах і можуть бути
суб”єктом істотного функціонального регулювання з боку широкого кругу
різноманітних фізіологічних і фармакологічних агентів. Природні
нейротрансмітори є одним з класів агентів, які впливають на активність
Ca2+ каналу. В цьому відношенні 5-HT належить до філогенетичних
найстаріших із них. Окремі публікації присвячені впливу 5-HT на
активність Ca2+ каналу (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al., 1992; Kostyuk &
Lukyanetz, 1993), які показали, що 5-HT здатний збільшувати Ca2+
провідність мембрани в нейронах. Наші попередні дані, отримані на
педальних мотонейронах слимака Helix pomatia , показали, що 5-HT істотно
збільшує амплітуду Ca2+ струму, (ICa) в цих нейронах, тоді як інша
більшість нейронів має іншу чутливість (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al.,
1992b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993). Попередній аналіз механізму
стимулюючоі дії 5-HT на Ca2+ канали педальних нейронів показав залучення
cAMP-залежного фосфорилування в цей процес (Kostyuk et al., 1992a;).
Проте, молекулярні механізми змін активності поодиноких Ca2+ каналів під
час їх фосфорилування до сих пір не ясні. В цьому розділі, ми прагнули
проаналізувати ці механізми на рівні функціювання поодиноких Ca2+
каналів під час їх 5-HT-індукованої та опосередкованої сАМР-залежним
фосфорилуванням регуляціі в ідентифікованих педальних нейронах,
використовуючи їх як модель.

Підсумовуючи цілослідження можна констатувати, що вивчаючи дію
серотоніну (5-HT) на активність поодиноких Ca2+ каналів в
ідентифікованих нейронах слимака pomatia Неlіх, ми встановили, що тільки
один тип Ca2+ каналів із провідністю поодинокого каналу 5pS був
визначений в умовах фіксаціїї мембранного потенціалу в конфігурації
cell-atached (Рис.4). Кінетичний аналіз показав монотонно спадаюче
розподілення часу відкритого стану каналу (OT) з середніми значеннями
константи часу 0.2ms. Розподілення часу закритого (CT) каналу
описувалось двох-експоненціальною кривою з константами часу 1 і 12ms. Ми
встановили, що серотонін 5-HT діє на активність Ca2+ каналу не прямо, а
через цитоплазматичні посередники. Ми встановили, що 5-HT подовжував
відкритий стан каналу OT (до 0.3ms) і скорочував закритий стан каналу CT
пропорційно для обох констант до 0.4 і 6 ms відповідно. Ми зробили
висновок, що збільшення Ca2+ макроструму сАМР-залежним фосфорилуванням,
визначається змінами кінетики, зростанням числа активних каналів і
зростанням вірогідності знаходження каналів у OT. В той же час, 5-HT не
впливав на провідність поодинокого каналу .

Роль дефосфорилування в регуляції активності Ca2+ каналів

Кальцинейрин або протеїнфосфатаза 2B (PP2B) є винятковою серед інших
протеїнфосфатаз завдяки її високій Ca2+- і кальмодулінній-залежності
(Klee & Nirenberg, 1974; Kincaid, 1993). Очевидно, що PP2B відіграє
важливу роль у функціонуванні нервових клітин, оскільки вона широко
розповсюджена саме в нервовій системі (Usuda et al., 1996). Одна з
функцій PP2B може полягати в її участі у внутрішньоклітинній Ca2+
сигналізаціі, і потенціалозалежні Ca2+-канали, можуть бути її мішенню
(Armstrong, 1989a; Kostyuk & Lukyanetz, 1993a). Тому було дуже важливо,
виявити активність PP2B в нервових клітинах, таких як DRG нейрони і
встановити можливу колокалізацію PP2B і Ca2+ каналів в цих клітинах. Для
цього ми використовували специфічні антитіла до РР2В (anti-PP2B).

Підсумовуючи ці дослідження можна заключити, що ми детально
проаналізували локалізацію кальцинейрину в нейрональних елементах за
допомогою використання конфокальної мікроскопії і імуноцитохімічних
підходів для вимірювання експресії РР2В в культивованих щурячих нейронах
спинних корінців дорзальних гангліїв. Ми встановили, що що
імунореактивність кальцинейрину надзвичайно виражена в DRG нейронах і що
він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної
мембрани (Рис.5). Імунопокрашення цих клітин антитілами anti-?
субодиниці потенціал-керованих Ca2+ каналів показало, що розподілення
?-субодиниці Ca2+ каналу і кальцинейрину дуже подібні (Рис.5). Отримані
нами дані підтримують припущення, що функція кальцинейрину може бути
безпосередньо пов’язана з активністю потенціалокерованих Ca2+ каналів.

Активність Ca2+ каналів в клітинах що оверекспресують РР2В

Ріст цитоплазматичної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i ) являється одним із
факторів, що запускає та сприяє процесу спаду (run-down)
високо-порогових Ca2+ струмів, який спостерігається в петч-клемп
дослідженнях. Проте, мало відомо про точний механізм дії Ca2+ на цей
процес. Електрофізіологічні дослідження вже повідомляли, що один з
шляхів, яким потенціалокеровані Ca2+ канали пригнічуються
(down-регулюються) може відбуватися шляхом дефосфорилювання Ca2+
каналів. Декілька протеїн фосфатаз можуть бути задіяні в цей процес.
Так, участь Ca2+/кальмодулін залежної фосфатази-2B (Chad & Eckert, 1986;
Armstrong, 1989b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993) та протеїн фосфатази типу 1
і 2A в down-регуляції Ca2+ були показані. Серед серін-треонінових
фосфатаз, тільки PP2B є Ca2+-активованим ферментом і

таким чином, може виключно відповідати

за Ca2+-залежний компонент канального дефосфорилювання. Як було показано
вище, після диференціації, NG108-15 клітини проявляють
електрофізіологічні властивості дуже подібні до таких у симпатичних
нейронів. Головна перевага цієї клітинної лініі — це ії здатність до
гетерогенної експресії чужеродного генетичного матеріалу. Тому ми
використовували NG108-15 клітини для оверекспресії в них PP2B і
тестували результати змін в активності різних типів Ca2+ каналів
представлених у цих клітинах.

Підсумовуючи результати цих досліджень можна зазначити, що в наших
експериментах експресія PP2B в NG108-15 клітинах була змінена
трансфекцією за допомогою конструкції плазмід, які містили повну довжину
cDNA людської PP2B?3 в сенс (CN15) та антисенс (CN21) оріентаціях
(Рис.6). Конфокальна іммуноцітохімічна локалізація анти-РР2В показала,
що в нативному типі клітин, PP2B іммунореактивність однорідно
розподілена в не диференційованих клітинах і розміщується на внутрішній
поверхні мембрани і нейрітах в диференційованих клітинах (Рис.7). Щоб
тестувати Ca2+-залежність Ca2+ каналів, ми використовували
високо-частотну стимуляцію (HFS) клітин, і встановили, що амплітуда
L-типу і N-типу Ca2+ струмів зменшувалась на 37% і 52% відповідно, тоді
як T-тип був тільки незначно чутливий до цієї процедури (Рис.9). FK-506
(2?M), специфічний блокатор PP2B, зменшував пригнічення L- і N- типів
Ca2+ каналів індуковане HFS на 30% і 33% відповідно. В трансфектних
CN-15 клітинах оверекспрепресуючих PP2B, сумарні високопорогові (HVA)
Ca2+ струми були пригнічені близько на 60% при тестовому потенціалі
+20mV. Внутрішньоклітинне додавання EGTA або FK-506 в CN-15
трансфековані клітини індукувало 5 разове збільшення амплітуди HVA Ca2+
струмів (Рис.8). Отримані дані показали, що активність PP2B не впливає
на експресію HVA Ca2+ каналів, але модулює їх функцію Ca2+-залежним
дефосфорилюванням і що головною мішенню РР2В є Ca2+ канали N-типу. Наші
результати також засвідчують, що HVA Ca2+ канали знаходяться в
фосфорильованому стані в контрольних умовах і що РР2В залучена в
негатитвну регуляцію Ca2+ каналів.

УЧАСТЬ Ca2+ КАНАЛІВ В РЕГУЛЯЦІЇ Ca2+-ЗАЛЕЖНОГО ЕКЗОЦИТОЗУ

Морфологічні особливості секреторних везикул хромафінних клітин

Не дивлячись на численні дослідження, присв’ячені процесу екзоцитозу
або секреції катехоламінів із надниркових хромафінних клітин, в яких
використовувалися різні експериментальні підходи (Gillis, 1995) існує
дуже небагато детальних морфологічних аналізів їх секреторних гранул і
везикул. Проте, очевидно, що походження і поведінка різних типів
секреторних органел досить складні і залучають численні біохімічні
процеси для синтезу різних субстанцій, що вивільняються із хромафінних
клітин. Дослідження показали, що ці нейроендокринні клітини вивільняють
моноаміни і ацетілхолін (ACh) із різних секреторних везикул,
припускаючи, що транспортні протеїну, відповідальні за упаковку цих
нейромедіаторів, розподілені серед різних везикулярних компартментів.
Дійсно, не кажучи про головні секреторні везикули — великі щільні
везикули (LDCVs) та синаптично-подібні мікровезикули (SLMV) які були
знайдені в перероджених пухлинних хромафінних клітинах (PC12 клітини) та
в SIF клітинах (клітини малої інтенсивності флуоресцентні). Різні
синтезовані матеріали розподіляються між цими двома видами везикул
різними способами. Так, катехоламіни, нуклеотиди, ліпіди і пептіди
знаходяться в LDCVs тоді як ацетилхолін (ACh) присутній в SLMV. Більше
того, спеціалізовані везикулярні системи, для синтезу катехоламінів і
ACh і їх трансортування присутні в різних везикулах. Тому, метою цього
розділу було дослідити за допомогою електронної мікроскопії морфологічні
особливості секреторних везикул в хромафінних клітинах бика та їх
поведінку під час екзоцитозу індукованого деполяризацією.

Дані, представлені в цьому розділі пов”язані з вивченням типів
секреторних везикул за допомогою електронної мікроскопії.

Підсумовуючи описані дані в цьому розділі можна сказати, що
морфометричний аналіз виявив п’ять видів електроннощільних секреторних
везикул в хромафінних клітинах. Ними виявилися: елементарні великі
катехоламін-вміщуючі хромафінні гранули округлої форми (LDCG), великі
щільні везикули овальної і палочковидної форм (LDCVo і LDCVr), малі
щільні везикули (SDCV) і рибосомо-вкриті везикули (RCV) проміжної
густини. Серед електронно-світлих везикул виявилися малі
синаптично-подібні мікровезикули (SLMV), клатрин-вкриті ендоцитотичні
везикули (ECCV), везикули конуса росту (GCV) і великі світлі спорожнені
везикули (LLCV). Деполяризація мембрани та збільшення
внутрішньоклітинного Ca2+ викликали переміщення везикул SLMV, SDCV та
LDCVo до мембрани для участі у екзоцитозі. Мікровезикули (SLMV)
короткочасно зливалися з мембраною (kiss-and-run механізм, Рис.10) під
час індукованого екзоцитозу, тоді як електронно-щільні везикули SDCV та
LDCVo малого розміру зливалися із мембраною формуючи омега-подібні
вп’ячування (Рис.11). У розділі описана структура і функціональна основа
різних типів секреторних везикул концентруючись на їх формуванні і
потенційній ролі.

Секреторні відповіді вимірювані амперометричним методом

Наступна серія експериментів була присвячена дослідженню динаміки
процесу вивільнення від окремої хромафінної клітини. Для цього
застосовувалось два способи ініціації процесу екзоцитозу: активація AСh
рецепторів за допомогою аплікації їх агоніста ацетилхоліну (ACh) в
концентрації 1 mM та деполяризація клітини розчином, що містив підвищену
концентрацію КС1 (50 mM). В останньому випадку відбувалася активація
Ca2+ потенціалозалежних каналів.

Представлені в роботі амперометричні експерименти показали, що активація
Ca2+ каналів шляхом деполяризації мембрани дійсно спричиняє вивільнення
катехоламінів (Рис.12). Порівняння секреторних відповідей викликаних
деполяризацією та активацією ACh рецепторів показало, що у випадку
короткочасової та довготривалої стимуляції, середня частота появи
квантових процесів вивільнення катехоламінів при стимуляції ACh є
достовірно вища, ніж у випадку деполяризації клітини підвищеною
концентрацією КСl. Порівнюючи загальний рівень процесу секреції ми
зробили висновок, що обидва типи стимуляції можуть відігравати суттєву
роль в ініціації процесу вивільнення катехоламінів хромафінними
клітинами. Причому, у випадку тривалої стимуляції — умови, що може
досягатись при різного роду важких патофізіологічних порушеннях,
активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати більш суттєву роль
в підтриманні відносно постійного рівня екзоцитозу від хромафінних
клітин ніж деполяризація мембрани.

Участь Сa2+ каналів в регуляції Сa2+-залежного екзоцитозу

Деталі, що відносяться до механізмів Ca2+-залежного ексоцитозу зараз
вивчаються із збільшенним інтересом. Одним з важливих питань — є
значення того факту, що окремі підтипи Ca2+ каналів існують в багатьох
секреторних клітинах. Давно вже відомо, що збільшення
внутрішньоклітинноі концентрації ( [Ca2+]i ) біля плазматичної мембрани
завдяки входу Ca2+ через Ca2+ канали мембрани є головним механізмом, що
індукує екзоцитоз ((Katz, 1969; Burgoyne, 1995; Neher, 1998) для
огляду). Проте існують значні, варіації в думках, щодо того, які типи
Ca2+ каналів експресуються в секреторних клітинах, і в якій мірі вони
беруть участь у індукції секреції. Також залишається не ясним, чи
залучення даного типу Ca2+ каналу в секрецію залежить від специфічного
характеру стимулювання, яке використовується.

Як уже вказувалося, внаслідок багатьох схожих властивостей і загального
походження з нейронами, хромаффінні клітини дуже інтенсивно
використовуються для дослідження фундаментальних механізмів
Ca2+-залежного екзоцитозу. Хромафінні клітини секретують катехоламіни і
супроводжуючі субстанції (VIP, субстанція P, опіоіди) у відповідь на
активність вісцеральних (спланхнічних) нервових закінчень. Декілька
типів високо-порогових Ca2+ каналів (N-, L- Q- та P-типи) були
ідентифіковані в хромаффінних клітинах за допомогою селективних
блокаторів Ca2+ каналів (Albillos et al., 1994; Kitamura et al., 1997),
проте значення індивідуального внеску всіх ідентифікованих субтипів
каналів в вивільненні катехоламінів залишається суперечливим. Завдяки
існуванню такої відмінної інформації щодо ролі субтипів Ca2+ каналів в
секреції, ми зробили зусилля, щоб оцінити залучення різних типів Ca2+
каналів у Ca2+-залежний екзоцитоз у хромофінних клітин бика в добре
контрольованих умовах.

Підсумовуючи отримані дані можна констатувати, що бичачі хромафінні
клітини експресують декілька типів Ca2+ каналів, які завдяки втоку через
них Ca2+, запускають екзоцитоз катехоламінів. Використовуючи петч-клемп
whole cell вимірювання на ізольованих клітинах культури, в поєднанні з
Fura-2 мікрофлуориметрією і фармакологічним маніпулюванням, для того,
щоб визначити залежність секреції від різних типів Ca2+ каналів. Ми
встановили, що екзоцитоз лінійно залежить величини амплітуди Ca2+ струму
(Рис.13), а кількість секреції переважно визначається двома параметрами:
Ca2+ зарядом, оціненим як інтеграл Ca2+ струму протягом стимулу і
базальним рівнем [Ca2+]i,,який передує даному стимулу (Рис.14). Ми не
спостерігали переважаючу роль будь-якого із Ca2+ канальних субтипів,
крім того, підвищений базальний рівень [Ca2+]i збільшував секреторну
відповідь на Ca2+ струм, що протікав по будь-якому типу Ca2+ каналу.
Таким чином, фармакологічне виключення різних типів Ca2+ каналів від
участі в секреції не виявило їх специфічні ролі в секреції в наших
експериментах, в яких використовувалися відносно довгі імпульси
деполяризації (50 ? 200 msec). Ми зробили висновок, що для стимулів
довгої тривалості, які вивільняють велику частину готового до
вивільнення везикул не так важливо через який тип Ca2+ каналів Ca2+
входить в клітину (Рис.15). Вивільнення визначається загальною кількістю
входячого Ca2+ і станом наповнення динамічного пулу, який залежить від
базального [Ca2+]i передуючому стимулу. Цей результат не виключає, що
інші види стимулювання клітини можуть привести до відповідей, в яких
специфічність типу Ca2+ каналів має значення.

Двоступенева модель Ca2+-залежності секреції у хромафінних клітинах

Екзоцитоз є одним з головних клітинних процесів, які надають можливість
клітині впливати на її оточення. Цей механізм лежить в основі
міжклітинної комунікації в нервовій системі через виділення
нейромедіаторів в синапсах і тому є основою для інтеграційної функції
мозку. Добре відомо про залучення багаточисельних внутрішньоклітинних
молекул в секреторний шлях. Проте, головний внутрішньоклітинний стимул
для протікання екзоцитозу в збудливих клітинах є підвищення концентрації
внутрішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]i ). Було показано, що Ca2+-залежність
секреції має двоступінчастий характер, який може бути пояснений окремими
моделями, такими як модель “пулів” в хромафінних клітинах (Neher &
Zucker, 1993; Heinemann et al., 1993) або модель секреції “підготовчої
стадії” в нервових терміналях (Seward et al., 1995). Недавно було
запропоновано участь протеінкінази С в біфазному феномені (Smith et al.,
1998). Модель “пулів” передбачає існування трьох везикулярних пулів і
везикулярну “міграцію” від великого резервного до готового до
вивільнення пулу, а потім до секреторних пулів. Було припущено існування
великого резервного і готового до вивільнення пулів визначає
двоступеневу секрецію із кубічною Ca2+-залежністю кінцевої секреторної
відповіді. Модель “підготовчої стадії” описує два ступені – одна з них
фаза, яка є “підготовчою стадією” для секреції і секреторна порогова
фаза безпосередньо. “Підготовча стадія” служить Ca2+-залежною
“ініціюючою ступінню секреції. “PKC модель” пояснює дві фази секреції
PKC-залежними і незалежними процесами залежність від [Ca2+]i. В цьому
розділі ми пропонуємо “везикулярний” механізм, який описує
експериментальні дані, і показує значення цього феномену у функції
секреторних клітин.

Ue

TH

? A ¬

®

O

???? A ¬

®

x O

9x O

eeeie.i0i?ioici¤i ouothoBooeoiocaooeocococaocococacocaocaocoUoUoOoiocoUo
UoUoUoUoUooeoUoUoUoUoUoUoUoUoUoUoUoUIU

^

`

ooiaissississississiaUississiaUiIA¶Ii±?±issi±?i±i±i±ississiaUissississis
sississiaiss

D

H

h†I6EHuy

O

ueoeueoeue?ueoeueoeueoeueoeueoeueeueoeueoeueaeueaeueoeueoeueoeueoeueoeue
oeueoeueoeueoeueoeue?oeueoeueoeue?ueoeueoeueoeueUeueoeueoeueoeueoeue?ueo
eueeOeueoeueoeue

EHuy

???????чинають зливатися з мембраною (Рис.16). Цей процес може
забезпечити дуже важливий фізіологічний процес — запуск та вивільнення
різних нейротрансміторів, які можуть бути диференційовано розподілені
серед різних секреторних везикул. Наприклад, класичні нейротрансмітери,
розташовані в синаптично-подібних мікровезикулах а пептидні, медіатори
можуть бути локалізовані у великих везикулах з щільним вмістом (Рис.17).

УЧАСТЬ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ В ПАТОЛОГІЧНИХ СТАНАХ

Зміни Ca2+ гомеостазу при гіпоксії

Зниження парціального рівня кисню в позаклітинному середовищі (гіпоксія)
є одним з основних ушкоджувальних чинників при мозковій патології,
пов’язаній з порушенням мозкового кровооббігу (ішемією). Таке зниження
супроводиться комплексом системних процесів, одним з найістотніших з
яких являється масоване вивільненняя збудливого синаптичного медіатору
(глутамату) і відповідно викликана їм глибока деполяризація нервових
клітин, що приводить до практичного виключення їх активності
(“эксцитотоксичность”). Механізмам цієї системної реакції присвячена
значна кількість експериментальних досліджень. Найістотнішим компонентом
її є масований вхід іонів Ca2+ в нейрони через активовані
лиганд-керовані канали. Разом з тим, природа безпосередньої дії гіпоксії
на нейрон представляється значно менш вивченою, хоча її з’ясування має
першорядне значення для розуміння основ ушкоджувальної дії гіпоксії.
Мабуть, в самому нейроні є механізми, безпосередньо реагуючі на зниження
парціального рівня кисню біля його поверхні, які можна було б позначити
як первинні сенсори гіпоксії; їх включення приводить до більш глибоких
системних порушень функції клітини і можливо до її загибелі.

Тому нами був проведений докладний розгляд тих первинних змін, які
безпосередньо виникають в нейроні при зміні нормоксичного зовнішнього
середовища на гіпоксичне (10?40 mmHg); для виключення можливих
міжклітинних взаємодій дослідження проводилися на ізольованих сенсорних
нейронах (DRG нейрони) із заднєкорінцевих гангліїв щурів. Оскільки
порушення кальцієвого гомеостазу є найвірогіднішим компонентом таких
змін, було використано пряме визначення змін рівня вільних іонів Ca2+ в
нейроні за допомогою введення в нього флуоресцентного кальцієвого
індикатора Фура-2АМ; рівень pO2 біля зовнішньої поверхні клітини
безперервно вимірювався полярографично за допомогою платинового
мікроелектроду.

Підсумовуючи отримані результати можна констатувати, що гіпоксія
викликала істотне підвищення внутріклітинного рівня Ca2+ вже через
декілька секунд після початку її дії (Рис.18). Викликаний гіпоксією
ефект майже повністю усувався блокуванням потенціал-керованих кальцієвих
каналів L-типу або усуненням іонів Ca2+ з позаклітинного середовища.
Отримані дані дозволяють припустити, що початковими сенсорами
гіпоксичної дії на досліджені нейрони є потенціалокеровані кальцієві
іонні канали плазматичної мембрани, зміни активності яких вторинно
викликають порушення функції іонообмінних механізмів плазматичної
мембрани. Ці зміни можна розглядати як сигнальні процеси, за якими при
тривалій дії гіпоксії слідують більш глибокі зміни клітинних функцій,
пов’язані з порушенням енергетичного балансу клітини.

Ефект гіпоксії на Ca2+ канали залежить від внутрішньоклітинного Ca2+

Одна з проблем яка має важливе значення, в цьому контексті є природа
гіпоксичних сенсорів в нейронах. Молекулярні принципи таких “сенсорів”
залишається в значній мірі невідомою. Вірогідно, що плазматично — іонні
канали мембрани можуть відігравати певну роль в O2-регульованих процесах
(Mironov & Richter, 2000). Існує думка, що індуковані гіпоксією ефекти в
нейронах можуть бути опосередковані переважно відкриттям
ATP-регульованих K+ каналів (KATP), як результат зменшення
внутрішньоклітинного ATP, обумовленого зниженням pO2 (Dart & Standen,
1995). Як результат, може виникати мембранна деполяризація і вхід
кальцію в клітину під час гіпоксії (Haddad & Liu, 2000). Проте, здається
малоймовірним, що тільки ці процеси є механізмами, які лежать в основі
гіпоксичних ефектів, тому що чутливість до гіпоксії в більшості тканин
відбувається в діапазоні що перевищує фізіологічний рівень pO2 без змін
енергетичного метаболізму. Таким чином, можна припустити, що інші
мембранні механізми можуть бути гіпоксіє-чутливим у збудливих клітинах
(Haddad & Jiang, 1997).

В наших дослідженнях, ми показали, що високопорогові Ca2+ канали в
гіпокампальних нейронах позбавлені чутливості до помірної та глибокої
гіпоксії, в умовах коли внутрішньоклітинний розчин містив 10mM EGTA, що
абсорбує вільний Ca2+ і, таким чином, запобігає взаємодії
цитоплазматичного Ca2+ з молекулою каналу. Тому, в представленій главі
ми шукали відповідь на питання як Ca2+ канал відповідає на вплив
гіпоксії при наявності зворотного зв’язку з вільним Ca2+ в цитоплазмі у
свіжоізольованих гіпокампальних нейронах СА1.

Підсумовуючи описані в розділі результати можна заключити, що зниження
pO2 індукувало потенціацію HVA Ca2+ канальної активності на ~25.7 % при
[Ca2+]i =75 nM в порівнянні з безкальцієвим розчином. Збільшення [Ca2+]i
до 410 nM злегка збільшувало ефект і значно уповільнювало спад
(run-down) Ca2+ струму (Рис.20). З другого боку, гіпоксія збільшувала
стаціонарну інактивацію і прискорювала кінетику спаду Ca2+ струму
приблизно на 30%. Ми встановили, що залежність величини гіпоксичного
ефекту від pO2 не лінійна і гіпоксичний ефект суттєво збільшується про
pO2 що лижать нижче значень 40 мм Рт.ст. Ми прийшли до висновку, що
помірна гіпоксія спричиняє подвійну дію на Ca2+ канали — на
внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca2+
канали і їх Ca2+-залежну інактивацію.

Ефект гіпоксії на Ca2+ канали залежить від зовнішньоклітинного Ca2+

Таким чином, ми встановили, що гіпоксія індукує збільшення активності
HVA Ca2+ каналів, і цей ефект істотно залежить від концентрації
внутрішньоклітинного Ca2+. В експериментах, описаних в цьому розділі, ми
тестували роль концентрації зовнішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]e ) у
відповідях CA1 нейронів гіпокампу на гіпоксичний вплив. Підсумовуючи
дані отримані в цьому розділі щоб з’ясувати, чи гіпоксична чутливість
обмежується специфічністю до іонів Ca2+ ми використали петч-клемп
вимірювання в конфігурації whole-cell на ізольованих нейронах CA1
гіпокампу щурів. Також використовувався полярографічний метод для
парціального вимірюваня тиску O2.. Ми встановили, що в 2mM [Ca2+]e
гіпоксичний ефект в 2mM розчині складав ~94% (Рис.19), тоді як
підвищення [Ca2+]e до 5 mM і 15 mM привело до поступового зменшення
ефекту. Ми встановили, що повний заряд Ca2+, що переноситься в клітину
під час гіпоксії, був подібний для всіх тестуємих [Ca2+]e, тоді як заряд
Ca2+, що переносився при нормоксії, відрізнявся для різних [Ca2+]e,
будучи більшим при вищому [Ca2+]e. Ці дані вказали на насичення
гіпоксичного ефекту внаслідок обмеженню провідності каналу (Рис.21).
Таким чином, ми припустили, що гіпоксичний ефект міг бути пов”язаний із
зростанням провідності каналу, причому рівень провідності каналу при
нормоксії може визначити амплітуду гіпоксичного ефекту (Рис.21).

Дія гіпоксії на різні типи Ca2+ каналів

В наших попередніх дослідженнях, ми показали, що HVA Ca2+ струми CA1
гіпокампальних нейронах були чутливі до гіпоксії в певних
експериментальних умовах (Shkryl et al., 2001c). Ми знайшли, що ступінь
чутливості Ca2+ каналів до гіпоксії залежить від концентрації Ca2+ в
середині клітини та зовні клітини. Проте, в тих експериментах ми
тестували чутливість загального HVA Ca2+ струму до гіпоксії без
розділення струму на його специфічні компоненти. В цьому розділі ми
дослідили, як підтипи Ca2+ каналів із ізольованих гіпокампальних CA1
нейронів відповідають на гіпоксичні впливи.

Підсумовуючи результати розділу можна заключити, що використовуючи
методи фіксації мембранного потенціалу в конфігурації whole-cell та
полярографічний метод для вимірювання парціального тиску кисню (pO2) ми
встановили, що зменшення pO2 до 15?30 mmHg індукувало потенціацію HVA
Ca2+ струму на 94%. Використання селективних блокаторів N- і L-типів
Ca2+ каналів, показало, що блокування Ca2+ каналів L-типу зменшувало
гіпоксичний ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу зменшував ефект на
30%. Враховуючи співвідношення струмів, що створюються підтипами Ca2+
каналів в CA1 гіпокампальних нейронах, ми заключили, що обидва типи HVA
Ca2+ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип був в 3.5 разів більш
чутливим до зниження рівню кисню (Рис.22).

УЧАСТЬ CA2+ КАНАЛІВ В РОЗВИТКУ ЕПІЛЕПСІЇ

Леветірацетам (LEV) є новим антиепілептичним препаратом (AED) з
унікальним фармакологічним профілем, яке спричиняє потужне пригнічення
нападів, викликаних в кідлінг моделях епілепсії (Loscher et al., 1998;
Klitgaard et al., 1998). Ця сполука суттєво пригнічує нейрональну
гіперсинхронність в гіпокампі, індуковану додаванням розчину, що містить
високий рівень калію та низький рівень кальцію, без будь-яких суттєвих
ефектів на нормальні електрофізіологічні відповіді нейронів (Margineanu
& Klitgaard, 2000). Таким чином, представлялось дуже важливим, оцінити
можливі клітинні механізми антиепілептичної дії сполуки LEV, які можуть
бути пов’язані з його специфічною взаємодією з молекулярними
структурами, відповідальними за генерацію електричної активності
нейронів мозку.

Попередні дослідження не показали будь-яку модуляторну активність
леветірацетаму на потенціал-залежні Na+ та низькопорогові Ca2+ струми у
щурячих неокортикальних нейронах (Niespodziany et al., 2000a; Zona et
al., 2001). Тому, в даних дослідженнях особлива увага була приділена
високопороговим Ca2+ струмам, які також можуть відповідати за зміни
характерів генерації потенціалів дії у відповідних нейронах. Особливий
інтерес викликало можливість, оцінити здатність LEV специфічно
взаємодіяти з різними підтипами цих каналів, експресованих в різних
типах нервових клітин. В представлених у цьому розділі експериментах, ми
проаналізували результат дії LEV на HVA Ca2+ в ізольованих нейронах CA1
зони гіпокампа щура, розділених на головні підтипи каналів (L, N, P, Q і
R) шляхом застосування стандартних селективних канальних блокаторів.

Підсумовуючи результати можна констатувати, що ефект нового
антиепілептичного препарату левотерацитаму (LEV) на різні типи
високопорогових Ca2+ каналів (HVA) був досліджений на ізольованих
нейронах гіпокампу щурів. Блокатори Ca2+ каналу використовувалися для
виділення підтипів Ca2+ каналів. Струми були заміряні в контролі і після
аплікації 1-200 ?М LEV. Ми встановили, що LEV не зворотно пригнічував
HVA кальцієвий струм в середньому на 18% (Рис.23). Визначена
концентрація половинного пригнічення Ca2+ струму (IC50) блокатором
становила 14.7 ?М (Рис.24), що відповідає концентраціям при клінічних
застосуваннях. Використовуючи преімпульсний протокол стимулювання, ми
показали, що G-білки не були залучені в шляхи що лежать в основі ефекту
LEV, припускаючи, що ефект полягає в прямій дії LEV на молекулу каналу.
Механізм блокування LEV не був пов’язаний з стаціонарною активацією або
інактивацією Ca2+ каналів. LEV не впливав на спад HVA Ca2+ протягом
експериментальних протоколів, що продовжувалися близько 10 min. Нарешті,
LEV при найвищій концентрації, що використовувалися (200 ?M) не впливав
на активність Ca2+ каналів L-, P- або Q-типу в СА1 нейронах щурів
гіпокампа, тоді як він селективно впливав на активність Ca2+ каналів
N-типу із гіпокампу. Максимальний ефект на ці канали, фармакологічно
відокремлені від інших, був близько 37% (Рис.25). Отримані результати
підтверджують факт, що LEV селективно пригнічує N-тип Ca2+ каналів СА1
пірамідальних нейронів гіпокампу. Ці дані також дозволяють припустити
існування підтипу N-типу кальцієвих каналів, чутливих до LEV, які можуть
бути залучені в молекулярну основу його антиепілептичноі дії.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведені дослідження потенціалокерованих Ca2+
каналів, пов?’язані з регуляцією, функцією та роллю в патологічних
станах нервової системи, які вивчалися за допомогою ряду
електрофізіологічних, мікрофлуоресцентних, імуноцитохімічних,
молекулярнобіологічних та інших методів.

За допомогою реєстрації активності поодиноких Ca2+ каналів встановлено,
що РК-А-залежне фосфорилування Ca2+ каналів, котре викликає збільшення
Ca2+ макроструму, змінює кінетику поодиноких каналів, збільшує число
активних каналів і вірогідність їх знаходження у відкритому стані. В той
же час фосфорилування не впливає на провідність поодинокого каналу .

За допомогою імуноцитохімічних досліджень, встановлено, що Ca2+-залежна
фосфатаза кальцинейрин у великій кількості експресується в DRG нейронах,
де він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної
мембрани і його локалізація співпадає з локалізацією ?-субодиниці Ca2+
каналів. Це може свідчити про те, що функція кальцинейрину мабуть
безпосередньо пов’язана з активністю потенціалокерованих Ca2+ каналів.

Досліджено взаємодію між кальцинейрином (PP2B) і Ca2+ каналами в
NG108-15 клітинах, які оверекспресують PP2B, і встановили, що в таких
клітинах сумарні високопорогові Ca2+ струми пригнічуються майже на 60%
по відношенню до контролю. Внутрішньоклітинне додавання блокаторів
кальцинейрину індукувало 5-ти разове збільшення амплітуди цих Ca2+
каналів, що свідчить, що активність PP2B не впливає на експресію
каналів, але модулює їх функцію Ca2+-залежним дефосфорилуванням каналів,
котрі знаходяться в фосфорильованому стані, і що РР2В, головним чином,
впливає на активність N-типу Ca2+ каналів в NG108-15 клітинах.

Досліджено роль різних типів Ca2+ каналів у секреції (екзоцитозі)
катехоламінів в хромафінних клітинах і встановлено, що секреція,
виміряна змінами ємності мембрани, переважно визначається загальним
кумулятивним зарядом Ca2+ струму і базальним рівнем [Ca2+]i, котрий
передує стимулу і не залежить від типу Ca2+ каналів.

Встановдено, що викликаний деполяризацією екзоцитоз проходить через два
ступені, обидва з яких лінійно залежать від [Ca2+]i і від порогової
“критичної” концентрації Ca2+ (200 ? 300 nM). Запропоновано везикулярний
механізм, що описує двоступеневу залежність екзоцитозу від
внутрішньоклітинного Ca2+ ([Ca2+]i). Згідно моделі, при рівні [Ca2+]i,
нижчому порогової точки, везикули малого розміру зливаються з
плазматичною мембраною, тоді як при вищому, починають зливатися з
мембраною і везикули більшого розміру.

Зроблено морфологічний аналіз та досліджено склад везикул в хромафінних
клітинах. Встановлено, що в цих клітинах існує велика кількість везикул,
які відрізняються за своєю морфологією та функцією. Показано, що при
деполяризації хромафінних клітин деполяризацією, підвищенням
внутрішнього Ca2+ або агоністом ацетилхолінових рецепторів у секреції
приймають участь два типи везикул, малі або середні електронно-щільні та
синаптично-подібні світлі, які залучені у процес екзоцитозу різними
механізмами – темні везикули шляхом повного злиття з мембраною, тоді як
світлі – через формування ніжки та тимчасового злиття.

За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду Fura-2
показано, що зменшення парціального тиску кисню до 25/35 мм рт.ст. у
зовнішньоклітинному середовищі ізольованих сенсорних нейронів щурів
спричиняє збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів
кальцію на 120 % і основним шляхом цього збільшення є потенціалокеровані
кальцієві канали L-типу в DRG нейронах.

Досліджено роль Ca2+ каналів в перебігу гіпоксичного ефекту в нейронах
гіпокампу. Встановлено, що помірна гіпоксія (20-30 mm Hg) спричиняє
подвійну дію на Ca2+ канали – з одного боку, вона викликає
внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca2+
канали, і з другого боку — їх Ca2+ -залежну інактивацію.

Встановлено, що зниження pO2 до 15?30 mm Hg індукує потенціацію HVA Ca2+
струму на 94% в нейронах гіпокампу. Використання селективних блокаторів
Ca2+ каналів показало, що блокування каналів L-типу зменшує гіпоксичний
ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу на 30%. Враховуючи співвідношення
струмів, що створюються підтипами Ca2+ каналів в цих клітинах, знайдено,
що обидва типи HVA Ca2+ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип майже в
3.5 разів більш чутливий до зниження рівню кисню.

Вперше встановлено, що антиепілептична сполука леветірацетам селективно
блокує N-тип Ca2+ каналів в нейронах гіпокампу, що може лежати в основі
її анти-епілептичної дії.

Зроблено висновок щодо ролі і принципів регуляції активності Ca2+
каналів, як однієї з основних функцій нейронів і ендокринних клітин, а
також основних причин патологічних станів мозку (ішемії/гіпоксії та
епілепсії), а також особливостей фармакологічного впливу на такого роду
зміни, що складає основу для вивчення можливостей корекції ряду
клінічних захворювань.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. Intracellular mechanisms of calcium channel
modulation by serotonin in identified Helix Pomatia neurones //
Netherlands Journal of Zoology, 1994, 44, 513-523.

Lukyanetz E.A., Kostyuk P.G. Two distinct receptors operate the cAMP
cascade to up-regulate L-type Ca channels // Pfluegers Arch. 1996, 432,
P 174-181.

Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. Serotonin-induced changes in the activity of
single Ca2+ channels in Helix pomatia neurones. Neurophysiology (Kiev),
1996, 28, N2/3, 132-140.

Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. Characterization of single K+ channels in
Helix pomatia neurones. Neurophysiology (Kiev), 1996, 28, N6, 250-259.

Lukyanetz E.A. Evidence for colocalization of calcineurin and calcium
channels in dorsal root ganglion neurones. 1997, Neuroscience, 78, N3,
625-628.

Lukyanetz E.A. Development of view about the voltage-operated calcium
channels of membrane. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, N1, p.56-69.

Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. The investigation of modulating mechanism of
calcium and potassium channels by serotonine in Helix pomatia neurons.,
1997, Fiziologicheskii zhurnal, (Kiev) 44, N5/6, p.100-107.

Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. Pilocarpine-induced epileptoform activity
of isolated CA1 hippocampal neurones. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29,
N3, p.205-2

Lukyanetz E.A. Role of calcineurin in regulation of high
voltage-activated calcium channel activity. 1997, Neurophysiology
(Kiev), 29, No 6, 442-447.

Lukyanetz E.A. Calcium channel activity in NG108-15 cells overexpressing
protein phosphatase-2B. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, No4/5,
330-333.

Sotkis A.V., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. Diversity of single potassium
channels in isolated snail neurones. 1998, NeuroReport, 9, N 7
p.1413-1417.

Lukyanetz E.A. Diversity and properties of Ca channel types in NG108-15
cells. 1998, Neuroscience, Vol. 87, Issue 1, pp. 265-274.

Lukyanetz E.A., Piper T., Sihra T.S. Calcineurin involvement in the
regulation of high-threshold Ca2+ channels in NG108-15 (rodent
neuroblastoma x glioma hybrid) cells. 1998, J.Physiology, 510 (2), pp
371-385

Shkryl V.M., Lukyanetz E.A. Properties of oxygen-sensitive electrods
using in patch-clamp experiments on nerve cells. Neurophysiology, 1998,
30, 4/5, 279-283.

Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. Determination of the released
neurotransmitter type by using carbon fiber amperometry.
Neurophysiology, 1998, 30, 4/5, 284-287.

Konovalov A.A., Lukyanetz E.A. Activity of sodium voltage-operated
currents of cortical neurones during hypoxia. Neurophysiology, 1998, 30,
4/5, 312-315.

Lukyanetz E.A., Neher E. Different types of calcium channels and
secretion from bovine chromaffin cells. 1999. Eur.J.Neurosci., 11 (8)
2865-2873

Shkryl V.M, Nikolaenko L.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. High-threshold
calcium channel activity in rat hippocampal neurones during hypoxia.
Brain Res., 1999, 833/2, p. 319-328.

Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A. 1999, Investigation of pilocarpine action
on properties of accommodation in isolated phasic neurones of rat
hippocampus. Fiziol Zh. 45, 4, p.35-40.

Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A., Kostyuk P.G. Electrical properties of
tonic hippocampal neurones can underlie epileptogenesis in brain. 2000.
Fiziol Zh. 46(2), p.141-142.

Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2000. Influence of Li+ ions on properties
of accommodation in CA1 hippocampal neurones. Neurophysiology (Kiev). 32
(3), 256-258.

Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2000. Comparative
characteristics of secretory responses of chromaffin cells and
pheochromocytoma cells (PC12) during their activation by acetylcholine.
Neurophysiology (Kiev). 32 (3), 215-217.

Koval L.M., Yavorskaya E.N., Tokar S.L, Lukyanetz E.A. 2000.
Ultrastructural properties of steroid vesicles and mitochondria in
bovine adrenocortical cells. Neurophysiology (Kiev). 32 (3), 272-274.

Lukyanetz E.A. 2001. Intracellular events during depolarization-induced
exocytosis in chromaffin cells. In: Calcium Signalling, Morad M.,
Kostyuk P. eds. NATO Science Series, Series I: Life and Behavioural
Sciences. V.331, IOS Press Ohmsha, Amsterdam, The Netherlands. p.
174-182.

Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukyanetz E.A. 2001. Electron microscopic
evidence for multiple types of secretory vesicles in bovine chromaffin
cells. General. Compar. Endocrynol. 121, (3), 261-277.

Lukyanetz E.A.. Different secretory vesicles can be involved in
depolarization-evoked exocytosis. 2001. Biochem.Biophys.Res.Com. 288
(4), p.844-848.

Shkryl V.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A Dual action of cytosolic
calcium on calcium channel activity during hypoxia in hippocampal
neurones. 2001 NeuroRep, 12(18), p.4035-4039.

Zaika O.L., Pochynyuk O.M.? Lukyanetz E.A. 2001. Electrochemical studies
of induced secretion of catecholamines from single vesicles of rat
chromaffin cells. Ukr. Biochem J. Vol.73(4) pp.69-72

Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2001. The role of ca ions in frequency
accommodation in rat hippocampal neurons. Ukr. Biochem J. Vol.73(5)
pp.123-127.

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kostyuk P.G. Selective blocking of N-type
calcium channels by levetiracetam. 2002. Epilepsia. 43(1), p 9-18.

Lukyanetz E.A., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., 2002. Amperometric evidence
about participation of several types of vesicles in exocytosis from
chromaffin cells. J. Physiology (Paris), 96, p.147-148.

Lukyanetz E.A., Sotkis A.V., Kostyuk P.G. 2002. Mechanisms of
up-regulation of single calcium channels by serotonin in Helix pomatia
neurons. Biochem.Biophys.Res.Com. 2002 Apr 26;293(1):132-8.

Stanika R.I., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. 2002. Studies of action of
hypoxia on calcium homeostasis in sensory neurons of rats. Fiziol Zh.
48(2), p.15-16.

Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2002. Investigation of
calcium transients induced by acetylcholine in isolated chromaffin cells
of rat. Fiziol Zh., 48(2), p.5-6.

Koval L., Tokar S., Yavorskaya E., Lukyanetz E. (2002) Calcium-induced
ultrastructural interactions in adrenocorticocytes. Neurophysiology, 34,
No 2/3, 2002, p. 177-178.

Lukyanetz I., Yavorskaya E., Tokar S., Lukyanetz E. (2002). Role of
mitochondria and endoplasmic reticulum in calcium elevation during
Osmotic shock in adrenocortical cells. Neurophysiology, 34, No 2/3,
2002, p. 192-194.

Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E. (2002) The role of mitochondria in
generation of acetylcholine-induced calcium transients in rat chromaffin
cells. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 217-219.

Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E. (2002) Changes in the
ultrastructure of adrenocortical cells induced by cholinergic agonists.
Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 257-259.

Zaika O., Pochynyuk O., Lukyanetz E. (2002) Comparative studies of
calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells.
Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 270-272.

Lukyanetz E. (2002) Vesicular mechanisms of calcium-dependent
exocytosis of neurotransmitters. Архив клинической и экспериментальной
медицины, т. 11, № 1, 2002, с. 10-14.

Kostyuk P., Lukyanetz E., Shuba Y. (2002) Molecular physiology of the
calcium channels. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 117-120.

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M. Scientific and technological aspects of
oxygen-sensitive electrodes for measurements of oxygen partial pressure
in patch-clamp experiments. 2003, Biochem. Biophys. Methods. 55(1), p.
37-52.

Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Kostyuk P.G. 2003.
Intracellular mechanisms of hypoxia-induced calcium increase in rat
sensory neurons, Arch.Biochem.Biophys, 410(2), p.212-221.

Kostyuk P.G., Stanika R.I., Koval L.M., Lukyanetz E.A. 2003.
Intracellular calcium homeostasis of sensory neurons at hypoxic
influences. Fiziol. Zh.(Kiev) 49(3), p. 3-10.

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kravchuk O.V., Kostyuk P.G. Hypoxic effect
on calcium channels depends on extracellular calcium in hippocampal
neurons. 2003. Br. Res, 980(1), p.128-134.

Kostyuk P.G., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. 2003. Role of
nicotinic and muscarinic receptors in calcium signalling and
neurotransmitter release. 2003, Neurophysiology, 35, p.229-235.

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kravchuk O.V., Kostyuk P.G. 2003. Action of
hypoxia on different types of calcium channels in hippocampal neurones.
BBA, 1618/1 pp. 33-38.

Zaika O.L, Pochynyuk O.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. 2004.
Acetylcholine-induced calcium signalling in adrenaline and noradrenaline
containing adrenal chromaffin cells. ABB 424/1 pp. 23-32.

Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Kostyuk P.G.
2004. Studies of mechanisms of intracellular calcium oscillations caused
by hypoxia in chromaffin cells of rat. Clinical and experimental
pathology. 3(2/2), p. 94-96.

Tokar S.L., Koval L.M., Yavorska E.M., Lukyanetz E.A., Ultrastructural
characteristics of rat adrenal cortex cultured cells in the norm and
after calcium ionophore A23187 and adrenocorticotropic hormone
application. Fiziol Zh. 2004;50(2):105-10.

Ultrastructural characteristics of lipid droplets in rat adrenocortical
cells from zona fasciculata-reticularis. Fiziol Zh. 2004;50(6):107-13.

Kostyuk P.G., Stanika R.I., Lukyanetz E.A. 2004. Intracellular
mechanisms of hypoxic disorders in nerve cell function. In: Problems of
hypoxia: molecular, physiological and medical. Lukyanova L.D., Ushakov
I.B. Eds. Moskow, Voronezh. “Istoki”, p.84-95.

Bacova Z, Benicky J, Lukyanetz E, Lukyanetz I, Strbak V. Different
signaling pathways involved in glucose- and cell swelling-induced
insulin secretion by rat pancreatic islets in vitro. Cell Physiol
Biochem. 2005;16(1-3):59-68.

Kostyuk P.G., Veselovsky M.S., Kostyuk O.P., Kravchenko M.O., Lukyanetz
E.A., Moskalyuk A.O., Pochynyuk O.M., Fedulova S.A. 2005. Pathways of
regulation of synaptic transmission via effects on submicroscopic
structure synapses. In: “Fundamental guide of Sciences“, (Biology and
sciences about Earth and environmental) Academperiodyka” Kiev,
p.119-129.

Kostyuk P.G., Kostyuk E.P., Lukyanetz E.A. 2005 Calcium ions – from
physiology to pathology. Naukova Dumka, Kiev, pp. 197.

ВИБРАНІ ТЕЗИ ДОПОВІДЕЙ (2000-2005)

Lukyanetz E.A. Intracellular components of regulated exocytosis in
chromaffin cells. New Jersey, CRDF Meeting, USA 12-19 March, 2000.

Lukyanetz E.A. Intracellular events during regulated exocytosis in
chromaffin cells. NATO Workshop, Ca2+ Signaling and Cross-talk,
IlCiocco, Italy 26-30 April, 2000.

Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A., Kostyuk P.G. Electrical properties of
tonic hippocampal neurones can underlie epileptogenesis in brain. 2000.
Fiziol Zh. III National congress of Pathophysiologists, 24-27 May,
Odessa

Lukyanetz E.A. 2000. Ca-dependent exocytosis in neuroendocrine cells,
Autumn Workshop «Membranes and Signalling», Kiev, September 4-8, 2000.
(lecture, not published)

Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2000. Influence of Li+ ions on properties
of accommodation in CA1 hippocampal neurones. Neurophysiology (Kiev).
Autumn Workshop «Membranes and Signalling», Kiev, September 4-8, 2000.

Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2000. Comparative
characteristics of secretory responses of chromaffin cells and
pheochromocytoma cells (PC12) during their activation by acetylcholine.
Neurophysiology (Kiev). Autumn Workshop «Membranes and Signalling»,
Kiev, September 4-8.

Koval L.M., Yavorskaya E.N., Tokar S.L, Lukyanetz E.A. 2000.
Ultrastructural properties of steroid vesicles and mitochondria in
bovine adrenocortical cells. Neurophysiology (Kiev). Autumn Workshop
«Membranes and Signalling», Kiev, September 4-8, 2000.

Lukyanetz E.A., Pochynyuk O.M., Zaika O.L. 2000. Amperometric evidence
about participation of several types of vesicles in exocytosis from
chromaffin cells. Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc 2000,
Gif-sur-Yvette, France, December14-15 2000.

Lukyanetz E.A., Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Kostyuk P.G. 2000. Two
classes of vesicles participate in induced exocytosis from isolated rat
chromaffin cells. J. Physiol., Physiological Society Meeting, King’s
College London, UK, December 18-20.

Lukyanetz E.A. 2001. Intracellular mechanism of calcium-dependent
neurotransmitter release. Bogomoetz-Nencki Meeting, Sulejow, Poland,
2001, p. L4.

Lukyanetz E.A. Vesicular mechanisms of calcium-dependent exocytosis of
neurotransmitters II Conference of Ukrainian Society for Neurosciences
with international participation. Dedicated to 70-aniversary of
Physiology Dept. Donetsk State Medical University. Donetsk, 23-27 May
2001

Lukyanetz, EA, Pochynyuk, OM, Zaika OM. 2001. Evidence for participation
of different types of vesicles in stimulus-induced exocytosis in
chromaffin cells. XXXIV International Congress of Physiological
Sciences, New Zeland, August 26-31, 2001, IUPS .

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kostyuk P.G. Antiepileptic drug
levetiracetam selectively blocks N-type calcium channels isolated CA1
hippocampal neurons. 2001, Joint Meeting of American Epilepsy Society
and the American clinical Neurophysiology Society, Philadelphia,
Nov30-.Dec5.

Kostyuk P.G., Shkryl V.M., Lukyanetz E.A.. 2002. Analysis of
levetiracetam action on calcium channel subtypes of hippocampal neurons.
Europ. J. Neurol. 9, (Suppl.2), p. 175. 6th Congress of the European
Federation of Neurological Societies, Vienna, October 26-29, 2002

Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Kostyuk P.G..
2002. Molecular mechanisms of levetiracetam action on calcium channels
in ca1 hippocampal neurons. Europ. J. Neurol. 9, (Suppl.2), p. 178. 6th
Congress of the European Federation of Neurological Societies, Vienna,
October 26-29, 2002

Lukyanetz E.A. Vesicular mechanisms of calcium-dependent exocytosis of
neurotransmitters. 2002. Arch. Clin.Exper.Med. v.11(1), p.10-14. II
Conference of Ukrainian Society for Neurosciences. Donetsk.

Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E. Role of calcium ions in
ultrastructure changes evoked by adrenocorticotropic hormone in rat
adrenocortical cells. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium
“Intracellular Signalling in Excitable Cells”, Kiev, Ukraine, September
1-3, Abstract Book, p.17.

Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E. Comparative characteristics of time
course of secretion during different type of stimulation from rat
chromaffin cells. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium
“Intracellular Signalling in Excitable Cells”, Kiev, September 1-3, Abs.
Book, p.14.

Lukyanetz E., Stanika R., Shkryl V., Koval L., Kostyuk P.
Hypoxia-induced changes in neuronal activity: role of Ca2+ ions and
mitochondria. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium “Intracellular
Signalling in Excitable Cells”, Kiev, Ukraine, September 1-3, Abstract
Book, p. 11.

Lukyanetz E., Shkryl V., Kostyuk P. Role of external calcium ions in the
development of hypoxic response in hippocampal neurons. 2002, Intern.
Symp. “ASTROECO-2002”, Abstr Book, p.65.

Kostyuk P., Stanika R., Koval L., Lukyanetz E. Intracellular mechanisms
of hypoxia-induced changes in calcium homeostasis in neurons. 2002.
International Symposium “ASTROECO-2002”, Abstract Book, p.53.

Zaika O., Pochynyuk O., Lukyanetz E.A., Comparative studies of calcium
transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. 2002.
Neurophysiology, 34(2/3), p.270-272. International Summer Workshop
“Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System” June,
Kiev.

Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E.A., 2002,
Neurophysiology, 34(2/3), p.257-259. International Summer Workshop
“Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18
June, Kiev.

Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E.A., The role of mitochondria in
generation of acetylcholine-induced calcium transients in rat chromaffin
cells. 2002, Neurophysiology, 34(2/3), P.217-219. International Summer
Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”,
16-18 June, Kiev.

Lukyanets I., Yavorskaya E., Tokar S., Lukyanetz E. Role of mitochondria
and endoplasmic reticulum in calcium elevation during osmotic shock in
adrenocortical cells. 2002, Neurophysiology, 34(2/3), P.192-194.
International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in
the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

Koval L., Tokar S., Yavorskaya E., Lukyanetz E. Calcium-induced
interactions in adrenocorticocytes. 2002, Neurophysiology, 34(2/3),
P.177-178. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic
Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

Kostyuk P., Lukyanetz E., Shuba Y. 2002, Neurophysiology, 34, P.117-120.
International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in
the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

Tokar S., Lukyanets I.A., Yavorskaya E., Lukyanetz E.A., Changes of
intracellular calcium homeostasis evoked by steroidogenic factors. 2002,
Abstract Book , P.17. XVI Congress of Ukrainian Physiological Society.
28-30 May, Vinnitsya.

Stanika R., Kostyuk P., Lukyanetz E. Studies of hypoxic effect on
calcium homeostasis in sensory neurons of rats. 2002, Abstract Book ,
P.15. XVI Congress of Ukrainian Physiological Society. 28-30 May,
Vinnitsya.

Lukyanetz E.A. Ultrastructural mechanisms of steroidogenesis in
adrenocortical cells. 2002, Abstract Book, P.10. XVI Congress of
Ukrainian Physiological Society. 28-30 May, Vinnitsya.

Zaika O., Pochynyuk O., Lukyanetz E.A. Studies of calcium transients
induced by acetylcholine in isolated chromaffin cells. 2002, Abstract
Book , P.5-6, .XVI Congress of Ukrainian Physiological Society. 28-30
May, Vinnitsya.

Lukyanetz E.A., Koval L.M., Tokar S.L., Yavorskaya E.N. 2003.
Relationship between changes in cell volume and function during
steroidogenesis in adrenocortical cells. Abstract Book , P.51. The First
Multilateral Conference of the Physiologists from Central Europe., 5-8
February, Piestany, Slovak Republic.

Kostyuk P.G., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. 2003. Role of
nicotinic and muscarinic receptors in calcium signalling and
neurotransmitter release. 2003, Neurophysiology, 35(3/4), p.201-207.
Second International Symposium „Smooth muscle Physiology and
Biophysics“, Kiev, Ukraine

Kostyuk P.G., Kostyuk E.P., Pochynyuk O., Zaika O., Potapenko E.,
Lukyanetz E. 2003. Calcium signalling as the main factor in synaptic
transmission – special role of mitochondria. Abstract Book, p.30-34.
International Scientific Conference of Serbian Physiological Society
“Risk factors and health: from molecule to the scientific basis of
prevention” 7-9 Nov. Belgrade, Serbia.

Kostyuk P.G., Shkryl V.M., Lukyanetz E.A. Selective blocking of N-type
calcium channels of hippocampal neurons by antiepileptic drug
levetiracetam. 2003. Proceedings of the 29th Gottingen Neurobiology
Conference and the 5th Meeting of the German Neuroscience Society.
P.294.

Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Kravchuk
O.V., Kostyuk P.G. Hypoxia-induced increase of intracellular calcium
concentration in DRG neurons. 2003. Proceedings of the 29th Gottingen
Neurobiology Conference and the 5th Meeting of the German Neuroscience
Society. P.294.

Lukyanetz E.A. 2004. Morphological studies of synaptic proteins in
vesicular trafficking in chromaffin cells. INTAS Summer Meeting “Control
of vesicular trafficking by synaptic proteins neuronal and
neuroendocrine cells”, 30th June, Kiev..

Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A., Klitgaard H., Margineaanu D-G. Usb 34714
(brivaracetam), a new Pyrrolidone derivate without impact on high-or
low-voltage-activated calcium currents in rat isolated neurons. 2004.
Epilepsia, v.45, Suppl.7, p.141. Annual Meeting of the American Epilepsy
Society, Dec 3-7, New Orlean, USA.

Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. Variation of spike generation in isolated
hippocampal neurons. 2004. Abstract Book, P.54. IBRO Advanced School of
Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea.

Tokar S., Koval L. Yavorskaya E., Lukyanetz E. Features of lipid droplet
ultrastructure in rat adrenocortical cells and mechanisms of its
regulation. IBRO Advanced School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta,
Crimea. Abstract Book, P.50.

Lukyanets I.A., Lukyanetz E.A. 2004. Changes in cell volume induces a
growth of intracellular calcium in adrenocortical cells. IBRO Advanced
School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea. Abstract Book, P.25.

Bacova Z., Benicky J., Lukyanetz E.A., Lukyanets I. Strbak V. 2004.
Different signalling pathways for glucose and hypoosmotic induced
insulin secretion: role of Ca2+ and protein kinase C. IBRO Advanced
School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea. Abstract Book, P.2.

Lukyanetz E.A., Shkryl V., Stanika R., Koval L., Yavorskaya E. 2004.
Influence of hypoxia on Ca2+ homeostasis in nerve and endocrine cells.
IBRO Advanced School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea.
Abstract Book, L.14.

Lukyanetz E.A., Pochynyuk O., Zaika O., Koval L., Yavorskaya E., Kostyuk
P. Ca2+-dependent release of neurotransmitters in neurosecretory cells.
IBRO Advanced School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea.
Abstract Book, L13.

Lukyanetz E.A., Stanika P.I., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Kostyuk P.G.
2004. Studies of mechanisms of oscillations in the level of
intracellular calcium indiced by hypoxia in chromaffin cells. IV
National Congres of Pathophysiologists of Ukraine with International
participation. 26-28 May Chernivtsi, Ukraine. Clin.Exp.Pathol. v.3(1),
p. 98-100.

Stanika R.I., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. 2004. Cellular mechanisms of
changes in calcium concentration in sensory neurons of rats under
hypoxic influence. Conference of Young Scientists from Bogomoletz
Institute of Physiology “Perspective trends in studies of Modern
Physiology”, Kiev. Neurophysiology v.36(1) p.89.

Lukyanetz E.A., Pochynyuk O., Zaika O., Koval L., Yavorskaya E., Kostyuk
P. 2004. Role of intracellular calcium storing organells and calcium
signalling in neurotransmitter release from adrenal chromaffin cells.
First (Inaugural) Congress of Ukrainian Society of Cell Biology. 25-28
April, Lviv. Abstract Book, p.302.

Lukyanetz E.A., Shkryl V., Kravchuk O., Kostyuk P.G. Calcium mechanisms
of excitable cell regulation. 2004. 9-14 February, Tysovets, Ukraine.

Lukyanetz EA., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Koval L.M., Yavorskaya E.N.,
Kostyuk P.G.2004. Difference in neurotransmitter release induced by
calcium channel and acetylcholine receptor activation in adrenal
chromaffin cells. in “Conferences en Neurobiologie Ladislav Tauc “The
world of the synapse: molecular basis, pathology and drug discovery”
J.Physiol. (Paris). P32.

Kostyuk P.G. Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz EA., 2004.
Particularities of calcium signalling and its role in neurotransmitter
release from adrenal chromaffin cells. in “Conferences en Neurobiologie
Ladislav Tauc “The world of the synapse: molecular basis, pathology and
drug discovery” J. Physiol. (Paris).P.15.

Lukyanetz E.A. 2005. Studies of vesicular trafficking in exocytosis
process, joint investigations with German and English scientists. In:
Scientific Conference “International collaboration – in the name of
peace and development”, 10 Nov., Kiev.

Lukyanetz E.A. 2005. Role of intracellular Ca2+ in neurotransmitter
release in neuroendocrinne cells. I Congress of NIS Physiologists. 19-23
Sept., Sochy, Dagomys, Russia. In: Scientific Proceedings of I Congress
of NIS Physiologists. V.1, p.101.

АНОТАЦІЇ

Лук’янець О.О. Роль кальцієвих каналів у функціонуванні нервових та
нейроендокринних клітин в нормі та патології. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Інститут фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню ролі Ca2+ каналів у функціонуванні
нервових та нейроендокринних клітин в нормі та патології. У роботі були
досліджені біофізичні та фармакологічні властивості Ca2+
потенціалозалежних каналів їх експресія в процесі клітинної
диференціації. Особлива увага була приділена особливостям регуляції Ca2+
каналів шляхом їх фосфорилування та дефосфорилування. З одного боку,
було досліджено механізм збільшення Ca2+ макроструму викликаного
фосфорилуванням каналів. З іншого — вивчення дефосфорилування Ca2+
каналів за участю Ca2+-залежної протеїнфосфатази кальцинейрину (РР2В)
показало, значне пригнічення їх функції Ca2+-залежним дефосфорилуванням.
Дослідження ролі Ca2+ каналів в регуляції процесу вивільнення
нейротрансмітерів (екзоцитозі) показало, що екзоцитоз не залежить від
типу Ca2+ каналів через який Ca2+ входить в клітину і визначається
загальною кількістю Ca2+ що входить і від базального [Ca2+]i передуючому
стимулу. Був запропонований везикулярний механізм, що описує
експериментальну двоступеневу залежність екзоцитозу від [Ca2+]i.
Експерименти присвячені ролі Ca2+ каналів в розвитку паталогічних станів
ЦНС – гіпоксії/ішемії та епілепсії на модельних системах нейронів щурів
показали, що гіпоксія викликає істотне підвищення [Ca2+]i. Отримані дані
дозволяють припустити, що Ca2+ канали можуть бути початковими
структурами чутливими до гіпоксичної дії, зміни активності яких вторинно
викликають інші порушення. Наші дослідження ролі Ca2+ каналів в розвитку
епілепсії шляхом вивчення механізмів дії відомого анти-епілептичного
препарату левотерацитаму (LEV) показали, що LEV селективно та не
зворотно пригнічував HVA Ca2+ струм N-типу, та дозволили припустити
існування підтипу N-типів Ca2+ каналів, чутливих до LEV, які можуть бути
залучені в молекулярну основу його антиепілептичноі дії. Зроблено
висновок, що Ca2+ канали відіграють суттєву роль в фуекціюванні нервових
та нейроендокринних клітин в нормі та патології.

Ключові слова: амперометрія, дефосфорилування, гіпоксія, епілепсія,
екзацитоз, кальцієві канали, кальцієва сигналізація, кальцинейрин,
секреторні везикули, трансфекція, фосфорилування.

Лукьянец Е.А. Роль кальциевых каналов в функционировании нервных и
нейроендокринних клеток в норме и патологии. – Рукопись.

Диссертация на снискание научной степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.02 – биофизика. Институт физиологии им.
А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвященна исследованию роли Ca2+ каналов в
функционировании нервных и нейроендокринных клеток в норме и патологии.
В работе были исследованы биофизические и фармакологические свойства
потенциалозависимых Ca2+ каналов и их экспрессия в процессе клеточной
дифференциации. Особое внимание было уделено особенностям регуляции Ca2+
каналов путем их фосфорилирования и дефосфорилирования. С одной стороны,
был исследован механизм увеличения Ca2+ макротока вызванного
фосфорилированием каналов. С другой стороны, исследование
дефосфорилирования Ca2+ каналов при участии Ca2+-зависимой
протеинфосфатазы кальцинейрина (РР2В) показало, что активность PP2B не
влияет на экспрессию высокоророговых (HVA) Ca2+ каналов, но значительно
подавляет их функцию. Исследование роли Ca2+ каналов в регуляции
процесса высвобождения нейротрансмиттеров (екзоцитоза) показало, что не
важно, через какой тип Ca2+ каналов Ca2+ входит в клетку, и что
экзоцитоз определяется общим количеством Ca2+ который поступает в клетку
и базального [Ca2+]i предшествующего стимулу. Был предложен везикулярний
механизм, описывающий экспериментальную двухступенчатую зависимость
екзоцитоза от [Ca2+]i. Значительная часть работы была посвящена роли
Ca2+ каналов в механизмах патологичных состояний ЦНС – гипоксии/ишемии и
эпилепсии на модельных системах нейронов крыс. Мы установили, что
гипоксия вызывала существенное повышение [Ca2+]i. Полученные данные
позволяют допустить, что Ca2+ каналы могут быть первичными структурами
для гипоксического действия на нейроны, изменения активности которых
вторично вызывают нарушение других функций. Наши исследования роли Ca2+
каналов в развитии эпилепсии путем изучения механизмов действия
антиэпилептического препарата леветерацитама (LEV), показали, что LEV
селективно и необратимо подавлял Сa2+ ток N-типа и позволили
предположить существование подтипа этих каналов, чувствительных к LEV,
которые могут быть вовлечены в молекулярную основу его
антиепилептического действия. Сделан вывод, что Ca2+ каналы играют
существенную роль в функциювании нервных и нейроендокринных клеток в
норме и патологии.

Ключевые слова: амперометрия, дефосфорилирование, гипоксия, эпилепсия,
екзацитоз, кальциевые каналы, кальциевая сигнализация, кальцинейрин,
секреторные везикулы, трансфекция, фосфорилирование.

Lukyanetz E.A. Role of calcium channels in function of neuronal and
neuroendocrine cells in norm and pathology. – Manuscript. Dissertation
for doctor of sciences degree by speciality 03.00.02 – biophysics. A.A.
Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kiev, 2005.

Dissertation is devoted to researches the role of calcium channels in
functioning of nervous and neuroendocrinne cells in norm and pathology.
In this studies the biophysical and pharmacological properties of
voltage-operated calcium channels and their expression in the process of
cellular differentiation were explored. The special attention was spared
to the features of the Ca2+ channel regulation by their
phosphorylation-dephosphorylation. From the one side, a mechanism of
increase of Ca2+ macrocurrent caused by phosphorylation of channels was
explored. It appeared that this increase of Ca2+ macrocurrent is
determined by the changes in kinetics, increase of number of active
channels and increase of staying of single channels in the opened state.
At the same time, no changes in conductivity of the single Ca2+ channels
were observed. The study of dephosphorylation of Ca2+ channels with
possible participation of Ca2+-dependent protein phosphatase calcineurin
(PP2B) showed a colocalization of PP2B and calcium channels in a
cellular membrane of DRG neurons. The PP2B overexpression in the
NG108-15 cells was achieved by means of transfection with plazmid
containing cDNA of human PP2B. It appeared that in such transfectants
the PP2B activity does not affect expression of the high-voltage
activated (HVA) Ca2+ channels, but considerably supress their function
by means of Ca2+-dependent dephosphorylation and that PP2B operates
mainly N-type Ca2+ channels in these cells. Exploration the role of Ca2+
channels in regulation of neurotransmitter release (exocytosis) showed
that for prolong stimuli which liberate a part of the readily releasable
pool of vesicles, it is not so important through which type of channels
Ca2+ enters the cell. Release is rather determined by the total amount
of Ca2+ entering and by the filling state of the pool, which depends on
basal [Ca2+]i before the stimulus. We established that
depolarization-induced exocytosis passed over two steps both of which
linearly depend on [Ca2+]i. At [Ca2+]i lying below critical point (200 ?
300 nM) the slope of the relationship was 4.43 and at [Ca2+]i exceeding
the critical point the slope was equal to 31.63. The vesicular mechanism
describing experimental two-step dependence of exocytosis on
intracellular Ca2+ is proposed. According to the model at [Ca2+]i below
critical point only small sized vesicles fuse with plasma membrane
whereas at higher Cai, larger vesicles started to fuse. Considerable
part of work was devoted to the role of the Ca2+ channels in development
and passing of series of pathological states CNS – hypoxia/ischemia and
epilepsy on the model systems of neurons of rats. We established that
hypoxia has caused a substantial rise of the intracellular Ca2+ level
already after a few seconds after the beginning of its action. Our
finding allow to assume that the voltage-operated calcium channels of
plasma membrane can be the initial structures for hypoxic action on the
explored neurons, the changes of activity of which induce the secondary
violation of function of ionexchanging machineries of plasma membrane.
Using the whole-cell patch-clamp and measuring of partial oxygen
pressure methods, we established that moderate hypoxia rendered double
action on the Ca2+ channels: intracellular-mediated increase of calcium
entrance through the Ca2+ channels and their Ca2+-dependent
inactivation. At the same time, we established a dependence of hypoxic
effect on concentration of external Ca2+ and found out a saturation of
hypoxic effect. We assumed that the hypoxic effect can be related to
growth of channel conductivity, and the level of Ca2+ channel
conductivity at normoxia can determine the value of hypoxic effect.
Selective blokers of HVA Ca2+ channels were used for studies of
sensitivity of HVA Ca2+ channels subtypes in the CA1 hippocampal neurons
of rats to the O2 shortage in environment. We established that both
types of the HVA Ca2+ channels are sensible to hypoxia, however L-type
was approximately in 3.5 times more sensitive to the decline of the O2
level. Our investigations of the role of Ca2+ channels in development of
other pathological state of CNS – epilepsy, we conducted by studies of
action mechanism of known antiepileptic substance of leveteracetam
(LEV). Our researches showed that LEV selectively and not reversible
suppressed the N-type HVA calcium current. In addition, our data allowed
to assume an existence of subtype of the N-type Ca2+ channels sensitive
to LEV, which can be engaged in the molecular basis of its antiepileptic
action. We concluded, that Ca2+ channels play a substantial role in
functioning of nervous and neuroendocrinne cells in norm and pathology.

Key words: amperometry, dephosphorylation, hypoxia, epilepsy,
exocytosis, calcium channels, calcium signalling, calcineurin, secretory
vesicles, transfection, phosphorylation.

PAGE \* Arabic 40

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *